ES2614943T3 - Procedimientos para el control genético de infestaciones de insectos en plantas y composiciones de los mismos - Google Patents

Procedimientos para el control genético de infestaciones de insectos en plantas y composiciones de los mismos Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido seleccionado de: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704; (b) un polinucleótido que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704 en condiciones de lavado de SSC 5X, formamida 50 % y 42 ºC durante 10 minutos; (c) un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704; (d) un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704; y (e) un complemento de la secuencia de (a), (b), (c) o (d), en el que dicho polinucleótido está unido operativamente con un promotor heterólogo; y en el que la ingesta por una plaga de planta de coleópteros de una secuencia ribonucleotídica bicatenaria que comprende al menos una cadena que es complementaria de dicho polinucleótido o dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicha plaga.

Description

Procedimientos para el control genético de infestaciones de insectos en plantas y composiciones de los mismos
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al control genético de infestaciones de plagas. Más específicamente, la presente invención se refiere a tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de secuencias codificantes diana en la célula de una plaga para proporcionar un efecto protector de la plaga.
2. Descripción de técnica relacionada
El ambiente en el que viven los seres humanos está repleto de infestaciones por plagas. Las plagas incluyen insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, ascárides, anquilostomas, cestodos, tripanosomas, esquistosomas, éstridos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos son dominantes en el ambiente humano. Una multitud de medios se han utilizado para intentar controlar infestaciones por estas plagas. Se han proporcionado composiciones para controlar infestaciones por plagas microscópicas tales como bacterias, hongos y virus en forma de composiciones antibióticas, composiciones antivirales y composiciones antifúngicas. Las composiciones para controlar infestaciones por plagas mayores tales como nematodos, platelmintos, ascárides, oxiuros, dirofilarias, cestodos, tripanosomas y esquistosomas han estado típicamente en forma de composiciones químicas que pueden aplicarse en superficies en las que están presentes plagas o se administran a animales infestados en forma de microgránulos, comprimidos, pastas o cápsulas. Existe una gran necesidad en la técnica de mejora de estos procedimientos y particularmente procedimientos que beneficiarían al ambiente en relación con las técnicas anteriores. Los cultivos comerciales son con frecuencia las dianas de ataques de insectos. Se ha realizado un progreso sustancial en las últimas décadas para desarrollar procedimientos y composiciones más eficaces para controlar infestaciones de insectos en plantas. Los pesticidas químicos han sido muy eficaces en la erradicación de infestaciones por plagas. Sin embargo, existen varias desventajas para el uso de agentes pesticidas químicos. Los agentes pesticidas químicos no son selectivos. Las aplicaciones de pesticidas químicos que se pretende que controlen plagas de invertebrados, tales como insectos coleópteros, incluyendo especies de crisomélidos del maíz que son perjudiciales para diversos cultivos y otras plantas, ejercen sus efectos también en fauna no diana, esterilizando con frecuencia de forma eficaz un campo durante un periodo de tiempo durante en el que se han aplicado los agentes pesticidas. Los agentes pesticidas químicos persisten en el ambiente y generalmente son lentos de metabolizar, si se metabolizan en absoluto. Se acumulan en la cadena alimentaria, y particularmente en las especies depredadoras superiores. Las acumulaciones de estos agentes pesticidas químicos da como resultado el desarrollo de resistencia a los agentes y en especies superiores en la cadena evolutiva, pueden actuar como mutágenos y/o carcinógenos para provocar modificaciones genéticas irreversibles y deletéreas. Por lo tanto, se ha sentido durante largo tiempo la necesidad de procedimientos respetuosos con el medio ambiente para controlar o erradicar la infestación por insectos en plantas, es decir, procedimientos que son selectivos, ambientalmente inertes, no persistentes y biodegradables y que se ajustan bien a los esquemas de tratamiento de resistencia a plagas.
