BR112013025245A2

BR112013025245A2 - Método para melhorar a resistência de insetos em uma planta, uso de um gene de inseto ou de um fragmento do mesmo, constructo e seu uso, bem como uso de uma molécula de interferente que interfere especificamente com a expressão de um gene de inseto para resistência a insetos da planta

Info

Publication number: BR112013025245A2
Application number: BR112013025245-6A
Authority: BR
Inventors: Chen Xiaoya; Wu Xiuming; Mao Yingbo; Yang Changqing; Wang Lingjian
Original assignee: Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences; Suzhou Kaiyi Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2020-02-11
Also published as: US10155958B2; US20140143906A1; CN102732554A; WO2012130176A1; ZA201307514B; CN102732554B

Abstract

método para melhorar a resistência de plantas a insetos é fornecido um método para melhorar a resistência de plantas a insetos. na base de sequências de nucleotídeos de genes alvo de insetos, construtos são concebidos e moléculas interferentes são formadas, que interferem com a expressão de genes alvo em plantas. plantas geradas podem inibir significativamente a expressão dos genes relacionados depois de serem ingeridas por insetos. este processo pode ser um pouco afetado ou não afetado por obstáculos, tais como o sistema digestivo dos insetos. o método pode melhorar a resistência de plantas a insetos, portanto, reduz a quantidade de uso de agrotóxicos e os custos de produção agrícola, e preserva o ambiente ecológico.

Description

MÉTODO PARA MELHORAR A RESISTÊNCIA DE INSETOS EM UMA PLANTA, USO DE UM GENE DE INSETO OU DE UM FRAGMENTO DO MESMO, CONSTRUCTO E SEU USO, BEM COMO USO DE UMA MOLÉCULA DE INTERFERENTE QUE INTERFERE ESPECIFICAMENTE COM A EXPRESSÃO DE UM GENE DE INSETO PARA RESISTÊNCIA A INSETOS DA PLANTA

DOMÍNIO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se à biotecnologia vegetal e a melhorias da planta por meio de engenharia genética. Particularmente, a presente invenção refere-se aos novos genes alvos em insetos, e a expressão neles podem ser especificamente suprimidos em insetos através da técnica de RNAi mediada por planta, desse modo suprimindo o desenvolvimento de insetos e melhorando a resistência de plantas a insetos. A invenção divulga as sequências desses genes alvo e suas aplicações na área de resistência a insetos mediada por RNAi em plantas transgênicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Em produções agrícolas, os danos causados por pragas sempre foram um fator importante que influencia as produções agrícolas. Todos os anos, uma grande soma de recursos humanos e materiais são consumidos para reduzir os danos causados por pragas, a fim de melhorar os rendimentos de culturas. No entanto, aplicações frequentes de substâncias quimicas agrícolas resultam em grave contaminação ambiental e causam graves danos à biodiversidade em fazendas.

[001] Pesticidas residuais em produtos agrícolas também são um importante fator de risco à saúde humana. Ao

2/63 mesmo tempo, o uso a longo prazo de pesticidas aumenta a sua resistência aos pesticidas, resultando em dosagens cada vez maiores de pesticidas e alterando os tipos de pesticidas. Isso agrava ainda mais os problemas ambientais. Tendo em consideração a proteção ambiental e o desenvolvimento sustentável, novos métodos para combater pragas são urgentemente necessários.

[002] A inserção de genes resistentes a insetos, como o gene Bt, em plantas para produzir proteínas inseticidas nas plantas, pode melhorar significativamente a resistência de plantas a insetos ou pragas. Ao mesmo tempo, isso pode reduzir as aplicações de pesticidas. Neste momento, sojas transgênicas resistentes a insetos, algodão Bt, etc., têm sido amplamente cultivados, levando a grandes benefícios econômicos e sociais. No entanto, resistências dos insetos contra estas proteínas têm sido observadas, e os desempenhos destas culturas transgênicas também tem diminuído. Além disso, a supressão de exclusivamente um inseto específico também pode levar ao estímulo de outros insetos. Portanto, é necessário desenvolver novas plantas transgênicas resistentes a insetos a fim de efetivamente e/ou especificamente reagir contra os danos causados por pragas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [003] A presente invenção visa fornecer um método para melhorar a resistência de plantas a insetos.

[004] O primeiro aspecto da invenção refere-se aos métodos para melhorar a resistência de plantas a insetos. Um método compreende as seguintes etapas: expressar uma molécula interferente que interfere especificamente com a

3/63 expressão de um gene de inseto acima descrito (ou seus fragmentos) em uma planta.

[005] O dito gene de inseto pode ser selecionado do gene da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase flavoproteína 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[006] Em outra modalidade preferencial, após a alimentação das plantas (plantas transgênicas), os genes ou seus fragmentos em insetos serão infrarregulados ou silenciados, desse modo, o crescimento ou o desenvolvimento dos insetos será inibido ou os insetos vão morrer.

[007] Em outra modalidade preferencial, as ditas moléculas interferentes podem ser seleccionadas de (mas sem se limitar), a um dsRNA, um ácido nucleico antissentido (nucleotídeos), um RNA interferente pequeno (siRNA) ou miRNA que alveja o dito gene de inseto ou seu fragmento ou um transcrito do mesmo para inibir ou silenciar aquele gene alvo.

[008] Em outra modalidade preferencial, dito método compreende:

(1) fornecer um constructo, o qual compreende a seguinte estrutura:

Scqsense^-Seq_antisenseJ Formula I em que a Seq_sense é uma sequência de nucleotídeos do dito gene de inseto ou um fragmento do mesmo, e as sequências de nucleotídeos da Seq_sense e da Seq_antisense são basicamente complementares entre si.

[009] X é uma sequência intermediárias entre a Seq_Sense θ a Seq_antisense< e a dita sequência intermediária não

4/63 é complementar com as sequências de Seq_sense e Seq_antisense · [010] (2) transformar uma planta com o constructo de (1) .

[011] Em outra modalidade preferencial, o comprimento da dita sequência intermediária é de 30 a 300 nt; preferencialmente de 50 a 200 nt; mais preferencialmente de 100 a 150 nt.

[012] Em outra modalidade preferencial, o comprimento da dita Seq_sense ou Seq_antisense é de pelo menos 18 pb, preferencialmente é de pelo menos 20 pb; mais preferencialmente é de pelo menos 50 pb; mais preferencialmente é de pelo menos 100 pb; mais preferencialmente é de 100 a 700 pb; e mais preferencialmente é de 200 a 600 pb.

[013] Em outra modalidade preferencial, após transformar o dito constructo em uma planta, o referido constructo expressa em uma célula vegetal, tecido ou órgão para produzir uma molécula interferente mostrada na fórmula II .

SeCjsense .....

Sea ¹¹ , ^x [014] Fórmula II [015] Nesta fórmula,

Seq_sense, Seq_antisense θ X são como definidos acima, | | representa ligações de hidrogênio formadas entre Seq_sense e Seg_ant isense · [016] Em outra modalidade preferencial, a etapa (2) compreende:

(a) fornecer Agrobacterium tumefaciens transportando um vetor de expressão, o dito vetor de expressão contendo o constructo descrito em (1);

5/63 (b) colocar em contato uma célula vegetal, tecido ou órgão com a Agrobacterium tumefaciens descrita na etapa (a) para transfectar o dito constructo na célula vegetal, tecido ou órgão.

[017] Em outra modalidade preferencial, o dito método compreende ainda:

(c) selecionar a célula vegetal, tecido ou órgão que foi transformado com o dito constructo.

(d) regenerar uma planta da célula vegetal, tecido ou órgão descrito na etapa (c).

[018]	Em	outra	modalidade	preferencial,	o	dito
constructo	está em	um vetor de expressão.
[019]	Em	outra	modalidade	preferencial,	o	dito

vetor de expressão compreende ainda um ou mais elementos operavelmente ligados, como um promotor, terminator, etc., que pode ser transcrito em uma planta.

[020] Em outra modalidade preferencial, a dita Seq_sense é selecionada de:

SEQ ID No: 1 (precursor de tripsina, gene precursor de tripsina de Helicoverpa armigera) ou uma sequência correspondente às posições 1-576 do mesmo;

SEQ ID No: 2 (dopa descarboxilase, gene da dopa descarboxilase de Helicoverpa armigera) ou uma sequência correspondente às posições 311-621 do mesmo;

SEQ ID No: 3 (NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína de Helicoverpa armigera) ou uma sequência correspondente às posições 297-771 ou às posições 501-899 do mesmo;

SEQ ID No: 4 (beta-ATP sintase, gene da subunidade da betaATP sintase de Helicoverpa armigera) ou uma sequência

6/63 correspondente às posições 203-630 do mesmo;

SEQ ID No: 5 (cadeia pesada de miosina, isoforma B, gene da cadeia pesada de miosina, isoforma B de Helicoverpa armigera) ou uma sequência correspondente às posições 372662 do mesmo; ou

SEQ ID No: 45 (gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2 de Ostrinia nubilalis, NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2) ou uma sequência correspondente 's posições 251-643 do mesmo.

[021] Em outra modalidade preferencial, a dita planta pode ser selecionada de: dicotiledônea, monocotiledônea ou gimnosperma.

[022] Em outra modalidade preferencial, a dita monocotiledônea pode ser selecionada de: milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, etc.

[023]	Em	outra modalidade	preferencial,	em que a
dicotiledônea	é	selecionada de: Brassicaceae, Malvaceae,
Solanaceae, et	c.
[024]	Em	outra modalidade	preferencial,	a dita
dicotiledônea	é	selecionada de:	algodão, soja	, colza,
amendoim, etc.
[025]	Em	outra modalidade	preferencial,	o dito

inseto é selecionado de: insetos fitófagos.

[026] Em outra modalidade preferencial, os insetos fitófagos são insectos Lepidoptera, insetos Homoptera, Collembola, insetos Isoptera, Coleoptera, Diptera, insetos Hymenoptera, insetos Orthoptera, Hemiptera ou Thysanoptera.

[027] Em outra modalidade preferencial, o inseto fitófagos é uma larva do algodão (Helicoverpa armigera) , broca do milho, afídeos, planthoppers ou broca da soja.

7/63 [028] Em outra modalidade preferencial, o dito gene de inseto é um gene do verme da baga do algodão (Helicoverpa armigera) , gene da broca do milho, gene de afideos ou gene de cicadelas.

[029] Em outra modalidade preferencial, para o controle de um inseto (tal como Helicoverpa armigera) , uma molécula interferente que pode interferir especificamente com a expressão de um gene de inseto (como um gene de Helicoverpa armigera) é expressa em uma planta. Devido aos genes de insetos fitófagos serem altamente homólogos, os mesmos genes de diferentes insetos (por exemplo, os mesmos genes da ATP sintase) geralmente têm as mesmas posições conservadas (se a sequência for suficientemente longa). Portanto, em outra modalidade preferencial, para o controle de um inseto, uma molécula interferente que pode interferir especificamente com a expressão de um gene de inseto é expressa em uma planta, onde a molécula interferente é derivada de um gene de um inseto não alvo que é diferente do inseto sendo alvejado (e o inseto alvo contém um gene homólogo que é altamente homólogo ao gene no inseto não alvo).

[030] Em outro aspecto da invenção, ele fornece um método para produzir plantas transgênicas, as ditas plantas transgênicas com melhor resistência a insetos. O método compreende expressar em uma planta uma molécula interferente que pode interferir especificamente com a expressão de um gene de inseto;

[031] Os ditos genes de inseto são selecionados do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene

8/63 da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[032] Em outro aspecto da invenção, são fornecidas plantas com maior resistência a insetos, que são produzidas pelos métodos descritos acima.

[033] Em outro aspecto da invenção, usos são fornecidos de genes de insetos ou seus fragmentos que são usados como alvos para a preparação de moléculas interferentes que podem inibir ou silenciar especificamente a expressão dos genes em insetos. Os genes de insetos podem ser selecionados a partir do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[034] Em outra modalidade preferencial, o dito gene de inseto é da larva algodão (Helicoverpa armigera), broca do milho, afideo ou cicadela.

[035] Em outro aspecto da invenção, um constructo é fornecido. O constructo compreende a seguinte estrutura:

[03 6] Seq_sense ^—X-Seq_antisense r

Em que Seq_sense é uma sequência nucleotidica do referido gene de inseto ou de seu fragmento. As sequências de nucleotideos da Seq_sense θ Seq_antisense são basicamente complementares entre si; X é uma sequência intermediária entre a Seq_sense e a Seq_antisense < θ a dita sequência intermediária não é complementar com as sequências de Seq_sense e Seq_antisense · [037] O dito gene de inseto é selecionado do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da

9/63

NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[038] Em outra modalidade preferencial, o dito gene de inseto é um gene de Helicoverpa armigera, broca do milho, afideo ou cicadela.

[039] Em outro aspecto da invenção, são fornecidos usos dos ditos constructos, em que os usos são para produzir plantas com resistência a insetos.

[040] Em outro aspecto da invenção, usos são fornecidos de moléculas interferentes, que podem especificamente interferir com a expressão dos genes de insetos, em uma planta resistente a insetos. Os genes de inseto são selecionados do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[041] Em outra modalidade preferencial, o dito gene de inseto é um gene da larva do algodão (Helicoverpa armigera), broca do milho, afideo ou cicadela.

[042] Em outro aspecto da invenção, são fornecidos genes de insetos ou fragmentos dos mesmos como alvos para inibir ou silenciar genes de insetos. Os genes ou fragmentos dos mesmos são selecionados a partir de:

Uma sequência nas posições 1-57 6 da SEQ ID No: 1 (precursora de tripsina);

Uma sequência nas posições 311-621 da SEQ ID No: 2 (dopa descarboxilase);

Uma sequência nas posições 291-771 da SEQ ID No: 3

10/63 (NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina);

Uma	sequência	nas	posições	203-630	da	SEQ	ID	No:	4
(beta-ATP sintase)	r
Uma	sequência	nas	posições	372-662	da	SEQ	ID	No:	5
(cadeia pesada	de	miosina,	isoforma	B) ;
Uma	sequência	nas	posições	501-899	da	SEQ	ID	No:	3

(NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2); ou Uma sequência nas posições 251-643 da SEQ ID não: 45 (NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2).

[043] Em outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula vegetal, em que a dita célula vegetal expressa uma molécula interferente que pode interferir especificamente com a expressão de um gene de inseto;

[044] Os ditos genes de inseto são selecionados do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina.

[045] Em outra modalidade preferencial, o dito gene de inseto é um gene da larva do algodão (Helicoverpa armigera), broca do milho, afideo ou cicadela.

