KR100417633B1 - 고추 한별품종으로부터 분리한 식물병 방어 관련 스텔라시아닌 유전자 및 이를 이용한 식물체의 저항성 반응 판별방법 - Google Patents

고추 한별품종으로부터 분리한 식물병 방어 관련 스텔라시아닌 유전자 및 이를 이용한 식물체의 저항성 반응 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균 및 외부 환경의 스트레스에 의한 식물체의 저항성반응 여부 판별과 저항성 작물의 육종에 분자유전학적으로 이용될 수 있는 스텔라시아닌 유전자에 관한 것으로, 고추세균성점무늬병(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 대해 저항성을 보이는 한별 품종으로부터 스텔라시아닌 유전자를 분리하는 한편, 식물병원균, 방어관련 유전자 유도체로 알려진 화합물 및 여러 가지 외부환경 스트레스에 의한 스텔라시아닌 유전자의 발현조절 기작을 조사함으로써 식물체의 병원균에 대한 저항성반응의 표지 및 식물병저항성 분자육종을 위한 유전재료로 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

고추 한별품종으로부터 분리한 식물병방어관련 스텔라시아닌 유전자 및 이를 이용한 식물체의 저항성반응 판별방법{Defense-related stellacyanin gene isolated from Capsicum annuum L. cv. Hanbyul and the use of the pepper stellacyanin gene for the detection of plant resistance reactions}
본 발명은 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종의 고추식물에서 클로닝한 스텔라시아닌 유전자 및 이를 이용한 고추식물에서의 병발생과 상처에 따른 국부적 전신적 방어반응 및 환경스트레스의 일종인 건조와 염류에 대한 반응을 검색하기 위한 방법에 관한 것이다.
작물 생산에 있어 병해충의 발생에 따른 생산량의 감소는 일찍이 기록되어져 왔다. 병해충에 의한 감수를 줄이려는 노력의 일환으로 병저항성 작물의 육성 프로그램들이 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 진행되어져 왔으며, 병저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병저항성 식물에서의 저항성 기작의 연구가 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어져 왔다. 집중적으로 연구가 되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표 사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다. 담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리 나라에서 오랜동안 향신료, 양념 등으로 사용되어져 벼, 배추와 함께 우리 나라 국민의 식단을 이루는 주된 작물 중에 하나임이 분명하다. 고추 재배 중에 보고된 우리나라에서의 병발생은 바이러스병, 세균병, 및 진균 병에 대해 나타나 있으며, 고추식물에서 주요한 병으로 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병, 세균에 의한 세균성점무늬병 등이 보고되어져 왔다. 이런 현실에도 고추식물의 병저항성 기작을 포함한 방어반응 및 환경 적인 스트레스에 대한 반응에 대한 연구는 미비한 실정이다.
식물의 병발생에 대한 방어반응으로 건전한 식물에서는 미량으로 존재하거나 발견되지 않는 단백질들이 병감염시 특이적으로 증가되거나 나타난다. 이를 병생성관련단백질 (pathogenesis-related protein)이라 부르는데, 고추식물에서 역병 또는 세균성점무늬병의 발생시 다양한 종류의 병생성관련단백질이 관찰되었으며, 이들 단백질의 역할은 아직까지 정확히 규명되지 않았지만, 그들의 전형적인 특징은 식물 병에 대한 방어반응이 저항성 반응과 감수성 반응에서 차별적이다. 저항성 반응에서 이들 병생성관련단백질들은 감수성 반응시의 발현과 축적 정도에 비해 발현시간이 이르고 축적정도가 강하다고 보고되어 왔다. 스텔라시아닌도 이의 결과와 비슷하게 발현양상을 보였고, 고추식물의 어떤 조직에도 존재하지 않았다가, 병원균의 침입 시에 강하게 유도된다는 사실은 스텔라시아닌이 식물의 병원균에 대한 방어 반응에 중요한 역할을 하리라 생각을 뒷받침하였다.