Han estado disponibles en el mercado composiciones que incluyen bacterias Bacillus thuringiensis (Bt) y se han usado como insecticidas ambientalmente seguros y aceptables durante más de treinta años. El efecto insecticida de las bacterias Bt no persiste en el ambiente, es altamente selectivo para la especie diana afectada, ejerce sus efectos solamente tras ingesta de una plaga diana, y se han mostrado que es inocuo para plantas y otros organismos no diana, incluyendo seres humanos. También están disponibles en la técnica plantas transgénicas que contienen uno
o más genes que codifican la proteína Bt insecticida y son notablemente eficaces en el control de infestación por plagas de insectos. Un resultado sustancial del uso de plantas recombinantes que expresan proteínas insecticidas Bt es una reducción notable en la cantidad de agentes pesticidas químicos que se aplican al ambiente para controlar la infestación por plagas en campos de cultivo en áreas en las que se usan dichos cultivos transgénicos. La reducción de la aplicación de agentes pesticidas químicos ha dado como resultado suelos más limpios y aguas más limpias que se escapan hacia los torrentes, ríos, estanques y lagos circundantes. Además de estos beneficios ambientales, ha habido un aumento notable en los números de insectos beneficiosos en campos de cultivo en los que se cultivan cultivos resistentes a insectos transgénicos debido a la reducción del uso de agentes insecticidas químicos.
Se han presentado procedimientos y composiciones antisentido en la técnica y se cree que ejercen sus efectos mediante la síntesis de una molécula de ARN monocatenaria que en teoría hibrida in vivo con una molécula de ARN de cadena con sentido sustancialmente complementaria. Ha sido difícil emplear tecnología antisentido en muchos sistemas por tres razones principales. En primer lugar, la secuencia antisentido expresada en la célula transformada es inestable. En segundo lugar, la inestabilidad de la secuencia antisentido expresada en la célula transformada crea simultáneamente dificultad en el suministro de la secuencia a un huésped, tipo celular o sistema biológico lejano a la célula transgénica. En tercer lugar, las dificultades encontradas con la inestabilidad y el suministro de la secuencia antisentido crea dificultades al intentar proporcionar una dosis dentro de la célula recombinante que expresa la secuencia antisentido que puede modular eficazmente el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos con sentido diana.
Ha habido pocas mejoras en las tecnologías para modular el nivel de expresión génica dentro de una célula, tejido u organismo, y en particular, una falta de tecnologías desarrolladas para retardar, reprimir o reducir de otro modo la expresión de genes específicos usando tecnología de ADN recombinante. Además, como consecuencia de la imprevisibilidad de estos enfoques, no está disponible ningún medio viable comercialmente para modular el nivel de expresión de un gen específico en un organismo eucariota o procariota.
Se ha demostrado previamente la inhibición mediada por ARN bicatenario de genes específicos en diversas plagas. Se han ensañado enfoques mediados por ARNbc para el control genético en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Kennerdell y Carthew, 1998; Kennerdell y Carthew, 2000). Kennerdell y Carthew (1998) describen un procedimiento para suministro de ARNbc que implicaba la generación de insectos transgénicos que expresan moléculas de ARN bicatenario o inyección de solución de ARNbc en el cuerpo del insecto o dentro de la ooteca antes de o durante el desarrollo embrionario.