[046] Em outra modalidade preferencial, a dita célula vegetal não pode produzir uma planta diretamente através de fotossintese na presença de nutrientes.

[047] Tendo em vista a presente descrição, outros aspectos da invenção podem ser prontamente percebidos pelas pessoas versadas na técnica. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS.

[048] FIGURA 1. Diagrama esquemático dos vetores de dsRNA e vetores VIGS.

11/63 [049] FIGURA 2. Northern blot ou análise de RT-PCR das abundâncias de dsRNA dos genes alvo em Arabidopsis thaliana transgênica (gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina).

[050] FIGURA 2A. Análise de Northern blot da abundância de dsRNA da NADH desidrogenase (dsWXM-12) em Arabidopsis transgênica (eventos 12-2, 5, 6, 7, 8) . WT indica a planta controle tipo selvagem.

[051] FIGURA 2B. Análise de RT-PCR da abundância de dsRNA da NADH desidrogenase (dsWXM-12) em Arabidopsis transgênica (eventos 12-13, 14, 15, 16, 17, 18). WT indica a planta controle tipo selvagem.

[052] FIGURA 2C. Análise de Northern blot da expressão de dsRNA do precursor de tripsina (dsWXM-2) em Arabidopsis transgênica (eventos 2-1, 2, 3, 4). WT indica a planta controle tipo selvagem.

[053] FIGURA 2D. Análise de RT-PCR da expressão de dsRNA de dopa descarboxilase (dsWXM-6) em Arabidopsis transgênica (eventos 6-2, 3, 4, 5) . WT indica a planta controle tipo selvagem.

[054] FIGURA 2E. Análise de RT-PCR da expressão de dsRNA da beta-ATP sintase (dsWXM-25) em Arabidopsis transgênica (eventos 25-2, 5, 9, 10) . WT indica a planta controle tipo selvagem.

[055] FIGURA 2F. Análise de RT-PCR de expressão de dsRNA da cadeia pesada de miosina (dsWXM-E) em Arabidopsis transgênica (E-l, 2, 7, 8, 10). WT indica a planta controle tipo selvagem.

12/63 [056] FIGURA 3. Análise de PCR e RT-PCR de plantas de algodão transgênicas dsWXM-12.

[057] FIGURA 3A. Análise de PCR de algodão transgênico (R15, 9, 10, 15, 16, 21, 22, 27, 145-1, 145-2, 145-3, 165-1, 165-2) de dswxm-12/2301. R15 indica o material receptor do transgene.

[058] FIGURA 3B. Análise de RT-PCR das expressões de dsRNA no algodão transgênico dsWXM-12 (R15, 10, 16, 21, 27, 145-1, 165-1). R15 indica o material receptor do transgene.

[059] FIGURA 3C. Análise de RT-PCR de 5 amostras aleatoriamente selecionadas infectadas com virus do tabaco (CK, 1, 2, 3, 4, 5) .

[060] FIGURA.4. Pesos corporais de H. armigera após alimentação em Arabidopsis transgênica durante 3 a 7 dias .

[061] FIGURA 4A. Aumentos de peso corporal de 3 larvas de H. armigera instar (6 H. armigeras por grupo, em triplicatas, para um total de 18 H. armigeras) após a alimentação em plantas transgênicas WT ou dsWXM-12 (12-2) durante 3 dias. As larvas alimentadas em 12-2 apresentaram menos aumento de peso corporal em comparação com aquelas alimentados com WT ou plantas transgênicas expressando dsRNAs de outros genes (1, 5, 8, 11 e 20 na figura referemse aos genes WXM-1, 5, 8, 11 e 20).

[062] FIGURA 4B. Aumento de peso corporal de 3 larvas em estágio instar de H. armigera (6 larvas de cada grupo, em triplicata, para um total de 18 larvas) alimentados com plantas transgênicas WT ou dsWXM-12 (12— 18) durante 3 a 7 dias. As larvas foram pesadas e os

13/63 aumentos de peso corporal foram registrados. Larvas de Η. armigera alimentadas em dsWXM-12 exibiram um aumento de peso corporal mais lento do que aquelas alimentadas com WT ou Arabidopsis transgênica expressando dsRNAs de outros genes (27 na figura refere-se ao gene WXM-27).

[063] FIGURA 40. Aumento de peso corporal de 3 larvas em estágio instar (6 larvas por grupo, em triplicata, para um total de 18 larvas) após a alimentação em Arabidopsis WT ou transgênica expressando dsWXM-2 (2-4), durante 3 dias. As larvas foram pesadas e os aumentos de peso corporal foram calculados. Aumentos de peso corporal de H. armigera alimentadas com 2 a 4 foram aparentemente mais lentos do que aquelas alimentadas com plantas WT.

[064] FIGURA 4D. Aumentos de peso corporal de 3 larvas em estágio instar (6 larvas por grupo, em triplicata, para um total de 18 larvas) após a alimentação em linhagem 2 de Arabidopsis ou dsWXM-2 (6-2) durante 4 dias. As larvas foram pesadas e os aumentos de peso corporal foram calculados. Aumentos de peso corporal de H. armigera alimentadas em 6-2 foram aparentemente mais lentos do que aqueles alimentados com plantas WT.

[065] FIGURA 4E. Aumentos de peso corporal de 3 larvas em estágio instar (6 larvas por grupo, em triplicata, para um total de 18 larvas) após a alimentação em linhagem WT, dsWXM-E 2 (E-2) ou linhagem dsWXM-25 2 (25— 2) durante 4 dias. As larvas foram pesadas e os aumentos de peso corporal foram calculados. Aumentos de peso corporal de H. armigera alimentadas em E-2 ou 25-2 foram aparentemente mais lentos do que aquelas alimentadas com plantas WT.

14/63 [066] FIGURA.5. Status de expressão dos genes alvo de H. armigera após a alimentação em A. thaliana transgênica durante 3 a 7 dias.

[067] FIGURA 5A. Nível de transcrição de NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2 em H. armigera no intestino médio diminuiu significativamente após alimentação em Arabidopsis transgênica expressando dsWXM-12 (12-2) durante 3 dias.

[068] FIGURA 5B. Níveis de transcrição de NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2 em H. armigera no intestino médio diminuiu significativamente após a alimentação em Arabidopsis transgênica expressando dsWXM-12 (12-18) durante 7 dias.

[069] FIGURA 5C. Níveis de transcrição da cadeia pesada de miosina em H. armigera no intestino médio diminuiu significativamente após a alimentação em Arabidopsis transgênica expressando dsWXM-12 (E-2) durante 4 dias.

[070] FIGURA 6. Alterações de mortalidade e peso corporal de H. armigera e Ostrinia furnacalis após alimentação em algodão transgênico expressando dsWXM-12 (dsWXM-12/2301) e dsWXM-12 expressando VIGS do tabaco, dsWXM-12 (501) ou dsRNAs de dsWXM-corn.

[071] FIGURA 6. Mortalidade de 2 larvas em estágio instar de H. armigera (6 larvas por cada grupo, em triplicata,,até um total de 18 larvas) após a alimentação em R15 ou plantas de algodão transgênicas expressando dsWXM-12 durante 5 dias. A mortalidade significativamente aumentada de H. armigera alimentada com algodão transgênico do que aqueles alimentados com plantas de algodão não

15/63 transgênicas foi observada.

[072] FIGURA 6B. Mortalidade de 2 larvas em estágio instar de H. armigera (6 larvas por cada grupo, em triplicata, até um total de 18 larvas) após a alimentação em WT ou algodão transgênico expressando dsWXM-12 durante 5 dias. A mortalidade significativamente aumentada de H. armigera alimentada com algodão transgênico em comparação com as plantas de algodão não transgênicas foi observada.

[073] FIGURA 6C. Aumentos do peso corporal de 3 larvas em estágio instar de H. armigera (6 larvas por cada grupo, em triplicata,,até um total de 18 larvas) após a alimentação em plantas de tabaco VIGS expressando dsWXM-12 durante 5 dias. Os aumentos de peso corporal dos insetos foram registrados. Aqueles alimentados com plantas dsWXM-12 apresentaram aumento de peso corporal significativamente mais lento do que aqueles alimentados com plantas WT.

[074] FIGURA . 6D. Peso corporal aumentado de 3 larvas em estágio instar de H. armigera (6 larvas por cada grupo, em triplicata, até um total de 18 larvas) após a alimentação em plantas de tabaco VIGS expressando dsWXM-12 (501) durante 5 dias. Os aumentos de peso corporal dos insetos foram registrados. Aqueles alimentados com plantas dsWXM-12(501) apresentaram aumento de peso corporal significativamente mais lento do que aqueles alimentados com plantas WT.

[075] FIGURA 6E. Mortalidade de larvas em estágio instar de O. furnacalis (broca do milho) (6 O. furnacalis por cada grupo, em triplicata, por um total de 18 O. furnacalis) depois de se alimentarem em plantas de tabaco WT ou VIGS expressando dsWXM-corn (gene homólogo da NADH

16/63 desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em 0. furnacalis) durante 3 dias. Aqueles alimentados com plantas de tabaco VIGS expressando dsWXM-corn apresentaram aumento significativo de mortalidade do que aqueles alimentados com plantas WT ou VIGS contendo vetor vazio.

[07 6] FIGURA 7. Expressão do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em H. armigera, no intestino médio, após se alimentarem em plantas de tabaco VIGS expressando dsWXM-12 ou dsWXM-12 (501).

[077] FIGURA 7A. Nivel de transcrição da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 foi significativamente menor do que aqueles alimentados com plantas de tabaco dsWXM-12 VIGS do que em aqueles alimentados com plantas WT.

[078] FIGURA 7B. Nivel de transcrição da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 foi significativamente menor do que aqueles alimentados com plantas de tabaco VIGS do que em aqueles alimentados com plantas WT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA [079] Após extensa e minuciosa pesquisa, os inventores encontraram alguns genes alvo dos insetos. Com base em sequências nucleotidicas destes genes alvo, constructos podem ser projetados para formar RNA interferente em plantas para interferir com estes genes alvo. Depois que as ditas plantas são comidas por insetos, a expressão dos genes correspondentes pode ser significativamente inibida. Esta inibição é pouco ou não afetada pelas barreiras dos sistemas digestivos dos insetos. Assim, as plantas transgênicas expressando o RNA

17/63 interferente dos genes de insetos, depois de serem comidas pelos insetos que se alimentam de plantas e entrar nos corpos dos insetos podem ser usadas para interferir ou inibir a expressão de genes alvo em insetos que se alimentam de plantas para alcançar o controle de insetos.

[080] Definições [081] Conforme usado neste documento, o termo planta não é particularmente limitado, contanto que a planta seja facilmente infestada por insetos (por exemplo, Lepidoptera), como as várias culturas, flores, plantas ou plantas florestais. A planta pode ser (mas não se limita a): dicotiledôneas, monocotiledôneas ou gimnospermas. Mais especificamente, as plantas podem incluir (mas não se limitam a) : algodão, trigo, cevada, centeio, arroz, milho, sorgo, beterraba, maçã, pêra, ameixa, pêssego, damasco, cereja, morango, framboesa, amora preta, feijões, lentilhas, ervilhas, sojas, colza, mostarda, papoula, oleanólicas, girassóis, coco, plantas de óleo de mamona, grãos de cacau, amendoins, abóbora, pepino, melancia, linho, cânhamo, juta, laranjas, limões, uvas, toranja, espinafre, juta-da-china, alface, espargos, repolho, couve chinesa, couve chinesa, cenouras, cebolas, batatas, tomates, pimentões verdes, abacates, canela, cânfora, tabaco, nozes, café, berinjela, cana de açúcar, chá, pimenta, videiras Oyster Asakusa, bananas, árvores de borracha naturais e plantas ornamentais, etc.

[082] Conforme usado	neste	documento,	o termo
inseto refere-se a qualquer	inseto	que contém	em seu
genoma um gene selecionado do	grupo	consistindo	em gene
tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene	da NADH

18/63 desidrogenase flavoproteina 2, gnee da subunidade beta da ATP sintase e gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina, e estes genes são necessários para o crescimento ou a sobrevivência do inseto. Preferencialmente, os insetos podem ser insetos fitófagos que se alimentam de plantas como os insetos Collembola, Isoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Orthoptera, Hemiptera, Thysanoptera ou pragas agrícolas. Exemplos específicos incluem as espécies de burgo, adoxophyes, clearwing, roscas podadeiras, lagarta corrugada da folha de algodoeiro, Anticarsia gemmatalis, Archips, Argyrotaenia, Noctua, teredem do caule do milho, pink spotted frog, Carposina sasakii, rã, larva de Choristoneura fumiferana, traça da videira , sapo leaf rollers, burgo, Coleophora, Thaumatotibia leucotreta, corn frog, traça das agulhas da folha do pinheiro, diamante, pink frog, eucosma, Euproctis fiava Bremer, roscas podadeiras, leguminivora, Hedya, Noctua, Choi sapo, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella Walsingham, Leucoptera scitella, conopobathr, Lymantriidae, Phyllocnistis, Malacosoma, Mamestra brassicae, Manduca sexta, Apochemia, European corn frog, lagarta comum, Panolis, Pink bollworm, cotton bollworm, Pieris rapae Phthorimaea operculella, Pieris, diamondback moth, ermine moth, white wild frog, big frog, Zeiraphera, Acanthocolla, paranthrene, argyrotaenia, tortrix, cabbage looper, tree ermine moth, Elateroidea, snout beetle, atomaria linearis , beet stem flea beetle, sitophilus, real image genus, dermestes , LeptispaBaly, Coccinella, Leptinotarsa decemlineata, Echinocnemus squameus Billberg, Melolontha, tenebroides, Cleoninae,

19/63

Anômala exoleta Faldermann , altica, Bostrichus, scarab, Sitophilus oryzae , sitotroga, Tenebrionini, Tribolium, Trogoderma, genus beetles, flour beetlegenus, Genus Gryllotalpa , the case of the beetle, flea beetle genus, genus non-Blatta , Blatta, Leucophaea maderae, Locusts, Periplaneta, grasshoppers, termites, thrips, Thrips, single thrips, Thrips palmi, Thrips e Scirtothrips aurantii Faure. Mais preferencialmente, os ditos insetos são prejudiciais às plantas. 0 Pedido de Patente Chinesa No. 200680042821.5, US 2009/0306189 Al, WO 2007/080127 A2, AU 2006/335978 Al e US 2009/0285784 são referências para esta invenção, descrição de insetos nas páginas 41 a 47 em CN101365795 é incorporada neste relatório descritivo da invenção.