다른 식물들에서 많은 스텔라시아닌 유전자들이 발견되고 분리되었는데, 이들의 발현에 대한 연구는 미미하다. 그러나 이 유전자는 고추 외의 다른 작물에 도입하여 병원균의 침입에 대해 증가된 저항성을 부여하는 방법으로 병저항성작물의 분자육종 기술에서 이용될 수 있는 주요한 유전자일 가능성이 높다.
즉, 본 발명의 목적은 식물의 병방어반응을 보여줄 수 있는 스텔라시아닌 유전자를 분리하여 분자적 수준에서 고추식물의 방어반응을 이해하고, 이를 이용한 앞으로의 고추분자육종 프로그램에서의 활용의 가능성을 제시한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 고추세균성점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별품종에서 분리한 스텔라시아닌 유전자 및 유전자에 코딩된 아미노산 서열을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 스텔라시아닌 유전자를 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 스텔라시아닌 유전자를 이용하여 식물병원균, 병 발생관련 유전자 유도체로 알려진 화합물 및 기계적 상처, 건조, 염류와 같은 여러가지 외부환경 스트레스에서 고추식물의 병저항성 유도물질의 탐색방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 고추 한별 품종(Capsicum annuiuuml. cv. Hanbyul)에 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하여 감염시킨 고추잎으로부터 mRNA를 분리한 다음 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하고 이를 공지된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 cDNA 라이브러리를 제조한 후 이를 스크리닝하여 스텔라시아닌 유전자를 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 세균성 병원균, 진균성 병원균, 비생물적 유도체인 메틸 자스모네이트 및 기계적 상처, 건조, 염류 등의 환경적인 스트레스에 의한 스테라시아닌 유전자의 유도 및 발현정도를 노던블러팅을 실시하여 조사함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
도 1은 고추세균성점무늬병저항성 품종 한별 고추(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)로부터 클로닝한 스텔라시아닌 유전자의 염기서열과 이에 유추한 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 고추세균성점무늬병저항성 품종 한별 고추(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)의 스텔라시아닌 유전자를 삽입시켜 구축한 벡터를 도시한 모식도이다.
도 3은 고추세균성점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 고추탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 코코데스의 균주 2-25를 고추식물의 잎에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 줄기에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이다
도 6은 고추 열매에 탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스를 고추식물의 푸른 열매와 붉은 열매에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 에틸렌, 메틸 자스모네이트, DL-β-아미노부티르산, 비티에이치, 살리실 산에 의한 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 메틸 자스모네이트를 처리한 후 시간과 농도에 따른 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 암처리와 광처리를 비병원성균과 조합하여 처리한 후 시간에 따른 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 고추세균성점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주와 고추 잎에 병을 일으키지 못하는 슈도모나스 플로레슨스를 고추식물의 아래 잎에 접종했을 때 접종하지 않은 윗잎에서의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 인위적인 상처를 고추 아랫잎에 처리했을 때 상처 잎은 아랫잎과 건전한 윗잎에서 발현되는 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 염화나트륨을 고추식물에 처리한 후 잎과 줄기에서 발현되는 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 고추식물을 건조시킨 잎과 줄기에서 발현되는 스텔라시아닌 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 