Los investigadores han demostrado previamente que puede conseguirse supresión génica mediada por ARN bicatenario en nematodos alimentado o empapando los nematodos en soluciones que contienen moléculas de ARN bicatenarias o de interferencia pequeñas y mediante inyección de las moléculas de ARNbc. Rajagopal y col. (2002) describieron intentos fallidos de suprimir un gen endógeno en larvas de la plaga de insecto Spodoptera litura alimentado o empapando larvas neonatas en soluciones que contenían ARNbc específico para el gen diana, pero tuvieron éxito en la supresión después de inyectar en las larvas ARNbc en la hemolinfa de larvas de 5ª fase usando un microaplicador. Recientemente, Yadav y col. (2006) indicaron que ARNbc generado por huésped producido en una planta puede proteger dichas plantas de la infección por nematodos. De forma similar, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 003/0150017 describió proféticamente un locus preferido para inhibición de las larvas de lepidópteros Helicoverpa armigera usando ARNbc suministrado a las larvas por ingestión de una planta transformada para producir el ARNbc. El documento WO 2005/110068 enseña la provisión, en la dieta del crisomélido del maíz (CRW), ARNbc específico de CRW dirigido a genes de CRW esenciales. El ARNbc se proporciona en la dieta de CRW in vitro y en la planta, con el resultado de que las larvas de CRW se atrofian o mueren después de alimentarse con la dieta, y este efecto se demostró para varios genes diferentes.
Por lo tanto, ha existido una necesidad de identificar secuencias de nucleótidos eficaces para su uso en métodos mejorados para modular la expresión génica reprimiendo, retardando o reduciendo de otro modo la expresión génica dentro de una plata de coleóptero particular para el fin de controlar la infestación por plagas o introducir nuevos rasgos fenotípicos.
Sumario de la invención
La invención proporciona
(1) un polinucleótido seleccionado de:
(a)
un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704;
(b)
un polinucleótido que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704 en condiciones de lavado de SSC 5X, formamida 50 % y 42 ºC durante 10 minutos;
(c)
un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704;
(d)
un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704; y
(e)
un complemento de la secuencia de (a), (b), (c) o (d), en el que dicho polinucleótido está unido operativamente con un promotor heterólogo; y
en el que la ingesta por una plaga de planta de coleópteros de una secuencia ribonucleotídica bicatenaria que comprende al menos una cadena que es complementaria de dicho polinucleótido o dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicha plaga;
(2)
una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria producida a partir de la expresión de un polinucleótido de acuerdo con (1) anterior, en la que la ingesta de dicha secuencia ribonucleotídica por una plaga de plantas de coleópteros inhibe el crecimiento de dicha plaga;
(3)
una célula transformada con el polinucleótido de (1) anterior, o una semilla de la misma que comprende el polinucleótido;
(4)
una planta transformada con el polinucleótido de (1) anterior, o una semilla de la misma que comprende el polinucleótido;
(5)
un producto de consumo producido a partir de una planta de acuerdo con (4), en el que dicho producto de consumo comprende una cantidad detectable de un ribonucleótido expresado a partir del polinucleótido de (1)
anterior;
(6)
un procedimiento para controlar infestación por plaga de coleópteros que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros un agente que comprende una primera secuencia polinucleotídica que actúa tras la ingesta por la plaga para inhibir una función biológica dentro de dicha plaga, en el que dicha secuencia polinucleotídica muestra de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos a lo largo de al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de dicha plaga y se hibrida con una segunda secuencia polinucleotídica que es complementaria de dicha primera secuencia polinucleotídica, y en el que dicha secuencia codificante derivada de dicha plaga es SEQ ID NO: 704 o el complemento de la misma;
(7)
un procedimiento para controlar una infestación por plaga de coleópteros que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros una célula vegetal que expresa una secuencia polinucleotídica de acuerdo con
(1)
anterior, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que actúa tras la ingesta por la plaga para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicha plaga y da como resultado alimentación reducida en dicha dieta en relación con una dieta que carece de la célula vegetal.
(8)
un procedimiento para mejorar el rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plagas de insectos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a)
introducir un polinucleótido de acuerdo con (1) anterior en dicha planta de cultivo,
(b)
cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de producción debida a infestación por plagas;
(9)
un procedimiento para mejorar la tolerancia a la sequía de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plagas de insectos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
(a)
introducir un polinucleótido de acuerdo con (1) anterior en dicha planta de cultivo,
(b)
cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de tolerancia a sequía debida a infestación por plagas;
(10)
un procedimiento para producir un producto de consumo, alimento o pienso que comprende obtener una planta de acuerdo con (4) anterior o una parte de la misma, y preparar un producto de consumo, alimento o pienso a partir de la planta o parte de la misma.