[083] Neste documento, o termo RNA de interferência (RNAi) refere-se ao bloqueio, usando certos RNAs de fita dupla, da expressão de genes específicos in vivo com alta eficiência e especificidade, facilitando a degradação do mRNA e induzindo as células para exibem fenótipo de deleção de gene específico. Este processo é também referido como intervenção ou interferência de RNA. O RNA de interferência é um mecanismo de silenciamento gênico altamente específico a nível de mRNA.

[084] Na presente invenção, os princípios básicos da interferência de RNA são como a seguir: usando plantas como intermediárias, permitindo que os insetos ingiram RNAs de interferência capazes de interferir com genes de insetos (incluindo: gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade 3 da ATP sintase, gene da isoforma B da cadeia pesada da proteína miosina),

20/63 levando à inibição do crescimento de insetos, ou à morte dos insetos. Em particular, os princípios são os seguintes: usando métodos de transfecção gênica para expressar os RNAs de fita dupla (dsRNAs) dos genes de insetos (comprimento total ou parcial) na planta para produzir altos niveis de RNAs interferentes nas plantas. Quando os insetos ingerem tais plantas transgênicas, grandes quantidades de RNAs interferentes são ingeridas simultaneamente. Depois de entrar nos corpos de insetos, os RNAs interferentes podem, por sua vez, inibir a expressão de genes de insetos resultando na inibição de crescimentos/desenvolvimentos normais de insetos, ou até mesmo em morte. Com base nos princípios descritos, a capacidade das plantas para resistir ao inseto pode ser efetivamente melhorada. A aplicação de técnicas de interferência de RNA às plantas transgênicas para desenvolver novos tipos de plantas transgênicas resistentes tem grande importância para o desenvolvimento da agricultura.

[085] Neste documento, o termo moléculas interferentes geralmente refere-se a um tipo de substância com atividade de prevenção de inseto obtida a partir da preparação ou processamento (tal como processamento in vivo) de genes de insetos ou seus fragmentos (forma truncada) como alvos com base na presente invenção. As ditas moléculas interferentes incluem, por exemplo, dsRNA, ácido nucleico antissentido (nucleotideos), RNA interferente pequeno, miRNA, etc.

[086] Conforme usado neste documento, o termo dsRNA refere-se a uma molécula de RNA de fita dupla que pode degradar o mRNA especifico pelo alvejamento do mRNA

21/63 com sequências complementares homólogas. Este processo é referido como via de interferência de RNA.

[087] Conforme usado neste documento, basicamente complementar refere-se às sequências de nucleotideos sendo suficientemente complementares, que podem interagir entre si de forma previsível, como formando uma estrutura secundária (tais como a estrutura de haste e alça). Normalmente, há pelo menos 70% de nucleotideos complementares entre duas sequências de nucleotideos basicamente complementares; preferencialmente, pelo menos 80% dos nucleotideos são complementares; mais preferencialmente, pelo menos 90% dos nucleotideos são complementares; ainda mais preferencialmente, pelo menos 95% dos nucleotideos são complementares; por exemplo, 98%, 99% ou 100%. Geralmente, há no máximo 7 nucleotideos incompatíveis entre duas moléculas suficientemente complementares; preferencialmente, há no máximo 6 nucleotideos incompatíveis; mais preferencialmente, há no máximo 5 nucleotideos incompatíveis; ainda mais preferencialmente, há no máximo 4 nucleotideos incompatíveis; por exemplo, há 0, 1, 2, 3 e 4 nucleotideos incompatíveis.

[088] Conforme usado neste documento, sequências complementares geralmente se refere à conversão da sequência com direção 5'-3 ' a 3'-5 ' (tais como 5' ATCG 3' ® GCTA), em seguida, a obtenção de sua sequência complementar (tal como GCTA ® 5' CGAT 3').

[089] Como usado aqui, uma estrutura de haste e alça também chamada de estrutura de grampo, que se refere a um tipo de moléculas nucleotidicas capazes de

22/63 formar uma estrutura secundária com uma região de fita dupla (parte da haste) , a dita região de fita dupla sendo

formada por	duas	regiões	da molécula	de nucleotideo
(localizadas	na	mesma	molécula), da	molécula de
nucleotideo,	duas	regiões	flanqueiam a	região de fita

dupla; ela também inclui pelo menos uma estrutura de alça contendo uma molécula nucleotidica não complementar, que é uma região de fita simples. Mesmo se duas regiões da molécula nucleotidica não forem totalmente complementares, a região de dupla hélice do nucleotideo ainda pode ainda manter a condição de dupla fita. Por exemplo, a inserção, deleção, substituição, etc., pode levar a uma pequena região não complementar ou a uma pequena região que autoforma uma estrutura de haste e alça ou outras formas de estruturas secundárias. No entanto, estas duas regiões são ainda basicamente complementares e podem interagir entre si de modo previsível, formando regiões de fita dupla de uma estrutura de haste e alça. A estrutura de haste e alça é bem conhecida pelas pessoas versadas na técnica. Geralmente, depois de obter um ácido nucleico com uma sequência de nucleotideos com estrutura primária, as pessoas versadas na técnica podem determinar se o ácido nucleico é capaz de formar uma estrutura tipo haste e alça ou não.

[090] Conforme usado neste documento, o dito operavelmente ligados ou operativamente ligado referese ao arranjo espacial da funcionalidade de duas ou mais regiões de ácido nucleico ou sequências de ácidos nucleicos. Por exemplo: a região promotora é colocada em uma posição especifica em relação à sequência de ácidos

23/63 nucleicos do gene alvo, causando a transcrição de sequências de ácidos nucleicos direcionada pela sequências de ácidos nucléicos guiados pela região promotora. Deste modo, a região promotora é operavelmente ligada às sequências de ácidos nucleicos.

[091] Conforme usado neste documento, a menos que seja indicado de outra forma, no termo resistência de insetos, o dito inseto representa pragas.

[092] Conforme usado neste documento, o dito contém, tem ou incluindo incluem compreendendo, consistindo principalmente de, consistindo basicamente de e formado por, principalmente consistindo em, geralmente consistindo em e compreendendo de pertencem ao conceito genérico de ter, incluir ou conter.

[093] Métodos para determinar a identidade de sequência são convencionais para as pessoas versadas na técnica, incluindo o uso dos softwares BLAST e EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. Longden, I. e Bleasby, A. Trends in Genetics 16 , (6) pp276-277) . Conforme usado neste documento, o termo identidade refere-se à relação entre sequências a nivel do ácido nucleico. Comparando as sequências (por exemplo, duas ou mais) com o alinhamento ideal na janela de comparação, a porcentagem de identidade pode ser determinada. Aqui, a comparação entre as ditas sequências na janela de comparação e a sequência de referência com alinhamento de sequência ideal podem conter inserção ou deleção. As ditas sequências de referência não contêm inserção ou deleção. A dita janela de referência é selecionada de pelo menos 10 nucleotideos consecutivos até

24/63 cerca de 50, cerca de 100 ou até cerca de 150 nucleotideos, de preferência, cerca de 50 ~ 150 nucleotideos. Então, ao detectar o número de nucleotideos idênticos entre as sequências na dita janela e dividir o número acima pelo número de nucleotideos na dita janela disse e multiplicar por 100, calcula-se a porcentagem de identidade.

GENE [094] Unidade básica de mensagem genética das proteínas codificadas ou RNA, etc., tendo produtos funcionais específicos, e é um fragmento da sequência de DNA do cromossomo ou do genoma (como vírus de RNA que usam o RNA como veículo da mensagem genética, é a sequência de RNA) . Inclui sequências codificantes (éxons), sequências com função reguladora na expressão gênica localizadas antes e depois da região codificadora e sequências codificantes (introns) localizados entre as sequências codificantes individuais.

GENE ALVO [095] Os métodos da presente invenção usam plantas como intermediário, permitindo que o inseto ingira RNA interferente capaz de expressar o gene interferente do inseto, para inibir o crescimento de insetos ou para matar os insetos. Para descobrir genes de insetos apropriados para esta operação, após pesquisa extensa e minuciosa, os inventores finalmente descobriram os genes apropriados. Os ditos genes incluem o gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina. As principais atividades ou funções destas proteínas

25/63 codificadas por genes são as seguintes:

[096] O precursor da tripsina é uma enzima digestiva que existe principalmente nos intestinos médios de alguns insetos e é usado para digerir as proteínas ingeridas, transformá-las em polipeptídeos menores ou em aminoácidos para posterior absorção e metabolismo.

[097] A dopa descarboxilase é um tipo de aminoácido descarboxilase, catalisa a descarboxilação da dopa para produzir a dopamina. Ela é uma enzima chave no processo de biossíntese do agente de curtimento, N-acetil dopamina em insetos, em relação ao curtimento do estrato córneo durante o período de formação de pupa dos insetos.

[098] A NADH desidrogenase ubiquinona f lavoproteína 2 é uma subunidade do complexo I do metabolismo energético em mitocôndrias, catalisa a oxidação de NADH em NAD+ e H+ e libera os elétrons para as reações de transferência de energia subsequentes.

[099] A beta-ATP sintase está amplamente presente nas mitocôndrias de animais. Ela é uma enzima chave no metabolismo energético em organismos, participando da reação de fosforilação oxidativa, sintetizando cataliticamente o ATP impulsionado pela força motriz dos prótons que atravessam a membrana. A ATP sintase é um complexo complicado, composto de várias subunidades, incluindo a subunidade p.

[100] Miosina (cadeia pesada de miosina, isoforma B) é uma unidade constituinte de miofilamentos pesados. Ela está presente no músculo liso e desempenha um papel importante no movimento muscular.

[101]

A miosina é composta por duas cadeias

26/63 pesadas idênticas e dois pares de cadeias leves. As cabeças das cadeias pesadas têm atividade ATP enzimática e se ligam à actina.

[102] A infrarregulação ou inibição da expressão destes genes pode levar a problemas de crescimento de insetos ou morte. Os ditos genes podem ser usados como alvos para a inibição ou o silenciamento para produzir moléculas interferentes específicas, inibindo o crescimento ou o desenvolvimento de Helicoverpa armigera ou matando os mesmos. A presente invenção também obtém genes altamente homólogos para os ditos genes de Ostrinia furnacalis, usando-os como alvos para inibição ou silenciamento, para produzir moléculas interferentes específicas, inibindo o crescimento ou o desenvolvimento de Ostrinia furnacalis, ou matando-as. Os ditos genes também podem ser obtidos de outros organismos, as funções dos referidos genes são definidas na literatura, suas sequências nucleotídicas são altamente homólogas com aquela em Helicoverpa armigera. É possível que estes genes altamente homólogos podem ser usados como alvos para produzir moléculas interferentes específicas, para inibir o crescimento ou i desenvolvimento do organismo do qual os ditos genes foram isolados ou para matá-los.

[103] Estes genes ou suas proteínas codificadas são conservadoramente e amplamente presentes em insetos, incluindo as principais pragas: afídeos, broca do milho, cicadela, etc. Estes genes ou suas proteínas codificadas apresentam funções similares nas referidas pragas, consulte a Tabela 1 para comparação de homologia das sequências de gene parciais. É concebível que o gene precursor da

27/63 tripsina, o gene da dopa descarboxilase, o gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, o gene da subunidade beta da ATP sintase e o gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina de afideos, broca do milho, cicadela, etc. possam ser respectivamente genes-alvo para a concepção de RNA interferente para resistir aos afideos, Ostrinia nubilalis, cicadela, etc.

Tabela 1

Nome do gene	Helicoverp a armigera	Af ideo	Ostrinia nubilalis	Cicadela
Núm ero Gen Ban k	Homolo gia (ident idade de sequên cia)	Núm ero Gen Ban k	Homolo gia (ident idade de sequên cia)	Núm ero Gen Ban k	Homolo gia (ident idade de sequên cia)	Núm ero Gen Ban k	Homolo gia (ident idade de sequên cia) *
Gene precursor da tripsina	EE3 9 96 00. 1	100%			AY 9 530 59	71%
Gene da dopa descarboxil ase	EE3 994 64 . 1	100%	XM_ 001 950 520	65%
Gene da NADH desidrogena se ubiquinona	EE3 995 80 . 1	100%	XM_ 001 946 866	68%	GH9 993 45	79%	DB8 578 37	68%

28/63

flavoproteí na 2
Gene da	EE3	100%	NW_	77%	GH9	84%	DB8	83%
ATP-sintase	9 96		001		959		294
	58.		919		48		92
	1		738
Gene da	EE3	100%	XM_	75%	HQ1	71%	DB8	78%
miosina	994		001		166		533
	82 .		952		66		08
	1		178

* representa a homologia do gene neste inseto em comparação com a proteina/gene em Helicoverpa armigera.

[104] Devido às funções semelhantes de cada uma das proteínas codificadas por genes mencionadas acima em diferentes insetos, portanto, os polinucleotídeos com homologia de sequência nucleotídica de pelo menos 50% no gene precursor da tripsina, gene da N dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade 3 da ATP sintase ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina presentes em outros insetos e Helicoverpa armigera também estão incluídos na presente invenção, servindo como alvos para projetar RNAs interferentes. Preferencialmente, os polinucleotídeos com homologia de sequência nucleotídica de no mínimo 55%, 60%, 65% ou 68% no gene precursor da tripsina, gene da N dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona f lavoproteína 2, gene da subunidade 3 da ATP sintase ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina presentes em outros insetos e Helicoverpa armigera também estão incluídos na presente invenção, servindo como alvos para

29/63 projetar RNAs interferentes. Mais preferencialmente, os polinucleotídeos com homologia de sequência nucleotidica de no minimo 70%, 71%, 75%, 79% ou 80% no gene precursor da tripsina, gene da N dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade 3 da ATP sintase ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina presentes em outros insetos e Helicoverpa armigera também estão incluídos na presente invenção, servindo como alvos para projetar RNAs interferentes. Ainda mais preferencialmente, os polinucleotídeos com homologia de sequência nucleotidica de no mínimo 83%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no gene precursor da tripsina, gene da N dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade 3 da ATP sintase ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina presentes em outros insetos e Helicoverpa armigera também estão incluídos na presente invenção, servindo como alvos para projetar RNAs interferentes.

[105] Com base em pesquisa extensa e exaustiva, os inventores verificaram que estas proteínas codificadas por genes alvo ou seus fragmentos desempenham papéis importantes em insetos. Quando elas são inibidas, recebem interferência ou são silenciadas, isto causará uma inibição significativa de crescimento de insetos ou uma diminuição significativa nas taxas de sobrevivência. Assim, uma pessoa pode projetar várias moléculas interferentes com base nestes genes alvo ou seus genes homólogos e seus fragmentos, que podem ser usados para controle de pragas.