비병원성의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoriastrain BV5-4a )을 접종하고 감염되어 과민성 반응을 보인 고추 잎의 RNA를 추출하고 그로부터 mRNA를 분리한 후 이를 주형으로 하여 cDNA라이브러리를 제작하는 한편 고추 세균성 점무늬병을 접종한 잎에서 얻은 single strand cDNA probe 디옥시제닌으로 표지하고 스크리닝 하는 단계; 상기 스크리닝 과정을 통해 얻은 클론의 염기서열을 결정하고 상기 유전자가 도입된 형질전환체Escherichia coliCASLP 1을 제조하는 단계; 고추세균성점무늬병균, 고추탄저병균, 고추역병균, 고추열매탄저병균등의 식물병원균에 의한 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현을 노던 블럿팅을 실시하여 확인하는 단계; 고추식물체에서 어떠한 신호전달경로를 통해 스텔라시아닌 유전자가 유도발현되는지 알기 위하여 병발생관련유전자의 유도체로 알려진 메틸자스모네이트 처리에 따른 스텔라시아닌 유전자의 유도발현을 조사하는 단계; 광조건과 암조건에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현을 조사하는 단계; 고추세균성점무늬병균에 의한 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 국부적, 전신적 유도발현을 측정하는 단계; 작물재비시 기계적 상처와 염류, 건조등의 환경스트레스에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현을 측정하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 고추 한별 품종(Capsicum annuum cv. Hanbyul)으로부터 스텔라시아닌유전자 분리, 염기서열 결정 및 상기 유전자가 도입된 형질전환체의 제조
한국산 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 병원성이 약한 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실처리한 결과 세균성 점무늬병균에 감염되어 저항성 병반인 과민성 반응을 보인 고추 잎의 순화된 총 mRNA (total RNA)와 병균에 감염되지 않은 건전한 잎의 mRNA를 oligo-dT 셀룰로오즈 크로마토그라피를 사용하여 분리하고 이 mRNA를 Stratagene에서 제공하는 λZAPII-cDNA 합성 kit를 사용하여 cDNA를 합성하고 Amersham에서 제공하는 in vitro packaging module를 사용하여 cDNA library를 만든 후 증폭시켜 사용하였다. 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종한 잎에서 얻은 싱글 스트랜드 (single strand) cDNA probe 디옥시제닌 (digoxygenin)으로 표지하여 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리를 디퍼런셜 하이브리다이제이션 기술을 이용하여 스크리닝하였다. 수많은 클론의 염기서열을 결정하여 스크리닝을 통해 얻은 클론의 염기서열을 결정하고, 블라스트(blast) 프로그램을 사용하여 분석한 결과 스텔라시아닌을 만들어내는 유전자임을 확인하였다. 스텔라시아닌 유전자의 염기서열은 도 1에 나타낸 바와 같이 937bp이며, 상기 염기서열로부터 유추한 아미노산 서열을 다른 작물에서 발견된 스텔라시아닌 아미노산 서열과 비교한 결과, 오이, 옥수수, 콩의 스텔라시아닌 아미노산서열과 중심부위는 상당히 높은 상동성을 나타내었으나 전체적으로는 49, 37, 34 퍼센트의 낮은 상동성을 나타내었다. 즉, 상기와 같이 클로닝된 한별 품종의 스텔라시아닌 유전자는 다른 식물체에 존재하는 기존에 보고된 스텔라시아닌 유전자와는 구별되는 신규의 유전자임을 알 수 있을 뿐 아니라, 고추 식물체에서는 최초로 분리된 스텔라시아닌 유전자임을 알 수 있다.
상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pCASLP 1의 모식도는 도 2에 나타낸 바와 같으며, 상기 재조합 벡터가 도입된 균주를Escherichia coliCASLP1이라 명명하고 2001년 3월 20일자로 한국종균협회에 기탁하였다(KFCC 11275).
실시예 2 : 식물병원균에 의한 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
병원균의 감염에 대해 식물체가 발현하는 병발생관련유전자의 축적 및 이 유전자들에 의한 단백질의 축적은 병발생과정 동안의 방어반응들 중 뚜렷한 현상이다. 이 병발생관련유전자들 중 스텔라시아닌 유전자의 유도, 발현은 국부저항성(local resistance) 및 전신획득저항성(systemic acquired resistance)을 나타내어 줄 수 있는 분자적 표지로 볼 수 있다.
하기 실험예에서는 식물병원균이 감염되었을 때 고추식물의 잎, 줄기, 열매 조직에서 각각 스텔라시아닌 유전자가 유도 발현됨을 확인하기 위하여 고추세균성점무늬병균, 고추탄저병균, 고추역병균, 고추열매탄저병균 감염에 의한 스텔라시아니 유전자 발현을 확인하였다.
