CN108642056A - 大豆食心虫LgPGRP-LB基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种大豆食心虫LgPGRP‑LB基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。体外合成大豆食心虫LgPGRP‑LB基因的dsRNA，利用喂食法将大豆食心虫LgPGRP‑LB基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：喂食LgPGRP‑LB的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内LgPGRP‑LB基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫提前十个月左右化蛹。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。

Description

大豆食心虫LgPGRP-LB基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆食心虫 LgPGRP-LB基因及其应用。

背景技术

大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella(Mats.Obraztsov))是我国东北大豆产区发生最严重的一种虫害，主要是幼虫蛀入豆荚危害豆粒。一般年份 虫食率10％～20％，重害年份30％～40％，个别年份超过50％以上。造成 被害豆粒不完整或破粒，降低大豆产量和品质。化学杀虫剂是防治食心 虫的常用方法。目前使用的化学杀虫剂都是广谱性杀虫剂，不仅能杀死 目标昆虫，而且杀死有益昆虫，同时大量和长期使用化学杀虫剂不仅使 大豆食心虫抗药性逐年增加，而且污染环境。培育抗大豆食心虫的大豆 品种的传统育种方法虽然有效，但周期长，效率低。所以，现在需要建 立一种防治大豆食心虫的新方法，能够更精确、更高效的控制大大豆食 心虫，加快我国抗大豆食心虫育种研究速度。

RNA干扰(RNA interference)是一种由外源或内源双链RNA (double-strandedRNA，dsRNA)诱发同源mRNA特异性降解的现象， 是近年来发现的一种新的基因调控机制。利用植物表达与昆虫生长关 键基因匹配的dsRNA分子，当昆虫取食这类植物后，将昆虫关键生长 基因dsRNA导入昆虫体内，dsRNA介导昆虫体内同源mRNA发生降解， 使昆虫体内与dsRNA相对应的靶基因表达被抑制，使昆虫致死或滞育， 从而达到控制害虫的目的。由于RNAi沉默基因的高效性和特异性， dsRNA只介导目标昆虫的靶基因沉默，而对非目标昆虫不产生任何影 响，具有更高的生物安全性，被认为是一种非常具有前途的控制害虫的 新方法，能够更好的防治那些以农作物为食、影响农作物产量的害虫， 是农作物害虫防御领域的突破。

获得目标害虫的靶标基因，是利用RNA技术进行虫害防治研究的 必需基础。Terenius et al 2011年发现与昆虫免疫相关和肠特异表达基因 的dsRNA更易介导昆虫内源靶基因高效沉默。Bingsohn et al 2016进一 步证实敲出昆虫Toll免疫途径的相关基因表现100％的RNA干扰致死效 应，免疫途径的相关基因可以作为昆虫RNA干扰害虫防治的靶标基因。

在昆虫天然免疫系统中，模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)识别非已异物是免疫反应的第一步，对生物体的生存 极为重要，其与病原微生物表面的病原体相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)的相互识别和作用是启动天然免 疫应答的关键。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan RecognitionProteins, PGRPs)是昆虫体内重要的一类PRRs，此蛋白能够专一性结合革兰氏阳 性菌细胞壁肽聚糖(Peptidoglycans，PG)。PGRPs可识别不同种类的 细菌病原体，它与PGN有高度粘附性，可识别PGN和含PGN的细菌， 进而激活Toll或Imd信号途径产生抗菌肽，在免疫应答中发挥重要的 识别和调节功能。昆虫PGRPs蛋白在识别细菌侵染，除激活Toll或Imd 信号途径产生抗菌肽外，也会激活酚氧化酶原级联反应以抵御细菌的侵 染。PGRP可以分为长型(L)和短型(S)两类。不同类型的肽聚糖识别蛋 白功能也不同。在果蝇中PGRP通过识别细菌肽聚糖激活Imd信号途 径，PGRPLA起正调控作用，而PGRPLB是Imd信号途径中起负调控， 以避免昆虫自身免疫系统因细菌侵染免疫过于激烈而对虫体造成伤害， 且PGRPLB在昆虫发育过程也起着重要作用。植物中不含有昆虫天然免 疫系统基因，因此在植物中表达昆虫的PGRPLB的dsRNA,不会沉默 植物基因，与将昆虫的管家基因作为靶基因相比，更安全，特异性更强。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码大豆食心虫LgPGRP-LB的基因， 其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种含有大豆食心虫LgPGRP-LB基 因的载体。