[106] Os constructos podem ser projetados com base nas sequências dos genes avos acima ou em fragmentos de

30/63 gene, ou seus genes homólogos para expressar RNAs de fita dupla (dsRNAs) que interferem especificamente nas expressões dos genes de insetos em plantas. O comprimento dos ditos fragmentos de gene têm pelo menos 18 pb, preferencialmente pelo menos 20 pb, mais preferencialmente pelo menos 50 pb, ainda mais preferencialmente pelo menos 100 pb, mais preferencialmente de 100 a 700 pb, e mais

preferencialmente 200 a 600 [107] Por exemplo,	pb. o dito	fragmento de	gene	é
selecionado de: 1-576 pb	da SEQ ID	No: 1 (precursor	de
tripsina); 311-621 pb	de SEQ	ID No: 2	(dopa
descarboxilase); 297-771	pb da SEQ ID No: 3	(NADH
desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2); 203-630	pb	da
SEQ ID No: 4 (beta-ATP sintase); ou	372-662 pb da	SEQ	ID

No: 5 (cadeia pesada da miosina, isoforma B).

[108] A presente invenção também fornece um conjunto de polinucleotideos, o qual contém as seguintes sequências: SEQ ID NO: 1 ou seus 1-576 pb; SEQ ID NO: 2 ou seus 311-621 pb; SEQ ID NO: 3 ou seus 297-771 pb; SEQ ID NO: 4 ou seus 203-630 pb; ou SEQ ID NO: 5 ou seus 372-662 pb. Um ou mais polinucleotideos podem ser usados para preparar plantas transgênicas resistentes a insetos ou preparar moléculas interferentes de controle de pragas. Elas podem atingir um efeito mais amplo e mais eficaz para matar insetos, se forem usadas em conjunto.

CONSTRUCTOS [109] De acordo com as sequências de genes fornecidas pela presente invenção, os constructos de polinucleotideos de moléculas interferentes (tais como dsRNA) capazes de afetar a expressão de mRNA correspondente

31/63 em insetos, podem ser projetados e transformados em plantas para sequências. Assim, a presente invenção fornece um constructo feito artificialmente. Com base nas sequências de genes fornecidas pela presente invenção, o design de tais constructos é conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Geralmente, o dito constructo pode conter uma sequência de introns (não complementares com duas sequências flanqueadoras) e sequências de genes complementares que estão ligadas em duas extremidades do intron. Depois de transfecção para células, isto pode formar uma estrutura de haste e alça, na qual a região de haste pode ser processada por células vegetais para formar moléculas interferentes (tais como dsRNA). Este tipo de moléculas interferentes pode ser especialmente eficaz na inibição da expressão gênica alvo.

[110]

De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, o dito constructo contém pelo menos uma das seguintes estruturas:

Seqsense^-Seq_antisenseλ Formula I em que a Seq_sense θ a Seq_antisense são sequências de nucleotídeos basicamente complementares; depois de transf ectadas em plantas, as Seq_sense e Seq_antisense podem formar moléculas interferentes capazes de interferir especificamente com a expressão do gene de inseto;

X é uma sequência intermediária localizada entre a Seq_sense θ a Seq_antisense, θ a dita sequência intermediária não é complementar com as sequências Seq_sense θ Seq_antisense · [111]

A estrutura mostrada na fórmula I após ser transfectada em células vegetais forma uma estrutura secundária da seguinte forma:

32/63

Nas plantas, a estrutura é adicionalmente clivada e processada para serem moléculas interferentes (como dsRNA) que exibem efeito de silenciamento gênico.

[112] Os ditos constructos podem ser preparados para formar mais de uma estrutura de haste e alça, como contendo duas ou mais estruturas de haste e alça, as regiões de haste destas estruturas de haste e alça (formadas como resultado da interação entre as Seq_sense e Scqant isense) ·

MÉTODOS DE MELHORIA DA RESISTÊNCIA A INSETOS NAS PLANTAS [113] A presente invenção também fornece métodos para melhorar a resistência a insetos nas plantas, incluindo expressão de moléculas interferentes (tais como RNA de fita dupla (dsRNA)) que interfere especificamente com a expressão gênica do inseto em plantas; o dito gene de inseto é selecionado a partir do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e do gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina. Assim, depois os insectos ingerirem as plantas (plantas transgênicas), a dita expressão gênica do inseto é infrarregulada in vivo e o crescimento dos mesmos é inibido.

[114] Como modalidades preferenciais da presente invenção, as ditas modalidades incluem as etapas de: (a) fornecer o dito constructo; (b) transfectar o dito constructo em (A) em plantas, desse modo expressando as ditas moléculas interferentes (como dsRNA) incluídas nisso, as ditas moléculas interferentes podendo inibir a expressão

33/63 dos genes correspondentes em insetos que ingerem as plantas transgênicas, melhorando assim a capacidade resistente a insetos nas plantas.

[115] A transformação de plantas com DNA recombinante pode ser realizada através de técnicas convencionais bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica e métodos específicos dependem das espécies de plantas utilizadas. Por exemplo, pode-se usar a transformação de Agrobacterium tumefaciens ou métodos de transformação por pistola de genes, etc., como o método de disco de folha, método de transformação de embriões de arroz, etc. Para células, tecidos ou órgãos de plantas transformadas, os métodos convencionais podem ser usados para regenerar novas plantas.

[116] Geralmente, os ditos constructos estão localizados nos vetores de expressão. Assim, a presente invenção também inclui um tipo de vetores, que contém os ditos constructos. Os ditos vetores de expressão geralmente contêm ainda um promotor operavelmente ligado aos ditos constructos, origens de replicação e/ou genes marcadores, etc. Os vetores de expressão necessários na presente invenção podem ser construídos usando os métodos bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Estes métodos incluem técnicas de recombinação de DNA in vitro, técnicas de sintese de DNA, técnicas de recombinação in vivo, etc. Os ditos vetores de expressão incluem, preferencialmente, um ou mais genes marcadores de seleção, para fornecer características fenotipicas para selecionar as células hospedeiras transformadas, como resistência à canamicina, gentamicina, higromicina e ampicilina.

34/63 [117] Os vetores que abrigam as sequências de genes adequadas acima mencionadas são promotores ou sequências de controle adequados que podem ser usados para transformar hospedeiros apropriados. Nos métodos da presente invenção, os ditos hospedeiros podem ser quaisquer hospedeiros com os ditos vetores de expressão e também podem transferir os ditos vetores de expressão para células vegetais nos hospedeiros. Preferencialmente, o dito hospedeiro é Agrobacterium tumefaciens.

[118] Como uma modalidade preferencial, os ditos métodos de transferência de constructos em plantas incluem:

(1) fornecer Agrobacterium tumefaciens transportando o vetor de expressão, o dito vetor de expressão contendo o dito constructo;

(2) colocar em contato células, tecidos ou órgãos vegetais com Agrobacterium tumefaciens na etapa (1) transfectando assim o dito costructo em células, tecidos ou órgãos vegetais;

(3) selecionar as células, tecidos ou órgãos vegetais transfectados com os ditos constructos.

(4) regenerar as células, tecidos ou órgãos vegetais na etapa (3) nas plantas.

[119] A presente invenção também fornece um tipo de plantas, nas quais as moléculas interferentes que interferem especificamente com a expressão dos genes de insetos são expressas; ou os ditos constructos polinucleotidicos estão incluídos nelas. As ditas plantas são preparadas e obtidas usando os ditos métodos transgênicos.

VANTAGENS DA PRESENTE INVENÇÃO INCLUEM:

35/63 [120] (1) Resoluções técnicas da presente invenção usam plantas como intermediários para inibir o crescimento de insetos ou a sobrevivência dos mesmos por um mecanismo de interferência de RNA, e fornecem genes alvo de insetos adequados para interferência de RNA. Após a transferência para as plantas, os constructos projetados de acordo com aquelas sequências de genes, as moléculas interferentes formadas ingeridas pelos insetos são pouco afetadas, ou não são afetadas por barreiras, como o sistema digestivo, em insetos.

[121] (2) Os métodos da presente invenção podem melhorar a resistência a insetos nas plantas, reduzir a aplicação de pesticidas, reduzir o custo de produção agricola e proteger o ambiente ecológico.

[122] A presente invenção pode ser adicionalmente ilustrada por uma combinação das seguintes modalidades especificas. Deve ser compreendido que estas modalidades são usadas apenas para ilustrar a presente invenção e não para limitar o escopo da mesma. Condições experimentais detalhadas não fornecidas nas modalidades a seguir são geralmente realizadas de acordo com as condições convencionais, tais como aquelas descritas por Sapeka e Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^oed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press ou de acordo com as condições sugeridas pelos fabricantes. Salvo indicação em contrário, a porcentagem e a fração serão calculados por peso.

[123] A menos que seja definido de outra forma, todos os itens técnicos e científicos têm o mesmo significado bem conhecido pelas pessoas versadas na

36/63 técnica. Além disso, quaisquer métodos e materiais similares com ou idênticos ao conteúdo registrado podem também ser usados na presente invenção. Modaliddes e materiais preferenciais descritos neste documento são usados apenas para fins de demonstrações.

EXEMPLO 1, sequências de fragmentos usados para a construção de vetores de dsRNA [124] Usando a biblioteca de cDNA de H. armigera (ZAP express) (biblioteca de cDNA foi construída usando RNA total extraído do intestino médio de 5 larvas de H. armigera no estgio de desenvolvimento de instar alimentados com dieta artificial contendo 1 mg g-1 de gossipol durante um dia) como molde, 2 9 fragmentos de genes foram amplificados e usados para a construção dos vetores de expressão dsRNA, que são referidos como WXM-1 ~ WXM-29. Os genes relacionados com os fragmentos EST são mostrados neste documento na Tabela 2.

Tabela 2

WXM-1 Precursor da quimotripsina

WXM-2 Precursor da tripsina

WXM-5 Hormônio juvenil da diol quinase

WXM-6 Dopa descarboxilase

WXM-8 Subunit beta da ATP sintase

WXM-11 NADH-ubiquinona oxidorredutase

WXM-12 NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2 WXM-20 Precursor da subunidade alfa da ATP sintase mitocondrial

WXM-25 Beta da ATP sintase

WXM-27 Lipase-1

WXM-E Cadeia pesada de miosina, isoforma B

37/63 [125] Na presente invenção, as sequências de codificação do gene precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase e gene da isoforma da cadeia pesada B de miosina, bem como sequências de intron RTM são usadas. Nestas, as regiões cinza escuras indicam fragmentos usados para a construção de vetores de dsRNA.

[126] SEQ ID No: 1 (WXM-2, sequência codificadora do precursor da tripsina, GenBank: EE399600.1):

ACCCTACTATFGCGGCTCTTCTCTACACCTGGAACTGGAGCACCTACTGGCAGGCTTGCGGCGGTACCATCATCAACA ACCGCTCCATTCTTACCGCCGCTCACTGCACCCAAGGTGACGCCCCTGGCAGATGGCGTATCCGFGTTGGCTCCACC

TGGGCCMCAG£GGTGGCGn^C£ACMC<^M££T.Gtó£AT£GTÇ£ACC£CTCATA£M£TCCMCA£TCTGAAC MT.GACATÇGCTCTCCTS.ÇGCTCCGÇÇACCACCTrCTÇCTTCMÇMÇMC^GCMGCCGCTÇÇCATrGCÂGGCTCÇ AACTACAACCTTGCTGCCÃACCAGTTTGTCTGGGCTGCTGGATGGGGCACTATCTCCTCCGGTGGTGCTGCCTCCGÃ GCAACTCCGTCACGTGCAGCTGATTGTCATCAACC.AGAACACTTGTGCTAGCAACTACGCTTCTGCTGCTGTCACCAT .CACCMCMCATGn]Cn[G£ICÇGGCTGG^CGGCÇ^TGGTCGr.GAÇCA^GCCAGGGAGACTCGGGCGGTCCrÇTCT ACCACAA£GG£AT£GnGTCGGTGTCTGCrCCTrCGGTATTGGATGCGGTCTCGCTAACTTCCCTGCTGTGAACGCT CGCGTATCTCAGTACACCTCTrGGATCAACAGCAACGCTT.AAGAAGTGTAATGAGGAAATATATTGTTGATGATTTTA TGATATGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA [127] SEQ ID No: 2 (WXM-6, sequência codificadora da dopa descarboxilase, GenBank: EE399464.1):

AGGCCCCTTGGGCAAAAGTGGAACGTGTTCCAGCATGAACTTGTTGCGrGAGCCCAGCTTACGGATCCGCCTCATTG GCTGAATCGTAACTCATGAAGCGrGAAAGCGGATCTTCGATrCGATCCACACAAGTGATGCTCGrACTCGACTGTTCC GCCATGTGAGCTCAAAGAACGCGGTGGATCGTCGATGCTCAATGTCGATCCCTGTACTGAACACGACAGCAGGGATC AGCTCCAGACTACCGTCACTGGQAAATACCACTTGGACGTCGTTTCAGAGCGCTTAAGTTGTGGTTCCTTTTACGTCT CTATGGCGTGGAGAATÇTÇÇAGAAGCACATÇA(^AAÇACATTGCGCTrGCÇCATCTATTTGAAAAATTGTGCAGC<X; TGACGAAAGGTTCGAAATTTATGAAGÀAGrGACTATGGGACTTGtCTGCTnAGACTTAAAGGCGGTAACGAAAAGA AT^GGAAÇTGCTÇAGGCATATAÂATGGAAGAGGÇAA^lT£AT]TAGnC<nXCTAAGATCGAÇGAÇACATAÇTTÇC TT£GÂTTAGCMTnG£TCACGlTFCA£CGAAGATAGTGACATTÇATATATCTTGGGAGGAA<n7^GGCTGCTG£TG ATGATGTACTTAAAGGTCACTGAATCGCTTTGCATTTCAATATAATAGCAATAATrAGAGCCAAAACATAAATTAGAC AArAATGGTGrTÃrTTmTTAAAGGAGGAGAGAÂArGAGATATTTÂAAGATTATTAÂAATTTGATGGTATTTÂTTCT P\rA\>rvA r 1 «.Jx.· í zAV»· l I f xj i I l /ArAíAxJx^rAxO*j^s3rAK3/AfVxV>xJrAxjrA J fA. I < I rVAAvri I í rA 1 i /ArVArA t I < ΧΣνΑ i Cv { fA 1 < r ιΑ < 1 O 1 ATTTAGATGCACAGTATATGTAACTATGGTAACTGTGATAGAAAAATGTTTAGTAAAAGAATTGTAGTGCCGTTTGTG ACAATAAATATCTAAATAAGATGTCTTCTCCCGTAATTATTTATTATTACTGACAATAATAAAATGATTGTrCITTCCT ΑΤΠΤΑ GAAGAATATTTTTGTGTT GAATGTTATTTA ATAATrAGTTTTAATGTGACTA GATTAATTAATTTTGGTTCAT r\ I t > l HOrvAvAVA f rtl j l { | xj t Ό < J \^rA#A l xj I í ÍA l ι I rVA I HH J < I l { I x.J J x>rAX.· í /AxjrA I t JAVA I I fAJA ι í I 1 □kJ I I v»rA J [128] SEQ ID No: 3 (WXM-12, sequência codificadora da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, de 24