실험예 1: 고추세균성점무늬병에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
고추세균성점무늬병균을 접종하기 위해 병원성균주 Ds1과 비병성균주 Bv5-4a를 배양하여 5×108cfu/ml의 농도로 1분지기 고추식물의 잎의 뒷면에 인필트레이션하여 접종한 후 18시간동안 습실처리를 하였다. 접종후 6, 12, 18, 24, 30 시간 후에 잎을 채취하여 이로부터 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다. 유도발현을 위한 모든 실험은 노던블러팅을 통하여 이루어졌으며, 이때 사용된 프로브는 분리된 클론을 스텔라시아닌 유전자의 염기서열의 상동성이 높은 특정 서열부분의 앞과 뒤를 프라이머로 제작하여, PCR을 수행하여 삽입 DNA만을 회수하여 γ-32P로 표지하고 이를 반응액(1 mM EDTA, 7 % SDS, 0.25 M Na2HPO4, 5 % dextran sulfate)에 첨가하고, 상기 준비된 프로브를 65 ℃에서 하룻밤동안에 하이브리다이제이션을 수행하였다.
도 3은 고추세균성점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이며 감수성 반응과 저항성반응은 각각 병원성균주와 비병원성균주로 접종된 것을 나타내며, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
분석결과, 고추세균성점무늬병의 감염시 병원성 균의 감염에 의한 고추식물의 감수성반응과정 중에 스텔라시아닌 유전자는 접종후 12 시간에 처음으로 유도되었으며 18 시간에 증가했다가 점차 감소하는 경향을 보였다. 이에 반해 비병원성균의 감염에 의한 고추식물의 저항성반응과정 중에 이 유전자는 접종후 6 시간에 낮은 수준의 발현이 검색되었으며 과민성 반응이 나타나는 18 시간 이후 그 증가는 급격히 늘어났다.
실험예 2: 고추 탄저병에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
고추탄저병균을 접종하기 위해 2-25 균주를 7일정도 배양한 후, 물을 첨가한 현탁액을 거즈에 거른 후, 106분생포자/ ml의 농도로 4, 8 엽기 고추식물의 잎에 스프레이를 이용하여 접종한 후 36 시간동안 습실처리를 하였다. 이 후, 12, 24, 36, 48, 72 시간 후에 잎을 채취하여 이로부터 RNA를 분리한 후 노던블러팅을 실시하였다. 도 4는 고추탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 코코데스 균주 2-25를 4, 8 엽기 고추식물에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이며, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
고추 탄저병의 감염시 4 엽기 어린 식물에서는 12 시간에서 72 까지 점진적으로 발현이 강하게 증가되었으나, 8 엽기 고추식물의 잎에서는 48 시간까지 낮은 수준을 유지하다가 72 시간에 갑자기 증가하였다. 고추 역병의 감염시 병원성 균에 의해서는 접종후 24시간에 발현되어 36시간째는 증가를 보이다가 48시간째부터는 발현이 감소하였다. 이에 반해 비병원성균에 의한 저항성반응과정에서는 이 스텔라시아닌 유전자가 접종후 24시간에 나타난 후 48시간째는 감수성반응에서의 발현보다 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 고추역병에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
고추역병균을 접종하기 위해 병원성 균주 S197과 비병원성균주 CBS178.26를 배양한 후 3일간 광처리하여 유주자낭을 형성시킨 후 물을 부어 4℃에서 1 시간동안 처리하고 상온에서 시간동안 배양하여 유주자가 유주낭으로부터 유출되도록 하였다. 105유주자/ml의 농도로 유주자 현탁액을 준비하고 이를 살균된 솜에 적셔 이를 상처를 낸 6 엽기 고추식물의 줄기에 감고 셀로판테이프를 감아 습한 상태를 유지시켜 주었다. 접종후 12, 24, 36, 48 시간에 접종된 고추 줄기를 채취하여 상기한 방법대로 RNA를 추출하고 노던블러팅을 수행하였다. 도 5는 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 줄기에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이며 감수성 반응과 저항성반응은 각각 병원성균주와 비병원성균주로 접종된 것을 나타내며, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
실험예 4: 고추열매탄저병에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
고추열매탄저병을 접종하기 위해 균주 CHC2를 5일 동안 배양하여, 물을 첨가한 현탁액을 거즈에 거른 후, 106분생포자/ ml의 농도로 0.05% 트윈 20용액과 혼합하여 얻은 현탁액 40 μl로 고추의 푸른 열매와 붉은 열매 위에 방울로 떨어뜨려 접종을 하였다. 상대습도 100%를 유지시키기 위해, 젖은 종이 타월을 깐 플라스틱 박스 위에서 수행되었다. 도 6은 고추 푸른 열매에 탄저병을 일으키는 균주 CHC2를고추의 푸른 열매와 붉은 열매에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이며, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
고추열매탄저병균의 감염시 미성숙 푸른 열매에서는 24시간에 강하게 처음으로 유도가 관찰되었다가 72시간까지 점차적으로 감소하였다. 이에 반해 숙성한 붉은 열매에서는 12시간에 약하게 처음 발현을 보이고 이와 비슷한 수준으로 72시간까지 지속되었다.