El procedimiento de (6) anterior comprende modular o inhibir la expresión de uno o más genes diana en una plaga de coleópteros que provoca el cese de la alimentación, el crecimiento, el desarrollo, la reproducción y/o la infecciosidad y con el tiempo da como resultado la muerte del insecto. El procedimiento comprende la introducción de ARN bicatenario (ARNbc) estabilizado, parcial o completamente, incluyendo sus formas modificadas tales como secuencias de ARN de interferencia pequeño (ARNip), en las células o en el ambiente extracelular, tal como el intestino medio, dentro del cuerpo de una plaga de coleóptero en el que el ARNbc entra en las células e inhibe la expresión de al menos uno o más genes diana y en el que la inhibición ejerce un efecto deletéreo sobre la plaga de coleóptero. Los procedimientos y composiciones asociados pueden usarse para limitar o eliminar la infestación por plaga de coleóptero en o sobre cualquier huésped de plaga, simbionte de plaga o ambiente en el que una plaga esté presente proporcionando una o más composiciones que comprenden las moléculas de ARNbc descritas en el presente documento en la dieta de la plaga. El procedimiento encontrará un beneficio particular para proteger plantas de ataques de insectos. En una realización, se define que la plaga comprende un pH del sistema digestivo dentro del intervalo de 4,5 a 9,5, de 5 a 9, de 6 a 8, y de aproximadamente pH 7,0.
El ácido nucleico de (1) anterior es homólogo de al menos una parte de una o más secuencias de ácido nucleico nativas en un Diabrotica virgifera (Crisomélido del Maíz Occidental (WRC, Diabrotica virgifera o Diabrotica virgifera virgifera), Crisomélido del Maíz Meridional (SCR, Diabrotica undecimpunctata howardi), Crisomélido del Maíz Mejicano (MCR, Diabrotica virgifera zea), Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR, Diabrotica balteata, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa), Crisomélido del Maíz Septentrional (NCR, Diabrotica barberi), Diabrotica undecimpunctata)).
El procedimiento de (6) anterior comprende la etapa de proporcionar en la dieta de la plaga una cantidad supresora génica de al menos una molécula de ARNbc transcrita a partir de una secuencia de nucleótidos como se describe en el presente documento, al menos un segmento de la cual es complementario de una secuencia de ARNm dentro de las células de la plaga. El procedimiento puede comprender además observar la muerte, inhibición, atrofia o cese de alimentación de la plaga. Una molécula de ARNbc, incluyendo su forma modificada tal como una molécula de ARNip, con la que se alimenta una plaga de acuerdo con la invención puede ser al menos de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a una molécula de ARN transcrita de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 704.
De acuerdo con el aspecto (1) de la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos aislada y purificada como se expone en SEQ ID NO: 704. El aspecto (2) de la presente invención incluye una molécula de ARNbc estabilizada y miARN para inhibición de la expresión de un gen diana en una plaga de coleóptero expresada a partir de esta secuencia y fragmentos de la misma. Un ARNbc estabilizado, incluyendo una molécula de miARN o ARNip puede comprender al menos dos secuencias codificantes que están dispuestas en una orientación con sentido y una antisentido en relación con al menos un promotor, en el que la secuencia de nucleótidos que comprende una cadena con sentido y una cadena antisentido están unidas o conectadas por una secuencia espaciadora de al menos aproximadamente cinco a aproximadamente mil nucleótidos, en la que la cadena con sentido y la cadena antisentido pueden ser de una longitud diferente, y en la que cada una de las dos secuencias codificantes comparte al menos 80 % de identidad de secuencia, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o 100 % de identidad de secuencia, con una cualquiera o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 704.