本发明的第三个目的在于提供大豆食心虫LgPGRP-LB基因在提高 大豆抗食心虫能力中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种提高大豆抗食心虫能力的方法， 将大豆食心虫LgPGRP-LB基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性 提高的大豆，所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO：1所示。

所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因通过含有所述大豆食心虫 LgPGRP-LB基因的载体导入植物组织或细胞。

本发明的技术路线为：

1)利用分子生物学方法克隆大豆食心虫LgPGRP-LB基因；

2)体外合成大豆食心虫LgPGRP-LB基因的dsRNA，利用喂食法将 大豆食心虫LgPGRP-LB基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体 内，结果证明：喂食LgPGRP-LB的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体 内LgPGRP-LB基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响， 导致其提前十个月左右化蛹。

本发明克隆了一种大豆食心虫LgPGRP-LB基因，体外合成大豆食心 虫LgPGRP-LB基因的dsRNA，利用喂食法将大豆食心虫LgPGRP-LB基 因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：喂食 LgPGRP-LB的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内LgPGRP-LB基因沉 默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼 虫提前十个月左右化蛹。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载 体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。

附图说明

图1大豆食心虫LgPGRP-LB基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图， M：DL2000DNA分子量标准，1：LgPGRP-LB的PCR产物；

图2 LgPGRP-LB在大豆食心虫不同发育阶段的表达模式；

图3 LgPGRP-LB在大豆食心虫不同组织的表达模式；

图4饲喂LgPGRP-LB dsRNA对大豆食心虫幼虫LgPGRP-LB表达水平 的影响

图5饲喂LgPGRP-LB dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；

图6饲喂LgPGRP-LB dsRNA对大豆食心虫幼虫体重的影响；

图7饲喂LgPGRP-LB dsRNA对大豆食心虫幼虫发育的影响；

图8饲喂LgPGRP-LB dsRNA对大豆食心虫幼虫羽化的影响；

图9 RNAi植物表达载体pJawoh18-LgPGRP-LB RNAi的构建流程 图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

实施例1大豆食心虫LgPGRP-LB基因克隆及序列分析

根据大豆食心虫转录组测序结果(SRR5985986)，利用blast对转 录组数据进行分析，获得一个和家蚕PGRP-LB(XM_021349692)高度同 源的一个unigene序列(c65269.graph_c0)，利用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和DNAMAN软件进行分 析，设计了覆盖LgPGRP-LB的全部序列的2个特异引物：

LgPGRP-LB引物1:5-ATCATTAAGAGGGTGGTC-3'；

LgPGRP-LB引物2:5-CGTACCCTGGGCACTTTT-3'。

以大豆食心虫基因组为模板进行PCR的扩增，预变性95℃5min， 95℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环，终延伸72℃10min。 用引物1和引物2进行PCR反应，从大豆食心虫cDNA模板中获得扩 增产物，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，将产物进行测序，得到ORF序列长度为636bp的大豆食心虫LgPGRP-LB序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。编码211个氨基酸，预测的蛋白质的分子量为24kDa， 其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。大豆食心虫核糖体蛋白质序列包 括3个保守功能结构域：第一功能结构是位于氨基酸44-47的rRNA结 合结构域；第二功能结构域是位于氨基酸182-298的与核糖体蛋白质P1 和P2互作的结构域；第三个高度保守的功能结构域位于290-317的延伸 因子结合的结构域。