KDa, GenBank: EE399580.1):

38/63

CGCTAGCTGATACGCAGCTGATTACTTACTAGGAACAAAGCTGAGCTCGCCGCCCTGCAGTCGAATAGGGATCAAGA

ATCGCCACGAGGGITGCGACAGTGTTCGCATAITATTTCAATAAATCTAAACACAGATTTGTACATTACATGCTTTCA

GCTGAGGACTGGACTTCAGGGCGrGTGGCGTGCTGCATCCAGGACTATTCAGACCAGCTCAGCTCTTCAACATGACA

GTCTGTTCGTTCATCGTGATACTCCTGAGGACAACCGTGATATC.CCGTTCGAGTTTTCAGAGGC.CAACAAGAA<^.GA otggaagccttactaggmtccatcctg^

TCA^CTGGAGOTTGGCTGCÇGATATÇTGÇ^^

ATGAGGCTGCTACGHCTAÇACTATGnTATTAGAÇGAÇÇMTCGGCM.GTAÇÇATATÇÇAAGnTGCAÇGACAACTÇ

CTTGCTGGCTCCGAGGTTCTGATGCTATCCTGAAAGCTCrCACTGAGGGTACACAATGCCATGTTGGAGGAAACAGC

CCrTGTGGCAAGTTCTCTATTTCrGAGGTTGAATGCCTTGgFGCCTGTGTTAATGCTCCTATGATTCAAGrCAACGAT

GATTACTAÇGAAGAÇÇTGTÇAGrAGATGA«ÇAAAGGAAAnAnGAAAAGCTÇAÂAAGGGACGAGAAAÇÇGAAAGC

TGGCCCTAGGAGCGGCAGATTCGCCTCAGAACCCTTGGGAGGACTCACTTCTCTCACCGAAGAACCTACAGGCCCCG GnTrGGACTACAACCCGGCCTCAAG^CTAGAACAAAAAGTTTCCGTmGTAAATTTTATTTATAGGCAATATTTA AATAAATCATGTTAGAATCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA [129] SEQ ID No: 4 (WXM-25, sequência codifricadora da beta-ATP sintase, GenBank: EE399658.1):

ATAAAGTCTCACGGAGGTAGCAACAGGAAGAAATAAATGGFGGGFGCAAATAGrAGGCGATGCGTGGCCTGTGrCTG

TTGTTTATGCGAATTCAGCAACAATCAAGGCCCTGGGÀAAACTTAAAGAACCCTGCCCCCTGCCACCACCTCGCCCAT

TAGACCCCACCCCTTGFACTTTCCCGTGCCATrGCTGAGCTAGATATCTACCTTGCTGTGAACCCTCTGACTCCCACA TÇTGTATÇATGACCCMCATATGAGCTGA^^

ÇAÇTCÇAGGAÇAnAnGCTÂTÇÇTGGGTATGGATGAGnCTCTGMGMÇ^TAAGÇTGACTGTGGCTCGTGÇÇCGT

MGATCCAGAGGTTCnGTCTCAGCCTTTCCAGGrGGCTGAGGTGTTCACTGGACATGCTGGCAAACTGgrCCCCCT TGAGGAAACTATCAAGGGCTTCTUTAAAATCCTGCAG^CGAGrATGATCATCTACCFGAAGTAGCGTTCTACATGG nGGACCCAnGAGGAAGnSGGÇ^^

ÇAGGCAÇÇATrATAAATCCGTAATAAGTTGTTGGCACATCTATGCATGAGGGAGTTATGTTATTTCTAAATAAACTTA GTGGAAAATATCTATAAGAAAAAAAAAAAATATAAAAAAAAAAAAA [130] SEQ ID No: 5 (WXM-E, sequência codificadora da cadeia pesada de miosina, isoforma B, GenBank:

EE399482.1):

CGAAAGCTGCGAGACCTGGCATCCGTAGCCTTGGGCGAGCTTCAAAGAGCTTAGAGACTCCGAGGGGGAAGGCCAG AAGGGCAATGGTGACCCGCCGTCTGCGGACGAGCTGGCGGCGAACCAGGTCAAGCCCAGACCAGGAGAAACTCCGC AGGCCTTGÂACAAACAGATTCAGGAACTGCAGGrCAGGCTGGATGAGGCCTGAAGGCCAAACGCCTTAAGGGAGGCA GGAAGGGCCATCCAGAAACTGGAACAGAGGGTCAGGGAGCTCGAGAACGAGCTTGACGGTGAACAGAGGAGACACG

CTGACGCCCAGAAGAÂCCTCCGCAAGTCCGAGAGGCGCATCAAGGAGCTCACCTTTCCAGGCCGAG®ÍA^ei mÇCAÇGAGCGÇATGCAGGAÇCTÇGTM

CCGAAGAAATCGCCGCCCTCAACTTGGCTAAGTTCCGCAAGGCACAGCAGGAGTTGGAGGAGGCCGAGGAAAGGGC

AGACCTTGCCGAGCAGGCCATCAGCAAATFCCGTGGCAAGGGACGTGCGGGTTCCGCTGCGAGAGGAGTCAGTCCG ^GÇÇCCAGÇGCTÇGCGTÇÇCGCÇnCGÇTGAÇGGrQÇGGÇACÇnÇÇÇACCAAGGrTCGACCTGGCGCCCGAAGA TTTCTAAACGTTCCACTACAGAAAAAAAACGGACTGTACAGÂTTTTTCGTTGAAATGTAACTAATTTnTnTATACAT AGCAGrrGAAA.GTTACGAATGCGTGAAÀCGAAAAACTGTAAAAAAAAATTTTGTAAGCCAACAAAAAAAATATACACT

TrAGTGATCTMTCTnTTACGAAAGGCTATTTrGTAACTTGTTGATATTTATrrATATTATTTATrACCCTGGAGrAT GTATCGAGACTGCGAGGCCGCGAGAGACGCGCGTGAGCCGCGCGCGCGCATGTTCGACCGAGACACGCCCCCCACC

TCCGrACCGCCGCCGGCGCGCGCGCCTCrCTCGAACGCCTCATTTTGACATCTAATAAAGCGATATGGTTGFCATAAA atactaaaaaaaaaaaaaaaaaaa [131] SEQ ID No: 6 (intron RTM):

ACGFTGrAAGFCTATTmG^CRCTrnTTCTCCGrCACAATrTCTACTTCCAACTAAAATGCTAAGAACATGGTr

ATAACTTTTinTTATAACTTAATATGTGAnTGGACCCAGCAGATAGA [132] SEQ ID No: 3 (a segunda região de fragmento,

39/63

WXM-12(501), sequência codificadora da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, de 24 KDa, GenBank: EE399580.1 NADH desidrogenase)

CGCTAGCFGATACGCAGCTGATTACTTACTAGGAACAAAGCTGAGCTCGCCGCCCTGCAGTCGAATAGGGATCAAGA ATCGCCACGAGGGTTGCGACAGTGTTCGCATATTATTTCAATAAATCTAAACACAGATTTGTACATTACATGCTTTCA GCTGAGGACTGGAGTTCAGGGCGTGTGGCGIOCTGCATCCAGGAGTATTCAGACCAGCTCAGCTCTTCAACATGACA

GrCTCTTCGTTCATCGTGATACTCCTGAGGACAACCGTGATATCCCGTTCGAGTTTTCAGAGGCCAACAAGAAGAGA GTGGAAGCCTTACTAGGAATCCATCCTGAAGGCCACAAGCGTGGTGCCATGATCCCACTGCTCGACCTGGCTCAGCG TCAGGCTGGAGGTTGGCTGCCGATATCTGCCATGCATAAAGTAGCTGAAATCCTCAAACTTCCTCGCATGAGACTTT

ATGAGGTTGCTACGTTCTACACTATGTTTATTAGACGACCAATCGGCAAgrACCATATCCAAGTTTGCACGACAACTC CTTGCT^CTCCGAGGTTCT^TCCTATCCTWÍAGCTCfcÃHGÃG^ACÃCÃÃi^CÃfoTTC^^ÃÃÃCÃGC CcHCTGGCÃAGfeCTCTATTTCT<^GGHGÃATfecHGCTGCCTCTGUAÀTGCTCCTÃTGATTC.AAGTCMCGAT

GÃTTÃCTÃCG^GÃ^TgrcÃGFÃGÃTG^Ã£ÃÃÃGt^ÃÀTÍ^TTCÂÃMGCTCÂÃÃAG^ÃC^t^CCGÃÃÃGÍC

TGGCCCTAGGAGCGGCAGATrCGCCTCAGAACCCTrGGGAGGACTCACTFCTCTCACCGAAGAACCTACAGGCCCCG OTTTG^CTÃCMfe^ aataaatcatgttagaatcgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaa [133] SEQ ID No: 45 (WXM-corn, NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 ubiquinona flavoproteina 2,

GenBank: GH999345) GCACGAGGCGCTTGTTCGCGAACAGTGTTTCGCAATAACTTTTATAAAAATTACAAGAAAACAACAGTAAATCATGTT GrCCAGCCTCAGAACTGGAGTTCAGGGCTTGTGGCGCACTACTTCCAGGGCCCTGCAGACCAGCTCGACCCTGCAAC ATGACAGTCTTTTCGTCCACCGAGACACCCCTGAGGACAACCCTAACATACCGTTCGAGTTTACCCCACAGAACCAAA AGAGGGTGGAAGCACTCCTAGCAATTTATCCCGAAGGACACAAGAGAGGTGCCATGAITCCTCTACTGGACTTGGCC CAGCGTCAGGCAGGAGGCTGGCTGCCAATCTCCGCfeiTGCACAAACTAGCGGAAGrCCTCAATTTACCTCGCATGAG

CACTCCT'TGCTGGCTGAGGGGCTCGGACGCTGTGCTGAACGCTATCAAGGAAGCAACTGGCTGTGAAGTTGGAGGC AACAGCCCffGCGGAAAATTCTCCArifeTt^G^

MCGÃTGÃCTAnÃfeÃ^ACCTCTCCGrTGAAGACACAAAGGAAATTATCGAAAAGCTAAAGAAAGACGAAAAACCA TTACCGGGrCCCAGAAGCGGCAGGTTCGCATCCGAGCCTCTGGGAGGGCTCACGTCCCTCACGGAAGAACCCACGGG CCCCGGCTTCGGCGtACAAGACGCCCTGAAGGCCTAGGCAGATGTACATrGTTTTGTAATrTTATTTCATAGGTATTT AATAAATC.ATGTTAGATC [134] SEQ ID No: 46 (TRV1, proteina com 29 KD,

GenBank: AF166084)

TGGAAGACAAGTCATTGGTCACCTTGAAGAAGAAGACnTCGAAGTCTCÂAAATTCTCAÂATCTAGGGGCCATr GAATTGTTTGTGGACGGTAGGAGGM^GÃCCGÃÃGTÃlÜHcÃCÃGÃÃGÃÃGÃG^CrGfccfÃÂÃfcÃfÓffGG TGGGÂÃGÃAGÃCTGÃÃCÀCÃAOTrÃ^

GATÀcfoÃG<fi<^ÃCÃACTÀíbT<fi^

TTCGAGACTTACTGAG,AAAAGAAAGAGAGGAAAGACTATTCAGAGATrCAAAGCTCGAGCTrGCGATAACTGTTCAG fTGCGCACTAC^GGH^ATACAG^^^

GÁGGGCGrTCCGGTCTGTGACGGrACATACCCTTTCAGTATCGAAGTGTCGCTAATATGGGTTGCTACTGATTCGAC TAGGCGCCTCAATGTGGAAGAACTGAACAGnCGGATrACATTGAÂGGCGATTTTACCGATCAAGAGGTTnCGGTG AGTTCATGTCTTTGAAACAAGTGGAGATGAAGACGATTGAGGCGAAGTACGATGGTCCTTACAGACCAGCTACTACT AGACCTAAGFCATTATTGTCAAGTGAAGATGTTAAGAGÂGCGTCTAATAAGAAAAACTCGTCTTAA

EXEMPLO 2. Isolamento de fragmentos gênicos do precursor da tripsina, dopa decarboxilase, etc.

[135] Usando a biblioteca de cDNA de Helicoverpa armigera (ZAP express) (a biblioteca de cDNA foi construída usando RNA total extraido do intestino médio de 5 larvas de

40/63

H. armigera no estágio de desenvolvimento de instar alimentadas com dieta artificial contendo 1 mg g-1 de gossipol durante um dia) como molde, os fragmentos do precursor de tripsina, dopa amilase foram genes amplificados e usados para a produção dos vetores de expressão de dsRNA. A solução reacional de PCR compreende: 5 pL de lOx solução tampão, 2,5 pL de dNTP 10 mM, 2 pL de iniciador F, 2 pL de iniciador R, 2 pL de cDNA, 1 pL de enzima pfu, avolumado com água até 50 pL₀ A condição da PCR é de 94 °C durante 4 min, 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 2 min, 30 ciclos, 72 °C durante 10 min. Os fragmentos de DNA com tamanho esperado são coletados após eletroforese dos produtos de PCR.

[136] Usando wxm-12 de Helicoverpa armigera (NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2) como molde, a sequência de cDNA correspondente de Ostrinia nubilalis foi obtida através da busca de homologia contra o banco de dados EST de Ostrinia nubilalis , e foi nomeada como wxmcorn. O uso de EST de Ostrinia nubilalis biossintetizada como molde, para realizar a amplificação por PCR, e o produto de PCR amplificado foram usados para construir os vetores de expressão de dsRNA e os vetores VIGS. As condições de PCR são iguais às mencionadas acima.