이상, 고추세균성점무늬병균, 고추탄저병균, 고추역병균, 고추열매탄저병이 감염되었을 때 고추식물의 잎, 줄기, 열매 조직에서 각각 스텔라시아닌 유전자가 유도 발현된다. 또한 각각의 병원균의 감염시 비병원성균과 병원성 균에 대해 스텔라시아닌 유전자의 발현은 차별적으로 나타난다는 것을 알 수 있다.
실시예 3 : 식물체의 비생물적 유도체에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
고추식물체에서 어떠한 신호전달경로를 통해 스텔라시아닌 유전자가 유도 발현되는지를 확인하기 위하여 다른 식물체에서 병발생관련유전자의 유도체로 알려진 여러 가지 화학물질들을 고추식물체에 외부적으로 처리하여 24 시간후 노던블러팅을 실시하였다.
메틸자스모네이트를 처리한 후 농도, 시간별로 스텔라시아닌 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 농도, 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하였다. 처리후 18 시간 후에 처음으로 나타나고, 24 시간에 강하게 발현이 증가되었다. 농도에 따라서도 점진적으로 증가해서 최고농도인 100 μM에서 가장 강하게 나타남을 알 수 있었다.
6 엽기의 고추식물을 준비하여 각각의 비생물적 유도체들을 엽면살포방법으로 처리하여 주었다. 100 μl/L 에틸렌, 50 μM 메틸자스모네이트. 2,000 μg/ml DL-β-아미노부티르산, 20 μg/ml 비티에이치, 5 mM 살리실산을 고추식물 잎에 처리하여 주었다. 에틸렌과 메틸 자스모네이트를 처리한 후에는 비닐 봉지를 씌워주었다. 도 7은 각각의 화학물질을 처리해준후 24 시간 후에 고추식물의 잎을 채취한후 이로부터 RNA를 분리하여 노던블러팅에 활용하여 얻은 결과이고, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
도 8은 메틸자스모네이트을 처리해준 고추식물의 경우에 처리후 2, 6, 12, 18, 24 시간으로 시간대 시료와, 0.1, 1, 10, 50, 100 μM 메틸자스모네이트처리로 얻은 시료, 즉 둘의 시료로부터 RNA를 분리하여 노던블러팅에 활용하였다. 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
그 결과, 고추의 스텔라시아닌 유전자는 메틸자스모네이트에 의해 가장 많이 발현이 유도된다는 것을 확인하였다. 비티에이치와 살리실산은 상대적으로 낮은 수준의 발현을 유도하였으며, 그 밖의 처리가 시도된 화학물질인 DL-β-아미노부티르산, 에틸렌에 대해서는 고추 스텔라시아닌 유전자의 유도 발현이 되지 않음을 확인하였다.
실시예 4 : 광, 암처리에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도 발현
식물재배의 필수 요소인 광이 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현에 미치는 영향을 노던블러팅을 통하여 관찰하였다.
실험결과 도 9에 나타낸 바와 같이 고추 식물을 암처리한 결과 표지된 어떤 시간에서도 이 유전자가 발현되지 않았으나, 저항성반응을 나타내는 비병원성 균주와 광, 암을 조합하여 처리한 결과 모두 발현이 되었고, 암처리와 조합되었을 때 더 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.