实施例2大豆食心虫LgPGRP-LB基因的表达模式分析

为了确定大豆食心虫LgPGRP-LB基因在大豆食心虫不同发育时期 和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，从7月末8月初大豆田间出现 大豆食心虫成虫开始，收集卵、幼虫、蛹、成虫四个时期的大豆食心虫 样品，收集的虫样分别放入无Rnase的EP管后立即在液氮中冷冻，放 入-80℃的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。选取大豆食心虫3-4龄 幼虫进行解剖，剖取的神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪 体7个组织分别放入无Rnase的EP管后立即在液氮中冷冻，放入-80℃ 的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。利用Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad,CA)提取大豆卵、幼虫、蛹、成虫四个时期和神经节、表皮、 唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织的总RNA,利用采用Fermentas 公司M-MLV反转录酶合成cDNA第一链.以cDNA为模板，利用 RT-PCR和荧光定量PCR对结果表明LgPGRP-LB mRNA的表达情况进 行检测。荧光定量PCR按照TOYOBO公司GreenRealtime PCR Master Mix-Plus-的程序进行。荧光定量PCR反应中所使用的基因及其 引物如下：

β-Actin-RT-F:5'CGGTGGTGGTGAACGAGTAA 3'

β-Actin-RT-R:5'CATCCTCCGTCTGGACTTGG 3'

LgPGRP-LB-RT-R:5AGCGGCTAAAGACCTGATCG 3'

LgPGRP-LB-RT-F:5'AAACCTGACGGTGGCCTATT 3'

为了确定大豆食心虫LgPGRP-LB基因在大豆食心虫不同发育时期 和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，利用荧光定量PCR对 LgPGRP-LB mRNA的表达情况进行检测，结果表明LgPGRP-LB mRNA 在各发育阶段均表达，包括卵、幼虫、蛹、成虫四个时期(图2)；成虫期LgPGRP-LB mRNA的表达量在幼虫表达量较高，在卵，蛹和成虫 的表达量较低。同时，选取4龄幼虫进行解剖，取神经节、表皮、唾腺、 中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织用上述引物检测，结果发现 LgPGRP-LB mRNA在这7个组织中均有表达，其中表皮，脂肪体和中 肠的相对表达量较高，其它4个组织相对表达量较低(图3)。

实施例4 LgPGRP-LB对细菌侵染的免疫应答反应

为了确定大豆食心虫LgPGRP-LB基因对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌的识别情况。将90头老熟幼虫分为三组，在腹腔分别注射5uL的革 兰氏阴性细菌E.coli，革兰氏阳性细菌B.subtilis和生理盐水(CK)。 然后喂食人工饲料，放入温度26℃，湿度80％，光照18h的人工气候箱 内饲养24小时后，提取幼虫的mRNA,利用荧光定量PCR对LgPGRP-LB mRNA的表达情况进行检测，结果表明LgPGRP-LB对革兰氏阴性细和 革兰氏阳性细菌侵染均有相应(图4)，但是LgPGRP-LB在革兰氏阳 性细菌侵染后，与对照幼虫相比，其表达水平显著增加，是对照的2.71倍；而 革兰氏阴性细菌侵染后，其表水平是对照的1.50倍，因此LgPGRP-LB对革兰氏阳性细菌侵染的免疫反应强度更大。

实施例5 LgPGRP-LB沉默对大豆食心虫幼虫生长发育的影响

将大豆食心虫LgPGRP-LB序列利用DNAman软件根据T7 RiboMAXTM Express RNAiSystem试剂盒(Promega,USA)设计如下引 物：

LgPGRP-LB-T7-F5’-5-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCCAGGACGA CAATGGATGGA

LgPGRP-LB-R5’-CCAGGACGACAATGGAT-3’

LgPGRP-LB-T7-R5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGCGATCAGG TCTTTAGCCG-3’

LgPGRP-LB-R 5’-AGCGATCAGGTCTTTAGCCG-3’

体外合成长度为205bp的LgPGRP-LB dsRNA。

将体外合成的LgPGRP-LB dsRNA和GFP dsRNA(对照)分别添加到 大豆食心虫人工饲料DE1-4中。利用添加dsRNA的人工饲料饲养大豆 食心虫1龄幼虫，每组50只，3次重复。将喂食人工饲料的一龄大豆食心虫 幼虫，放入温度26℃，湿度80％，光照18h的人工气候箱内，每隔3天换一次添加 dsRNA的人工饲料，每天观察大豆幼虫死亡率、生长发育情况、称量幼虫的体 重、挑选4头合适的幼虫放入-80度冰箱保存用于提取总RNA用于荧光定量PCR 检测LgPGRP-LB mRNA的表达水平。