[137] Os iniciadores específicos gênicos são os seguintes:

WXM-2, precursor da tripsina:

wxm-2-F-BamHI: CGGGATCCACCCTACTATTGCGGCTCTT (SEQ ID NO: 7) wxm-2-R-XbaI:CGTCTAGAAGGAGCAGACACCGACAA (SEQ ID NO: 8) wxm-2-F-Sad:CGGAGCTCACCCTACTATTGCGGCTCTT (SEQ ID NO:

41/63

9) wxm-2-R-NotI: CGGCGGCCGCAGGAGCAGACACCGACAA (SEQ ID NO:

10)

WXM-6, dopa descarboxilase:

wxm-6-F-BamHI: CGGGATCCTGTATGGCGTGGAGAATC (SEQ ID NO:

11) wxm-6-R-XbaI: CGTCTAGACAGCAGCAGCCTTTACTT (SEQ ID NO:

12) wxm-6-F-SacI: CGGAGCTCTGTATGGCGTGGAGAATC (SEQ ID NO:

13) wxm-6-R-NotI: CGGCGGCCGCCAGCAGCAGCCTTTACTT (SEQ ID NO:

14)

WXM-12, NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 wxm-12-F-BamHI: CGGGATCCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC (SEQ ID NO: 15) wxm-12-R-XbaI: CGTCTAGATTTCGGTTTCTCGTCCCT (SEQ ID NO: 16) wxm-12-F-SacI: CGGAGCTCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC (SEQ ID NO: 17) wxm-12-R-NotI: CGGCGGCCGCTTTCGGTTTCTCGTCCCT (SEQ ID NO: 18)

WXM-E Cadeia pesada de miosina, isoforma B wxm-E-F-BamHI: CGGGATCCGAGGACCGCAAGAACCAC (SEQ ID NO: 19) wxm-E-R-Xbal: CGTCTAGATGGGAAGGTGCCGAAA (SEQ ID NO: 20) wxm-E-F-SacI: CGGAGCTCGAGGACCGCAAGAACCAC (SEQ ID NO:

21) wxm-E-R-Notl: CGGCGGCCGCTGGGAAGGTGCCGAAA (SEQ ID NO:

22)

WXM-25, Beta-ATP sintase

42/63 wxm-25-F-BamHI: CGGGATCCCTACCTTGCTGTGAACCCTC (SEQ ID NO : 2 3) wxm-2S-R-Xbal: CGTCTAGAAATGGTGCCTGCCTCAAC (SEQ ID NO: 24) wxm-2S-F-SacI: CGGAGCTCCTACCTTGCTGTGAACCCTC (SEQ ID

NO: 25) wxm-2S-R-NotI: CGGCGGCCGCAATGGTGCCTGCCTCAAC (SEQ ID

NO: 2 6)

NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, a segunda região de WXM-12, WXM-12 (SGI):

wxm-12(501)-F-BamHI: CGGGATCCACCAATCGGCAAGTACCATA (SEQ ID NO: 47) wxm-12(501)-R-Xbal: CGTCTAGAAACGGAAACTTTTTGTTCTAGG (SEQ ID NO: 4B)

NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, genes homólogos de WXM-12 em Ostrinia nubilalis (WXM-corn):

wxm-corn-F-BamHI: CGGGATCCCTAGCAATTTATCCCGAAGG (SEQ ID NO: 4 9) wxm-corn-R-Xbal: CGTCTAGACAGGTCCTCATAATAGTCATCG (SEQ ID NO: 50)

EXEMPLO 3. Construção do vetor e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens

1. Construção do vetor [138] As estruturas dos vetores dsRNA foram como mostradas na FIGURA ia, incluindo o promotor CaMV35S do promotor de expressão vegetal, um fragmento de gene normal (ou seja, sentido, S) um intron do gene RTM de Arabidopsis thaliana (ou seja, intron, com cerca de 128 pb), um fragmento de gene reverso (ou seja, antissentido, AS) e um terminador NOS. Elas foram obtidas através da inserção da

43/63 sequência contendo o Sentido-íntron-Antissentido entre os sítios BamHI e Saci no vetor pCambia2301 (adquiridos junto à Cambia).

[139] Usando o genoma de Arabidopsis thaliana como modelo, usar primeiramente os iniciadores RTM+ específicos (5'-TCTAGAACGTTGTAAGTCTATTTTTG-3' (SEQ ID NO: 27)) e RTM(5'-GCGGCCGCTCTGCTGGGTCCAAATCACA-3' (SEQ ID NO: 28)) contendo Xbal e Notl para amplificar o íntron (cerca de 128 pb) do gene RTM de Arabidopsis thaliana (AT2G43730) usando a enzima de alta fidelidade pfu para amplificação por PCR, usando as enzimas de restrição Xbal e Notl para a dupla digestão dos produtos de PCR, e clonado entre Xbal e Notl nos múltiplos sítios de clonagem de pBSK (adquirido junto à Clontech).

[140] Usando a biblioteca de cDNA de Helicoverpa armigera como modelo e os pares de iniciadores geneespecíficos individuais contendo a enzima de restrição Notl e os sítios de corte Saci, conforme listado no Exemplo 2 (por exemplo, wxm-12-F-SacI e wxm-12-R-NotI para amplificar a NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2; wxm-6-FSacI e wxm-6-R-NotI para amplificar a dopa descarboxilase, etc.) com a enzima de alta fidelidade pfu para amplificação por PCR, clonados para obter os fragmentos correspondentes, usando Notl e o Saci para a dupla digestão dos produtos PCR e respectivamente inseridos entre os sítios de clonagem (NotI/SacI) no vetor pBSK contendo o íntron RTM.

[141] Da mesma maneira, usando os pares de iniciadores gene-específicos individuais contendo a enzima de restrição BamHI e Xbal os sítios de corte conforme listados no Exemplo 2 (por exemplo, wxm-12-F-BamHI e wxm

44/63

12-R-XbaI para amplificar a NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2; wxm-6-F-BamHI e wxm-6-R-XbaI para amplificar a dopa descarboxilase, etc.) com a enzima de alta fidelidade pfu para amplificação por PCR, clonaram respectivamente os fragmentos obtidos entre os sitios de clonagem BamHI e Xbal do pBSK acima mencionado com fragmentos reversos (AS) para obter os vetores de RNA de fita dupla.

[142] Usando HindIII e BamHI para unir o promotor CaMV35S do vetor pBI121 (comprado junto à Clonetech), usando Saci e EcoRI para unir o terminador NOS e inserindo separadamente nos sitios HindiII/BamHI, e os sitios SacI/EcoRI do vetor pCAMBIA2301, para obter o vetor contendo CaMV35S-NOS, denominado p35SNOS.

[143] Digerindo duplamente os vetores de RNA de fita dupla construídos com BamHI e Saci, digerindo duplamente, enquanto isso, o vector p35SNOS com BamHI e Saci, inserindo os fragmentos de fita dupla combinados com a enzima entre BamHI e Saci e respectivamente nomeados como dstripsina/2301, dsdopa/2301, dsNADH/2301 e ds ATP sintase beta/2301 e ds da cadeia pesada de miosina/23010.

2. Construção de vetores virais de dswxm-12/TRV2, dswxm-12(501)/TRV2 e dswxm-corn/TRV2 [144] O preparação de vetores virais direcionados para as sequências WXM-12 N WXM-12(501) e dswxm-corn. Usando pares de iniciadores gene-especificos contendo os sitios de corte BamHI e Xbal da enzima de restrição como listado no Exemplo 2 (tais como wxm-12(501)-F-BamHI: CGGGATCCACCAATCGGCAAGTACCATA (SEQ ID NO: 51) e wxm-12(501)R-Xbal: CGTCTAGAAACGGAAACTTTTTGTTCTAGG (SEQ ID NO: 52))

45/63 para obter fragmentos alvos por amplificação por PCR. Recuperação dos fragmentos alvo e dupla digestão dos mesmos com BamHI e Xbal. Ligar os fragmentos do produto duplamente digerido recuperado com o vetor pYL156 (Figura lb, obtido pela Universidade de Zhejiang) para obter os vetores alvo, e denominados dswxm-12/TRV2, dswxm-12 (501)/TRV2 e dswxmcorn/TRV2, respectivamente.

2. Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens [145] A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi realizada através do método de congelamento e descongelamento. A Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (denominada US7321031) pode ser usada como a cepa de Agrobacterium. Colocar o dito vetor de expressão vegetal construído e 50 pL/tubo de células competentes em gelo durante 30 minutos e congelar rapidamente em nitrogênio líquido durante 1 minuto. Fundir a solução de bactérias em banho-maria a 37 °C durante 5 minutos, adicionar 1 ml de meio de cultura LB, a 28 °C, 220 rpm e incubar durante 2 a 4 horas. Coletar 50 a 100 pL e espalhar em meio de cultura LB (25 mg/L de rifampicina, 50 mg/L de canamicina e 100mg/L de estreptomicina), dois dias depois, selecionar uma única colônia bacteriana para detecção de PCR.

Exemplo 4. Triagem para plantas geneticamente transformadas e progenias transgênicas

Transformação e triagem de Arabidopsis thaliana [146] Arabidopsis thaliana (ColO) é transformada através do método de imersão floral (Clough e Bent, 1998, Plant J. 16, 735-743) . Inocular uma única colônia bacteriana LBA4404, contendo o vetor binário em 3 mL de meio de cultura LB ml (contendo 25 mg/mL de Rif, 25 mg/mL

46/63 de Str e 50 pg/mL de Kan) , cultivar a 28 °C e 220 rpm durante 12 horas. Inocular a solução bacteriana em meio de cultura LB de 50 ml (25 Mg/ml Rif, Str de 25 Mg/ml e 50mg/ml Kan), cresce a 28° C, 220 rpm, por 12 horas. Inocular 50 mL da solução bacteriana em 250 mL de meio de cultura LB (25 Mg/ml de Rif, 25 Mg/ml de Str e 50mg/ml de Kan), cultivar a 28 °C, 220 rpm durante 12 horas.

[147] Centrifugar a solução de bactérias a 5000 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos e remover o sobrenadante. Ressuspender as bactérias em 300 mL de solução de sacarose a 5% contendo Silwet L-77 a 0,02%. Mergulhar a parte floral dos clones da planta Arabidopsis thaliana em solução de bactérias durante 5 segundos, colocar dentro de recipientes de plástico, manter humedecido e no escuro durante 16 a 24 horas e, em seguida, cultivar em estufa até a floração e produção de sementes.

[148] Vernalizar as sementes coletadas da geração To a 4 °C durante 2 dias. Tratar com de água de branqueamento a 20% durante 15 minutos, lavar com água estéril de 3 a 4 vezes. Resuspender as sementes em 0,5% de agarose (55° C) , espalhar em 0,8% de meio de cultura ágar contendo MS (contendo 50 mg/mL de Kan) a 22 °C, cultivar sob a condição de iluminação continua durante cerca de 1 semana. Cultivar os brotos verdes resistentes transplantados para solo nutriente (turfa:vermiculita: perlita = 1:1:1) .

2. Transformação e triagem do algodão [149] A. tumefaciens contendo o plasmideo dswxm12/2301 foi cultivado em meio YEB (50 mg/L de canamicina, 25 mg/L de rifampicina e 25 mg/L de estreptomicina) durante

47/63 a 3 dias. Uma única colônia bacteriana foi inoculada em meio de cultura liquido YEB contendo os mesmos antibióticos e foi incubada em um agitador a 200 rpm e 2 8 °C de um dia para o outro. Após centrifugar a 4000 rpm durante 10 min, o precipitado foi ressuspenso com 1/2 meio liquido MS contendo 30 g/L de glicose e 100 Mmol/L de acetossiringona, a OD600 foi ajustada até cerca de 0,4 a 0,6 e serviu como uma solução de infecção pronta para uso.

[150] Algodão R15 (algodão de planalto convencional, originário do Cotton Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, com referência a Shangguan Xiaoxia, Li Yane, Liang Yunsheng, Wu Xia, Du Qiufang, Zhang Linshui, Correlation between Expression of GUS Gene and NPTII Gene and Their Application in the Detection of Transgenic Cotton, Cotton Science 2007 19(3)). Colocar as sementes, após rotineira desinfecção, em 1/2 meio de cultura MS0 (l/2sal MS + 5 g/L de glicose + 7g/L de ágar em pó, pH 6,0), cultivar e germinar no escuro, após 5 a 7 dias, cortar o cauliculo das mudas desinfectadas em fragmentos com cerca de 1,0 cm e servir como explantes transgênicos prontos para uso.

[151] Imergir e infectar os explantes em solução de Agrobacterium tumefaciens durante 15 a 20 minutos, transferir para o meio de cultura MSB1 (sal MS + B5 orgânico + 30 g/L de glicose +0,1 mg/L de KT + 0,1 mg/L de 2,4-D +2,2 g/L de Gelrite, pH 6,0), após 2 dias de cultura no escuro a 22 °C, transferir os explantes para o meio de cultura MSB2 (MSB1 + 500 mg/L de cefalosporina + 80 mg/L de canamicina) para induzir os calos. Após os explantes induzidos por resistência do calo, proliferação dos calos e

48/63 calos embriogênicos (meio de cultura MSB3: MS sal + B5 orgânico + 30 g/L de glicose +2,5 g/L de Gelrite, pH 6,0), ocorre a embriogênese somática (meio de cultura MSB4: MS sal + B5 orgânico + 30 g/L de glicose + 1,0 g/L de ácido asparagínico + 2,0 g/L de glutamina + 3,0 g/L de Gelrite, pH 6,0; dobrar a quantidade de KNO3 no sal MS e remover o NH4NO3) , regenerar as plantinhas do tubo de ensaio resistentes. Quando as plantinhas do tudbo de ensaio crescem até 3 a 4 folhas verdadeiras, as mesmas são transplantadas para vasos de flores e crescer em câmaras de clima artificial.

[152] Após a triagem, a transformação do algodão com os vetores dswxm-12/2301 produz 11 cepas e 15 plantas transgênicas capazes de produzir sementes.

3. Infecção VIGS do tabaco [153] Uso do sistema de vírus do rattle do tabaco (TRV) obtido pela Universidade de Zhejiang, incluindo os vetores virais pYL156 e pTRVl e os vetores controle PDS/TRV2 descritos no exemplo 3. A aplicação do presente sistema refere-se aos protocolos atuais em microbiologia (2006) 161.6.1-161.6.13. A sequência completa do RNA-1 do vírus do rattle do tabaco (TRV1, GenBank: X06172.1; cds completas de fitoeno dessaturase de Nicotians benthamiana (PDS) GenBank: EU165355.1).