6엽기의 고추식물을 24, 48, 72 시간동안 암조건에서 배양하였다. 저항성반응을 보이는 비병원성균주 Bv5-4a를 잎에 접종한 식물을 암조건에서 24 시간 놓아두었고, 동일 균을 접종한 식물을 24 시간동안 광조건에 식물을 두었다. 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
실시예 5 : 고추세균성점무늬병원균에 의한 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 국부적, 전신적 유도 발현
식물의 자체 방어시스템으로 알려진 효율적인 방어 반응인 전신획득저항성을 스텔라시아닌 유전자가 고추 한별 품종에 부여하는지 여부를 알아보기 위해 노던블러팅을 수행했다.
실험결과를 도 10에 나타내었다. 아래 잎에 감수성 반응을 나타내는 병원성 균을 접종했을 때와 저항성반응을 보이는 비병원성균을 접종했을 때, 병원균에 감염된 아랫잎에서는 스텔라시아닌 유전자가 비병원성균을 접종했을 때 조사된 모든 시간에서 강하게 발현됨을 확인하였다. 그러나, 접종이 안된 건전한 상위 잎에서는스텔라시아닌 유전자가 전혀 유도되지 않는다는 것을 보여주었다.
고추세균성점무늬병을 일으키는 병원성균주 Ds1과 비병성균주 Bv5-4a, 와 고추에 병을 일으키지 못하는 슈도모나스 플로레슨스 균주 ATCC13525를 배양하여 5×108cfu/ml의 농도로 바늘 없는 주사기를 이용하여 2엽기의 고추식물에 아랫잎에 접종하였다. 접종후 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20 시간에 접종한 아랫잎과 접종하지 않은 건전한 윗잎을 시료로 하여 노던블러팅을 수행하였다. 제 9도는 고추세균성점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종했을 때의 스텔라시아닌 유전자의 발현을 나타낸 것이며 감수성 반응과 저항성반응은 각각 병원성균주와 비병원성균주로 접종된 것을 나타내며, 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
실시예 6: 기계적 상처에 의한 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 국부적, 전신적 유도발현
작물재배시 대표적인 환경 스트레스 중에 하나인 상처를 고추 잎에 인위적으로 처리했을 때, 이의 방어에 스텔라시아닌 유전자가 작용하는지 여부를 확인하기 위해 노던 블러팅을 수행하였다.
실험결과 도 11에 나타낸 바와 같이, 고추 잎에서 상처를 잎은 아랫잎이나, 상처 잎은 아래 잎을 지닌 식물의 건전한 윗잎에서 스텔라시아닌 유전자가 모두 강하게 유도 발현되었음을 확인할 수 있었다.
2엽기 고추식물잎에 주사바늘을 이용하여 인위적으로 구멍을 내어 상처를 입혔다. 이를 행한 후, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 시간 후에 상처 잎은 아랫잎과 건전한 윗잎을 시료로 하여 노던블러팅을 수행하였다. 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
실시예 7 : 염류에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도 발현
환경 적인 스트레스 중의 하나인 염류가 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현에 미치는 영향을 노던블러팅을 통하여 관찰하였다.
실험결과 도 12에 나타낸 바와 같이 고추 뿌리를 200 mM의 염화나트륨 (NaCl)용액에 처리하여 잎과 줄기에서 각각 스텔라시아닌 유전자가 유도됨을 알 수 있었다. 1시간만에 처음 발현을 보이다가 24시간까지 그 양이 증가된다. 잎조직에서는 1시간부터 24시간까지 그 양이 비슷하게 유지되었다. 줄기조직에서는 18시간 이후로 스텔라시아닌 유전자의 발현이 크게 증가되었다. 0, 1, 10, 100, 200 mM의 다양한 농도의 염화나트륨의 용액에 처리하면, 잎에서는 보통정도의 양이 1 mM에서 200 mM 농도까지 비슷하게 유지되는 반면, 줄기에서는 100 mM 이상의 농도에서 이 스텔라시아닌 유전자의 발현이 유도됨을 관찰하였다. 이 결과는 고추 스텔라시아닌 유전자의 발현이 염화나트륨에 의한 스트레스에 대해 잎과 줄기 조직에서 다르게 나타나는 것을 보여주었다.