实验结果表明：大豆食心虫取食LgPGRP-LB dsRNA后，与取食GFP dsRNA 的幼虫相比，在第3d时LgPGRP-LB表达开始下降，在第6d,9d和12d时 LgPGRP-LB的表达量显著低于取食GFP dsRNA的幼虫(图5)。对幼虫的死亡 率和体重分析表明，在第15d时幼虫积累死亡率和体重与GFP dsRNA 的幼虫无明显的差异(图6和图7)。但在15d取食LgPGRP-LB dsRNA的老熟幼虫有50％花蛹并羽化(图8)，表明LgPGRP-LB基因是大豆食心虫生长发育关 键基因而且在打破老熟幼虫的滞育中起重要作用。

实施例6 LgPGRP-LB基因RNAi表达载体构建及大豆遗传转化

LgPGRP-LB基因RNAi表达载体构建

LgPGRP-LB基因RNAi表达载体构建流程参见图8，由于大豆转 化效率较低，而且转化效率因基因型不同差别很大，所以在进行体外人 工合成LgPGRP-LB的dsRNA的同时，利用introgen公司的Gateway 技术构建高效植物表达载体。直接常规合成两边分别带有AttL1和AttL2 位点的基因LgPGRP-LB，将基因克隆至载体pUC57-Kan，即为带有 LgPGRP-LB目的基因片段的入门克隆，利用introgen LP Clonase^TM Enzyme Mix将已构建好的入门克隆载体与植物RNAi表达载体 pJawoh18-RNAi进行LR反应，构建了LgPGRP-LB基因的RNAi植物表达载体pJawoh18-LgPGRP-LB RNAi，用热激法将表达载体转入Trans-T1 大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性的克隆转化子，用电击法将表 达载体转入GV3101农杆菌感受态细胞。

大豆种子经氯气消毒处理，萌发培养7d后，将两片子叶从子叶节 处纵向切开，保留2-3mm下胚轴，用解剖刀切去萌发的顶芽和侧芽， 用带有植物表达RNAi载体pJawoh18-LgPGRP-LB RNAi农杆菌浸染大 豆子叶节，经ppT筛选得到T0抗性苗，利用LB基因特异性引物:

LgPGRP-LB sense 5’-ATCGGAAGTGATAAAGTT-3’

LgPGRP-LB antisense 5’-CAATAGGCAGTGATGGTG-3’

对T0代抗性苗进行PCR分子检测，获得PCR阳性5株系(DN50- LB-1，DN50-LB-2，DN50-LB-3，DN50-LB-4，DN50-LB-5,DN50- LB-5)，LgPGRP-LB植物表达RNAi载体整合到大豆中，获得表达豆 食心虫LgPGRP-LB dsRNA的转基因株系。

实验例五转基因大豆抗食心虫性验证

转基因后代材料抗食心虫鉴定在东北农业大学转基因中间试验基 地进行防虫网室中进行。在防虫网室内种植稳转表达豆食心虫 LgPGRP-LB dsRNA T2代转基因株系(DN50-LB-3和DN50-LB-5)和 受体材料(东农50)，每个品种种15盆，3次重复，随机排列。于8月上中旬(5～15日)大豆食心虫成虫发生盛期到田间捕蛾，进行网室内人 工接虫。接虫密度20对/m2。每5天接虫一次，分早、中、晚三期接入， 以增大成虫选择适宜豆荚产卵的机会。籽粒成熟后，每次重复随机取样 10株，脱粒后调查虫食率。大豆抗虫性分级标准：虫食率≥30％为高感 (HS)；30％＞虫食率≥20％为感虫(S)；20％＞虫食率≥13％为中度 感虫(M)；13％＞虫食率≥9％为抗虫(R)；虫食率＜9％为高抗(HR)。 数据分析采用SAS8.02进行。结果如下：