[154] A cultura de Agrobacterium tumefaciens carregando pTRVl com, respectivamente, um único clone de Agrobacterium tumefaciens contendo dswxm-12/TRV2s, dswxm12(501)/TRV2s, dswxm-corn/TRV2 e controle PDS/TRV2 em meio de cultura líquido LB (25 mg/L de rifampicina, 50 mg/L de canamicina e 25 mg/L de estreptomicina) de um dia para o

49/63 outro usa o líquido transf ectante VIGS (MES 10 mM , cloreto de magnésio 10 mM, acetossiringona 0,1 mM) para ajustar a OD até 2,0. Após deixar em repouso em temperatura ambiente durante 4 a 6 horas, misturar TRV1 e Agrobacterium tumefaciens contendo o gene alvo pTRV2 na proporção de 1:1 e usar o injetor para injeção de infiltração nas folha de tabaco. Após cultivar o tabaco inoculado a 21 °C durante 7 dias, usar Agrobacterium tumefaciens contendo o gene PDS do tabaco como controle positivo (branquemento das folhas recém-desenvolvidas) para determinar o estágio de infecção e a eficiência da infecção. As folhas recém-desenvolvidas do tabaco infectadas pelo vírus PDS/TRV2 de controle ficaram brancas (indicando infecção bem sucedida). O uso das folhas recém-desenvolvidas de tabaco foram infectadas por vírus dswxm-12/TRV2, dswxm-12 (501)/TRV2 e dswxmcorn/TRV2 para testes com insetos.

Exemplo 5. Identificação molecular de plantas transgênicas

1. Identificação de Arabidopsis thaliana transgênica [155] Neste exemplo, em relação a cada um dos vetores preparados mencionados acima (dstripsina/2301N, dsdopa/2301N, dsNADH/2301s, ds beta-ATP sintase/2301 e ds cadeia pesada da miosina/2301) , através de triagem, foram obtidos mais de 10 clones de clones de Arabidopsis thaliana transgênicos no Exemplo 3 (cada clone denominado: dsNADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2, ds precursor da tripsina, ds dopa descarboxilase, ds beta-ATP sintase e ds cadeia pesada da miosina; e em relação ao mesmo tipo de clines vegetais sequencialmente indicados por -1 , -2...) e o método de coloração GUS foi utilizado para verificar os

50/63 clones vegetais. Uma vez que o vetor pCAMBIA 2301 em si transporta o gene GUS, então, pela detecção da presença de GUS em clones de plantas, os resultados de identificação podem ser obtidos.

[156] Os materiais vegetais são imersos em solução de coloração GUS, a 37 °C durante 12 a 24 horas. Eles são descorados em etanol a 70% e conservados em etanol a 70%. A solução de coloração GUS (tampão fosfato 100 mM, pH 7,0, K₃[Fe(CN)₆] 5 mM, K₄ [Fe (CN) ₆] 5 mM, EDTA 10 mM, X-Gluc 1 mM, Triton X-100 0,1%) D0

2. Identificação de algodão transgênico [157] A extração de DNA é realizada com o seguinte método: medição de 0,5 g de folhas de algodão transgênicas, trituração das mesmas até a pulverização em nitrogênio liquido, transferência do pó para um tubo de centrifuga de 8 mL, adição de 5 mL de tampão de moagem (glicose 1 M, ácido cítrico 0,1 M, Triton X-100 5% (pH 5,0)) e misturação. Centrifugar a mistura a 1000 g durante 10 min a 22 °C, coletar o precipitado, ressuspendê-lo no tampão de moagem e centrifugar novamente. Repita os processos 3 vezes até o aparecimento de precipitados branco cinzentos. Lavar os precipitados com 5 mL de tampão de lavagem (glicose 0,5 M, ácido cítrico 0,05 M (pH 5,0)). Centrifugar a mistura a 1000 g durante 10 min a 22 °C e remover o sobrenadante. Repetir os processos durante 2 a 4 vezes até os precipitqados terem o aspecto branco leitoso. Adicionar 5 mL de tampão de lise (SDS 1%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,1 M (pH 8,3)) e lisar os precipitados em um banho-maria a 60 °C durante 15 min. Centrifugar a 5000 g durante 10 minutos a 22 °C e recolher o sobrenadante. Adicionar dois volumes de

51/63 álcool etílico anidro e centrifugar a 10.000 g durante 5 min a 4 °C. Descartar o sobrenadante, secar por sopro os precipitados, dissolver os mesmos em 2 mL de solução 0,lxSSC e centrifugar a solução para remover o material insolúvel após dissolução suficiente. Adicionar NaCl para obter uma concentração final de 1M (cerca de 0,058 g NaCl/mL de 0,lxSSC (NaCl 0,015 M, citrato de sódio 0,015 M)). Adicionar igual volume de clorofórmio:álcool isopentilico (24:1) e misturar bem. Centrifugar a solução a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C e coletar o sobrenadante. Repita a extração mais uma vez. Adicionar duas vezes o volume de álcool etilico anidro ao sobrenadante, deixando-o em repouso a -20 °C durante 10 min e centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Dissolver os precipitados em 0,lxSSC. Medir a razão de OD 260/280, que normalmente está na faixa de 1,8 a 2,0. Concentração (mg/mL) de DNA = 50 x A260 x fator de diluição [158] Os iniciadores para a detecção de PCR são wxm-12-F e wxm-12-R. Suas sequências são: wxm-12-F-BamHI: CGGGATCCCAACAAGAAGAGAGTGGAAGC (SEQ ID NO: 15) wxm-12-RXbal: CGTCTAGATTTCGGTTTCTCGTCCCT (SEQ ID NO: 16) [159] As condições reacionais de PCR são: desnaturação inicial durante 5 min a 94 °C; em seguida, pré-desnaturação durante 30 s a 94 °C, renaturação durante 30 s a 55 °C, extensão a 72 °C durante 30 s, por um total de 30 ciclos. A extensão final a 72 °C durante 10 min. O fragmento amplificado possui tamanho de cerca de 500 pb.

[160] A Figura 3A mostra os resultados das análises de DNA dos algodões transgênicos (R15, 9, 10, 15, 16, 21, 22, 27, 145-1, 145-2, 145-3, 165-1, 165-2) de

52/63 dswxm-12/2301.

[161]

R15 é um material aceptor de algodão transgênico. As raias com bandas específicas indicam algodões contendo o vetor dswxm-12/2301.

Exemplo 6: Avaliação dos niveis de expressão dos RNAs de fita dupla 1 Extração do RNA de Arabidopsis thaliana [162]

Coletar material de Arabidopsis thaliana transgênica (cerca de 100 mg) e triturá-lo completamente em nitrogênio liquido. Transferir o mesmo para um tubo de centrifuga de 1,5 mL, adicionar lmL de Trizol (Invitrogen, No. Cat. 15596-018), misturar bem e deixar em repouso em temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicionar 200 pL de triclorometano, misturar bem e centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min. Coletar o sobrenadante e adicionar 500 pL de isopropanol ao sobrenadante, misturar bem e centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min. Os precipitados são lavados com etanol a 70%, secos sob vácuo e dissolvidos em 20 a 50 pL de HpO (RNase livre).

2. Extração de RNA de algodão [163]

Os métodos para a extração de RNA de algodão são os seguintes: moer o material de algodão em nitrogênio liquido, adicionar 1 mL de solução de extração de DNA préaquecida a cada 200 mg de material (Tris 0,2 M, pH 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 1 M, CTAB 1% e p-mercaptoetanol 1%) e manter a 65 °C durante 30 minutos. Adicionar 0,6 mL de clorofórmio e extrair duas vezes. Adicionar LiCl ao sobrenadante até uma concentração final de 2 M. Deixar em repouso a -20 °C durante 3 horas.

Centrifugar a 13000 g durante 10 minutos. Os precipitados são lavados com etanol a 70% uma vez,

53/63 dissolvidos em água e armazenados a -20 °C.

3. Extração de RNA de tabaco [164] Os métodos para a extração de RNA de tabaco são os seguintes: moer as folhas novas de tabaco infectadas pelo virus em nitrogênio liquido, adicionar 1 mL de solução de extração de RNA pré-aquecida a 65 °C a cada 200 mg de material (Tris 0,2 M, pH 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 1 M, CTAB 1% e p-mercaptoetanol 1%) e manter em repouso a 65 °C durante 30 minutos.

[165] Adicionar 0,6 mL de clorofórmio e extrair duas vezes. Adicionar LiCl ao sobrenadante até uma concentração final de 2 M. Deixar em repouso a -20 °C durante 3 horas e centrifugar a 13000 g durante 10 min. Os precipitados são lavados com etanol a 70% uma vez, dissolvidos pela adição de água e armazenados a -20 °C.

4. Análise de Northern blot dos niveis de expressão de RNAs de fita dupla [166] Adicionar 5 x tampão de amostra de RNA e 10 x de tampão de carregamento de eletroforese de DNA (formaldeido) à amostra de RNA. Misturar bem, manter a 65 °C durante 10 min e, em seguida, resfriar em gelo.

[167] A quantidade de amostra adicionada a cada raia é de 15 pg de RNA total, e a análise de eletroforese é realizada em gel de desnaturalização de formaldeido. A eletroforese usa gel de agarose desnaturante, 1 x MOPS de solução tampão de eletroforese, a intensidade do campo elétrico é de 8 V/cm. A eletroforese é interrompida quando o corante azul de bromofenol se move até 2/3 do comprimento do gel. ddH2O é usado para lavar o gel e, em seguida, deixado equilibrar em 20xSSC durante 40 min. Uma plataforma

54/63 de transferência é construída e o RNA é transferido para a membrana de náilon Hybond-XL (Amersham, Cat. No. RPN303S) (cerca de 18 h) pelo método capilar em 10 x SSC de tampão de transferência. Após a transferência, marcar as posições dos poços na membrana com um lápis e cortar o canto esquerdo superior como um criador forjador. As membranas são lavadas rapidamente com 6 x solução de SSC, reticuladas por UV (120 mJ) , colocadas entre dois pedaços de papéis de filtro e aquecidas até 80 °C durante 2 h. As membranas são vedadas e guardadas para uso posterior.

[168] Rótulo da sonda: 25 ng de produto de PCR purificado medido como um molde para rotulagem (uso dos primers wxm-12-F e wxm-12-R para amplificar o fragmento de NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2. O comprimento da sonda é de 475 pb. Os iniciadores wxm-2-F e wxm-2-R são usados para amplificar o fragmento do precursor de tripsina). O sistema de marcação Prime-a-Gene (Promega, No. Cat. U1100) foi usado para rotular as sondas em banhomaria a 37 °C durante 1 hora. As sondas marcadas foram colocadas em água em ebulição durante 5 min e foram, em seguida, imediatamente colocadas em gelo para uso posterior.

[169] A pré-hibridização e a hibridização foram realizados com o sistema ExpressHyb da Clontech: colocar uma membrana de náilon em um tubo de hibridização, molhar o mesmo com 6xSSC e certificar-se de que não há nenhuma bolha entre a membrana e a parede do tubo. Descartar o tampão de 6xSSC e adicionar 5 mL de solução de hibridização. A pré-hibridização é realizada durante 60 min a 37 °C. Após a pré-hibridização, substituir a solução de

55/63 hibridização com 5 mL de solução de hibridização fresca, adicionar a sonda, misturar e deixar hibridizar de um dia para o outro.

[170] Lavar a membrana e a pastilha: após a hibridização, descartar a solução de hibridização. Lave a membrana duas vezes com 2x SSC, SDS a 0,05%, durante 5 minutos a cada vez. A membrana é ainda lavada mais duas vezes com 0,2xSSC, SDS a 0,1%, 20 minutos durante cada vez. A membrana é envolta com um filme plástico e fixada com uma fita. Uma triagem de intensificação e um filme de raio-X são pressionados contra a membrana e deixados a -70 °C durante 2 dias. O filme foi desenvolvido com a solução de desenvolvimento D-72.

[171] A Figura 2a mostra os resultados da análise de Northern blot dos niveis de expressão da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 dsRNA em Arabidopsis thaliana transgênica. WT representam o controle

da planta tipo	selvagem	e as	raias com as bandas
representam a	expressão	do	dsRNA nas plantas
correspondentes . 5. Detecção	por RT-PCR	dos	niveis de expressão dos

RNAs de fita dupla [172] Diluir adequadamente a amostra de RNA com água isenta de RNase e medir o valor de absorção de UV nos comprimentos de onda entre 200 nm e 300 nm. Concentração de RNA = 40 pg/mL x A2 60 x fator de diluição. Usar o Kit de PCR de RNA (Takara) para realizar a transcrição reversa. O sistema reacional é conforme descrito nas instruções para o kit. Adicionar 1 mg de RNA total em um sistema reacional de 20 pL e realizar a reação durante 40 minutos a 42 °C para

56/63 sintetizar a primeira fita. 0 sistema reacional de PCR é o seguinte: 2 mL de lOxtampão, 0,5 mL de dNTP lOmM, 1 mL de inicidor F, 1 mL de iniciador R, 0,5 mL de cDNA, 0,2 mL da enzima ExTaq e água é adicionado para avolumar até 20 mL. As condições de reação de PCR são: 94 °C, 4 min; 94 °C, 30s; 55 °C, 30s; 72 °C, 30s; para 30 ciclos, seguido por 72 °C, 10 min. Os produtos da PCR são detectados por eletroforese. As sequências do iniciador F e do iniciador R que correspondem a cada gene são mostradas na tabela 3.

Tabela 3. Informações dos iniciadores para cada gene

Nome do gene	Nome do iniciador	SEQ ID NO:	Sequência do iniciador
precursor da tripsina	wxm-2-F	29	ACCCTACTATTGCGGCTC TT
wxm-2-R	30	AGGAGCAGACACCGACAA
dopa descarboxilase	wxm-6-F	31	TGTATGGCGTGGAGAATC
wxm-6-R	32	CAGCAGCAGCCTTTACTT
NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2	wxm-12-F	33	CAACAAGAAGAGAGTGGA AGC
wxm-12-R	34	TTTCGGTTTCTCGTCCCT
Cadeia pesada de miosina, isoforma B	wxm-25-F	35	CTACCTTGCTGTGAACCC TC
wxm-25-R	36	AATGGTGCCTGCCTCAAC
Beta da ATP sintase	wxm-E-F	37	GAGGACCGCAAGAACCAC
wxm-E-R	38	TGGGAAGGTGCCGAAA
NADH desidrogenase ubiquinona	wxm-12(501)-F	39	ACCAATCGGCAAGTACCA TA
wxm-12(501)-R	40	CTAGCAATTTATCCCGAA

57/63

flavoproteina 2			GG
NADH desidrogenase ubiquinona	wxm-corn-F	41	CTAGCAATΤTATCCCGAA GG
wxm-corn-R	42	CAGGTCCTCATAATAGTC ATCG
flavoproteina 2 de Ostrinia nubilalis
TRV1, proteina de 29 KD	TRV1-F	43	C Τ T GAAGAAGAAGAC Τ Τ T CGAAGTCTC
TRV1-R	44	CAACCCACCTTCCAGACA

[173] A Figura 2B mostra os resultados da detecção por RT-PCR dos niveis de expressão de dsRNA contendo a sequência de NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em Arabidopsis thaliana transgênica. WT representa a controle da planta tipo selvagem e as raias com as bandas representam a expressão do dsRNA na planta correspondente.