스텔라시아닌 유전자의 발현을 시간대로 관찰하기 위해 4 엽기의 고추식물을포트에서 조심스럽게 꺼내어 200 mM의 염화나트륨 용액에 뿌리를 담가 처리하였고, 처리한지 1, 2, 6, 12, 18 24 시간에 각각 잎과 줄기를 채취하여 노던블러팅에 활용하였다. 발현을 위한 효과적인 농도를 조사하기 위해 0, 1, 10, 100, 200 mM의 염화나트륨 용액에 4 엽기 고추식물을 처리하여 18 시간만에 각각 잎과 줄기를 채취하여 노던블러팅에 활용하였다. 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
실시예 8 : 건조에 의한 스텔라시아닌 유전자의 유도발현
상처, 염류와 더불어 건조한 조건도 식물성장에 있어서는 스트레스조건이다. 이 건조 처리가 고추식물에서의 스텔라시아닌 유전자의 유도발현에 미치는 영향을 노던블러팅을 통하여 관찰하였다. 잎이 수분을 토양에 공급하지 않은지 7일 정도 후부터 시들기 시작했다. 이시기부터를 1일로 정하고 4일까지 건조 처리를 행했다.
건조처리결과 도 13에 나타낸 바와 같이, 잎과 줄기에서 모두 1일째 유도가 실현되었고, 건조일수가 늘어날수록 증가되어 4일째 되었을 때 강한 발현을 보였다.
건조에 대해 스텔라시아닌 유전자가 발현되는 여부와 현상을 관찰하기 위해 포트에 물을 공급하지 않은 채로 두었다. 7일 째부터 시들기 시작해서, 그날을 1 일로 명명하였고, 4일까지 수행하여 얻은 시료로 노던블러팅에 활용하였다. 25S 리보솜 RNA은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 식물병 방어반응을 보이는 스텔라시아닌 유전자를 분리하여 그 염기서열을 결정함으로써 식물체 방어반응의 표지 및 식물병 저항성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로 이용될 수 있고 또한 고추 세균성 점무늬병균, 고추역병균, 탄저병균 및 비생물적 유도체에 의한 상기 스텔라시아닌 유전자의 유도 발현 정도를 측정하는 방법을 제공하고, 저항성을 일으키는 식물체의 생화학적 변화를 분자적 수준에서 이해함으로써 이를 이용하여 식물 병원균 및 외부 환경의 스트레스에 의한 식물체의 방어반응 여부 판별과 저항성 작물을 육종할 수 있는 효과가 있으므로 농산업 및 식물육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 고추 한별 품종(Capsicum annuumL.cv. Hanbyul)으로부터 분리해낸 서열번호 1의 식물병 방어반응 관련 스텔라시아닌 유전자.
  2. 제 1항 기재의 고추 한별 품종(Capsicum annuum L.cv. Hanbyul)으로부터 분리해낸 스텔라시아닌 유전자에 코딩된 서열번호 2의 아미노산 서열.
  3. 제 1항 기재의 고추 한별 품종(Capsicum annuum L.cv. Hanbyul)으로부터 분리해낸 스텔라시아닌 유전자를 pBluescript SK(-)에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pCASLP 1.
  4. 고추 한별 품종(Capsicum annuum L.cv. Hanbyul)으로부터 분리해낸 스텔라시아닌 유전자가 삽입된 제 3항 기재의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체Escherichia coliCASLP1(수탁번호 KFCC-11275).
  5. 식물체의 병발생에 대한 방어반응을 판별함에 있어서, 식물병원균을 접종하거나, 염류, 건조 또는 기계적 상처를 포함하는 외부환경 스트레스의 조성 또는 메틸 자스모네이트를 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후32P로 표지한 상기 제 1항 기재의 스텔라시아닌 유전자 프로브와 반응시켜 스텔라시아닌 유전자의 차별적 발현을 확인함을 특징으로 하는 식물체의 방어반응 판별방법..
  6. 제 5항에 있어서, 상기 병원균이 고추세균성점무늬병균, 고추역병균, 고추잎탄저병균 또는 고추열매 탄저병균임을 특징으로 하는 식물체의 방어방법 판별방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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