表1 T2转基因大豆部分农艺性状及抗虫分析

对T2代转基因LgPGRP-LB植物表达RNAi载体的农艺性状进行分 析表明(表1)，转基因材料农艺性状与受体亲本东农50无明显差异。 DN50-LB-3的虫食率与受体亲本东农50无差异显著，DN50-LB-5与受 体亲本东农50相比提高了1个数量级。，表明在这两个转基因材料中， 外源的大豆食心虫LgPGRP-LB基因的dsRNA已获得表达，转基因材料 抗食心虫的能力有所提高。本研究培育的抗虫转基因材料不仅可以作为 亲本材料，通过常规育种技术培育抗虫大豆新品种，同时，也可以直接 形成品种并在生产中加以利用。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 大豆食心虫LgPGRP-LB基因及其应用

<130> PIC17S0085

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 大豆食心虫

<400> 1

atggctggct atagtggtta tatatacaat gttatatttg cctgtttgtc ggccagcgtt 60

ttaagtttgc caactaatca aaactacagt gtcaaaaact ttagaggtta ccgtctacgc 120

ttcccattct actcaagaca agattggggt gccaaaccac cagtttccta cgaactgctc 180

agtttacccg ttccatatgt gaccatccac cacacataca ttccagcagc gtgtttcaac 240

cctcagcaat gtaaatatgc tatgcgggaa gtacagacat tacaccagga cgacaatgga 300

tggagtgaca ttggatacaa cttcgcaata ggcagtgatg gtgcggtgta cgaaggccgt 360

ggctggtaca gagtcggcgc tcatgccata ggcgtcaata accgaagcat aggcatcgtc 420

ttctttggag attatgtttc ggatctgcca cccccgaaga gcctacaagc ggctaaagac 480

ctgatcgcta ttggagtaaa agctggtttc atttctccat tccaccgtct aataggccac 540

cgtcaggttt ccgccactga gtgccccgga cagagtctgt actctgagat cacaagttgg 600

gacagatttt taccagattt tgacgtcaac gcgtaa 636

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 大豆食心虫

<400> 2

Met Ala Gly Tyr Ser Gly Tyr Ile Tyr Asn Val Ile Phe Ala Cys Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Val Leu Ser Leu Pro Thr Asn Gln Asn Tyr Ser Val Lys

20 25 30

Asn Phe Arg Gly Tyr Arg Leu Arg Phe Pro Phe Tyr Ser Arg Gln Asp

35 40 45

Trp Gly Ala Lys Pro Pro Val Ser Tyr Glu Leu Leu Ser Leu Pro Val

50 55 60

Pro Tyr Val Thr Ile His His Thr Tyr Ile Pro Ala Ala Cys Phe Asn

65 70 75 80

Pro Gln Gln Cys Lys Tyr Ala Met Arg Glu Val Gln Thr Leu His Gln

85 90 95

Asp Asp Asn Gly Trp Ser Asp Ile Gly Tyr Asn Phe Ala Ile Gly Ser

100 105 110

Asp Gly Ala Val Tyr Glu Gly Arg Gly Trp Tyr Arg Val Gly Ala His

115 120 125

Ala Ile Gly Val Asn Asn Arg Ser Ile Gly Ile Val Phe Phe Gly Asp

130 135 140

Tyr Val Ser Asp Leu Pro Pro Pro Lys Ser Leu Gln Ala Ala Lys Asp

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ile Gly Val Lys Ala Gly Phe Ile Ser Pro Phe His Arg

165 170 175

Leu Ile Gly His Arg Gln Val Ser Ala Thr Glu Cys Pro Gly Gln Ser

180 185 190

Leu Tyr Ser Glu Ile Thr Ser Trp Asp Arg Phe Leu Pro Asp Phe Asp

195 200 205

Val Asn Ala

210

Claims (9)

1.一种编码大豆食心虫LgPGRP-LB的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因的载体。

3.权利要求2所述载体为RNAi植物表达载体。

4.权利要求3所述RNAi植物表达载体为pJawoh18-LgPGRP-LB RNA i。

5.用权利要求2-4任意一项所述含有大豆食心虫LgPGRP-LB基因的载体转化的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株。

6.权利要求1所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因在提高大豆抗食心虫能力中的应用。

7.权利要求2所述含有大豆食心虫LgPGRP-LB基因的载体在提高大豆抗食心虫能力中的应用。

8.一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将大豆食心虫LgPGRP-LB基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆，所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因通过含有所述大豆食心虫LgPGRP-LB基因的载体导入植物组织或细胞。