[174] A Figura 2C mostra a análise de Northern blot dos niveis de expressão de dsRNA contendo a sequência precursora da tripsina em Arabidopsis thaliana transgênica. WT representa o controle da planta tipo selvagem e a raia com as bandas representa a expressão do dsRNA nas plantas correspondentes.

[175] A Figura 2D mostra resultados da detecção por RT-PCR da expressão de Arabidopsis thaliana transgênica contendo a dopa descarboxilase. WT representa o controle da planta tipo selvagem e as raias com as bandas especificas representam a expressão do dsRNA na planta correspondente.

[176] A Figura 2E mostra os resultados da detecção

58/63 por RT-PCR da expressão de Arabidopsis thaliana transgênica contendo a beta-ATP sintase. WT representa o controle da planta tipo selvagem e as raias com as bandas específicas representam a expressão do dsRNA na planta correspondente.

[177] A Figura 2F mostra os resultados da detecção por RT-PCR da expressão de Arabidopsis thaliana transgênica contendo cadeia pesada de miosina. WT representa o controle da planta tipo selvagem e as raias com as bandas específicas representam a expressão do dsRNA na planta correspondente.

[178] A Figura 3B mostra os resultados da detecção por RT-PCR da expressão de algodão transgênico (10, 16, 21, 27, 145-1, 165-1) contendo NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteína 2.

[179] As raias com bandas específicas representam a expressão do dsRNA nas plantas correspondentes.

[180] A Figura 3C mostra resultados da detecção de RT-PCR de cinco tabacos aleatórios infectados por vírus

(CK, 1, 2, 3, 4,	5) . As	raias	com bandas específicas
representam a	expressão	do	TRV1 nas plantas
correspondentes .
Exemplo 7.	Detecção	dos	efeitos das plantas

transgênicas expressando dsRNA sobre o crescimento de Helicoverpa armigera e Ostrinia furnacalis.

1. Extração do RNA de Helicoverpa armigera e Ostrinia furnacalis [181] Coletar o intestino médio de Helicoverpa armigera ou Ostrinia furnacalis (cerca de 100 mg) colocar o mesmo em nitrogênio líquido e moer. Transferir o pó para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicionar 1 ml de trizol

59/63 (Invitrogen, No. Cat. 15596-018), misturar bem e manter em temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min e descartar os precipitados. Adicionar 200 pL de triclorometano no sobrenadante, agitar sob vórtex e centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min. Coletar o sobrenadante, adicionar 500 pL de isopropanol para precipitar o RNA, centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos, lavar os precipitados com etanol a 70%, secar sob vácuo e dissolver em 20 a 50 pL de H₂O (RNase livre).

[182] Diluir o RNA com uma quantidade apropriada de água isenta de RNase e medir os valores de absorção de UV em um comprimento de onda entre 200 nm e 300 nm. Concentração de RNA = 40 pg/mL x A260 x fator de diluição.

[183] Usar a RT-PCR para detectar os niveis de expressão gênica das amostras de DNA do intestino médio. A transcrição reversa usa o kit de RNA PCR (Takara) . O sistema reacional é realizado conforme descrito nas instruções para o kit. Adicionar 1 pg de RNA total em um sistema reacional de 20 pl e deixar reagir durante 40 minutos a 42 °C para sintetizar a primeira fita. O sistema reacional de PCR é o seguinte: 2 pL de lOxtampão, 0,5 pL de dNTP 10 mM, 1 pL de iniciador F, 1 pL de iniciador R, 0,5 pL de cDNA, 0,2 pL de enzima ExTaq e adicionar uma quantidade adequada de água para avolumar até 20 pL. As condições de reação de PCR são: 94 °C, 4 min; 94 °C, 30s; 55 °C, 30s; 72 °C, 30s; para 30 ciclos, seguido por 72 °C durante 10 min. Os produtos da PCR são avaliados por eletroforese. As sequências do iniciador F e do iniciador R que correspondem a cada gene são mostradas na tabela 3.

2. Efeito da expressão do dsRNA das plantas

60/63 transgênicas sobre o crescimento de Helicoverpa armigera e Ostrinia furnacalis [184] coletar 3 larvas de H. armigera no estágio de instar que cresceram de modo idêntico (6 Helicoverpa armigeras em cada grupo, em triplicata, por um total de 18 Helicoverpa armigeras) e alimentar, separadamente, alimentá-las com Arabidopsis thaliana não transgênica WT ou com Arabidopsis thaliana transgênica transfectada com dstripsina/2301 dsdopa/2301, dsNADH/2301, ds beta-ATP sintase beta/2301 ou ds cadeia pesada da miosina/2301. Depois de 3 a 7 dias, pesar as mesmas, calcular o aumento dos pesos e calcular o aumento médio como os valores do eixo y. Avaliar os aumentos de peso de Helicoverpa armigera e dissecá-los para coletar os intestinos médios. Preparar RNA usando o método descrito no Exemplo 1 e usar RT-PCR para avaliar a expressão dos genes correspondentes. Os resultados mostram que a transcrição do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 nos intestinos médios de Helicoverpa armigera, alimentando-se de Arabidopsis thaliana transgênica dsNADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 ubiquinona flavoproteina 2-2 (linhagem dsWXM-12 2; 12-2) e dsNADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 ubiquinona flavoproteina 2-18 (dsWXM-12 linhagem 18; 12-18) é inibida, em comparação com a alimentação de Helicoverpa armigera (controle) com Arabidopsis thaliana tipo selvagem e seus crescimentos são mais lentos, consulte as Figuras 4S Fig. 5. Helicoverpa armigera se alimentando com Arabidopsis thaliana no ds precursor de tripsina 4 (dsWXM-2 linha 4; 2-4), ds dopa descarboxilase-2 (dsWXM-6 linha 2; 6-2), ds ATP sintase

61/63 beta-2 (dsWXM-25 linha 2; 25-2) e ds cadeia da miosina pesada 2 (dsWXM-E, linha 2; E-2) crescem mais lentamente em comparação com aqueles (controles) alimentando-se da Arabidopsis thaliana tipo selvagem, consulte a Figura 4, Figura 5.

[185] Coletar 2 larvas de H. armigera em estágio de instar aproximadamente identicamente crescidas (6 Helicoverpa armigeras em cada grupo, em triplicata, para um total de 18 Helicoverpa armigeras) e alimentá-las separadamente com algodão não transgênico R15 (CK) ou algodão transgênico dswxm-12/2301 durante 5 dias. Em seguida, contar as taxas de morte. Realizar esses experimentos independentemente duas vezes. Os resultados são mostrados nas Figuras 6A e 6B. Pode ser observado que após a alimentação em dswxm-12/2301 durante 5 dias, a mortalidade de Helicoverpa armigera se alimentando do algodão transgênico é significativamente maior do que a da

alimentação	do controle em	materiais de	algodão não
transgênicos [186]	(ck) . Coletar larvas	de H. armigera	crescidas de
forma idêntica no estágio	de 3-instar (6	Heiicoverpa

armigeras em cada grupo em triplicata, por um total de 18 Helicoverpa armigeras) e alimentá-las separadamente com tabaco WT não transgênico, ou tabaco VIGS transgênico infectado com virus dswxm-12/TRV2 ou tabaco VIGS transgênico infectado com o virus dswxm-12(501)/TV2 durante

5 dias.	Pesá-los	e calcular o	aumento	de	peso. Obter os
aumentos	médios	como valores	do eixo	y ·	Os resultados
mostram	que as	taxas de aumento de peso	de Helicoverpa

armigera que se alimentam de tabaco infectado com o virus

62/63 dswxm-12/TRV2 ou dswxm-12(501)/TRV2 são mais lentos que aqueles alimentados com a variedade tipo selvagem (como mostra a Figura 6C e 6D) . Dissecá-los para recolher os intestinos médios, extrair o RNA de acordo com o método do Exemplo 1 e realizar o RT-PCR para avaliar a expressão dos genes correspondentes. Os resultados mostram que a transcrição do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em intestinos médios de Helicoverpa armigera alimentados com folhas de tabaco transfectadas com dswxm-12/TRV2 ou dswxm-12(501)/TRV2 durante 3 dias é significativamente menor do que os insetos alimentados com a variedade tipo selvagem (Figuras 7a e 7B). Esses resultados mostram que a transfecção de dsRNA que pode diminuir a transcrição do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 de Helicoverpa armigerds em tabaco pode melhorar a resistência a Helicoverpa armigera nas plantas. Da mesma forma, pode-se esperar que a transfecção de outras moléculas que podem inibir a transcrição do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em Helicoverpa armigera também pode melhorar a resistência à Helicoverpa armigera no tabaco.

[187] Coletar O. furnacalslarvae em estágio de 2instar com crescimento semelhante (6 em cada grupo, em triplicata, para um total de 18 Ostrinia furnacalis) e alimentá-las separadamente com tabaco WT não transgênico, ou tabaco transgênico infectado com dswxm-corn/TRV2 (gene homólogo da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 em Ostrinia furnacalis) . Depois de 3 dias, contar as taxas de mortalidade. A mortalidade de Ostrinia furnacalis alimentadas com tabaco VIGS transfectado com dswxm63/63 corn/TRV2 é significativamente maior do que a que foi alimentada com o controle em controle de tabaco VIGS não transgênico. Dissecar os mesmos para coletar os intestinos médios, extrair o RNA de acordo com o método no Exemplo 1 e realizar o RT-PCR para avaliar a expressão do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 nos intestinos médios de Ostrinia furnacalis. Os resultados mostram que a transcrição do gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2 nos intestinos médios de Ostrinia furnacalis alimentadas com folhas de tabaco transfectadas com dswxm-corn/TRV2 durante 3 dias é significativamente mais baixa em comparação com aqueles que se alimentam do tipo selvagem.

[188] Embora todos os exemplos da presente invenção referem-se à Helicoverpa armigera ou Ostrinia furnacalis, deve ser compreendido que a invenção não se limita a insetos particulares. Os insetos podem ser vários insetos fitófagos que se alimentam de plantas, como os lepidópteros.

[189] Todas as literaturas mencionadas neste documento são incorporadas por referência neste pedido, como se cada referência de literatura tivesse sido individualmente citada. Além disso, deve ser observado que uma pessoa versada na técnica pode modificar ou variar a invenção depois de ler a descrição acima. Tais variações ou equivalentes também se enquadram no escopo das reivindicações da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para melhorar a resistência de insetos em uma planta, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: expressar uma molécula interferente que interfere especificamente com a expressão de um gene de inseto na planta, em que o dito gene de inseto é selecionado do gene do precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase, ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina.
2. Método para a produção de uma planta transgênica, em que a planta transgênica tem melhor resistência a insetos, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: expressar uma molécula interferente que interfere especificamente com a expressão de um gene de inseto na planta, em que o dito gene de inseto é selecionado do gene do precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase, ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita molécula interferente é selecionada de: um dsRNA, um ácido nucleico antissentido, um RNA interferente pequeno ou um miRNA que alveja o dito gene de inseto ou o seu fragmento, ou uma transcrição do mesmo para inibir ou silenciar aquele gene alvo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende:

(1) fornecer um constructo, o dito constructo compreende a seguinte estrutura:

2/5

SSÇfsense X Seq_antisense em que a Seq_sense é derivada da sequência de nucleotídeos do dito gene de inseto ou de um fragmento do gene de inseto, Seq_sense e Seq_anti_Sense são a sequência nucleotidica basicamente complementar;

X é uma sequência intermediária entre a Seq_sense θ a Seq_antisense < e a dita sequência intermediária não é complementar com a Seqsense e a Seqantisense; e (2) transformar o constructo de (1) em uma planta.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (2) compreende:

(a) fornecer Agrobacterium tumefaciens transportando um vetor de expressão, o dito vetor de expressão contendo o dito constructo de (1);

(b) colocar em contato uma célula vegetal, um tecido vegetal ou um órgão da planta com Agrobacterium tumefaciens da etapa (a), desse modo transfectando o dito constructo na célula vegetal, no tecido vegetal ou no órgão da planta.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Seq_sense é selecionada dentre a: SEQ ID No: 1 ou a sequência localizada nos nucleotídeos 1-576 da mesma; SEQ ID No: 2 ou a sequência localizada nos nucleotídeos 311-621 da SEQ ID No: 3 mesma; ou a sequência localizada nos nucleotídeos 297-771 da mesma ou a sequência localizada nos nucleotídeos 501-899 da SEQ ID No: 4 mesma; ou a sequência localizada nos

nucleotídeos 203-630 da mesma;

3/5

SEQ ID No: 5 ou a sequência localizada nos nucleotideos SEQ ID 372-662 da No: 4 5 mesma; ou a sequência localizada nos nucleotideos 251-643 da 7. Método, de mesma. acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é selecionada de: dicotiledôneas, monocotiledôneas ou gimnospermas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito inseto é selecionado de: insetos herbívoros.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de inseto é de um gene da larva de algodão (Helicoverpa armigera) , um gene da broca do milho, um gene de afideo, ou um gene de cicadela.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de inseto compreende:

(a) um gene que compreende qualquer uma das sequências mostradas nas SEQ ID Nos: 1 a 5 ou 8;

(b) um gene que compreende uma sequência que tem uma homologia maior que, com aumento de preferência, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 98% ou até mesmo muito maior do que qualquer uma das sequências definidas em (a).
11. Uso de um gene de inseto ou de um fragmento do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um alvo de inibição ou silenciamento para uma molécula interferente que interfere especificamente com a expressão do gene do inseto,

4/5 o dito gene de inseto sendo selecionado do gene do precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase, ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina.
12. Constructo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a seguinte estrutura:

Seqsense^-^^-Se q_anti sense r em que a Seq_sense é uma sequência nucleotidica derivada do dito gene de inseto ou de um fragmento do mesmo, e em que as Seq_sense θ Seq_antisense são sequências basicamente complementares;

X é uma sequência intermediária entre a Seq_sense θ a Seq_antisense r e a dita sequência intermediária não é complementar com as sequências Seq_sense θ Seq_anti_Sense; θ o dito gene de inseto é selecionado do gene do precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase, ou gene da isoforma B da cadeia pesada de miosina.
13. Uso do constructo, como definido na reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de uma planta com maior resistência a insetos.
14. Uso de uma molécula de interferente que interfere especificamente com a expressão de um gene de inseto para resistência a insetos da planta, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de inseto é selecionado do gene do precursor da tripsina, gene da dopa descarboxilase, gene da NADH desidrogenase ubiquinona flavoproteina 2, gene da subunidade beta da ATP sintase, ou gene da isoforma B da