La invención proporciona adicionalmente un fragmento o concatémero de una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704.
Puede definirse que el fragmento provoca la muerte, inhibición, atrofia o cese de alimentación de una plaga cuando se expresa como un ARNbc y se proporciona a la plaga. El fragmento puede comprender, por ejemplo, al menos 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 704; o un complemento de los mismos. Un segmento de ADN beneficioso para su uso en la presente invención es al menos de 19 a 23, o 23 a 100 nucleótidos hasta 2000 nucleótidos o más de longitud. Serán particularmente útiles secuencias de ARNbc que incluyan de 23 a 300 nucleótidos homólogos de una secuencia diana de plaga. La invención también proporciona un ácido ribonucleico expresado a partir de cualquiera de dichas secuencias incluyendo un ARNbc. Una secuencia seleccionada para su uso en la expresión de un agente de supresión génica puede construirse a partir de una única secuencia derivada de una o más plagas diana y que se pretende usar en la expresión de un ARN que actúa en la supresión de un único gen o familia génica en la o las plagas diana, o que la secuencia de ADN puede construirse como una quimera a partir de una pluralidad de secuencias de ADN.
El aspecto (2) de la invención incluye construcciones de ADN recombinante que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc descrita en el presente documento. El ARNbc puede formarse por transcripción de una cadena de la molécula de ARNbc a partir de una secuencia de nucleótidos que es de al menos aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 704. Dichas construcciones de ADN recombinante pueden definirse como productoras de moléculas de ARNbc capaces de inhibir la expresión de gen o genes diana endógenos en una célula de plaga tras su ingesta. La construcción puede comprender una secuencia de nucleótidos de la invención unida operativamente con una secuencia promotora que actúa en la célula huésped. Dicho promotor puede ser específico de tejido y puede, por ejemplo, ser específico de un tipo tisular que es el objeto de un ataque de plaga. En el caso de crisomélidos, por ejemplo, puede desearse usar un promotor que proporcione expresión preferida por la raíz.
Las construcciones de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden comprender al menos una secuencia de nucleótidos de origen no natural que puede transcribirse a un ARN monocatenario capaz de formar una molécula de ARNbc in vivo mediante hibridación. Dichas secuencias de ARNbc se autoensamblan y pueden proporcionarse en la dieta de una plaga de coleóptero para conseguir la inhibición deseada.
Una construcción de ADN recombinante puede comprender dos secuencias de origen no natural diferentes que, cuando se expresan in vivo como secuencias de ARNbc y se proporcionan en la dieta de una plaga de coleóptero, inhiben la expresión de al menos dos genes diana diferentes en la célula de la plaga de coleóptero. En ciertas realizaciones, se producen al menos 3, 4, 5, 6, 8 o 10 o más ARNbc diferentes en una célula o planta que comprende la célula que tiene un efecto inhibidor de la plaga. Los ARNbc pueden expresarse a partir de múltiples construcciones introducidas en diferentes acontecimientos de transformación o podrían introducirse en una única molécula de ácido nucleico. Los ARNbc pueden expresarse usando un único promotor o múltiples promotores. En una realización de la invención, se producen ARNbc individuales que comprenden ácidos nucleicos homólogos de múltiples loci dentro de una plaga.
El aspecto (3) de la invención proporciona una célula huésped recombinante que tiene en su genoma al menos una secuencia de ADN recombinante como se ha definido anteriormente que se transcribe para producir al menos una molécula de ARNbc que actúa cuando se ingiere por una plaga de coleóptero para inhibir la expresión de un gen diana en la plaga. La molécula de ARNbc puede codificarse por cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento y como se expone en el listado de secuencias.
El aspecto (4) de la invención proporciona una célula vegetal transformada que tiene en su genoma al menos una secuencia de ADN recombinante descrita en el presente documento. También se proporcionan plantas transgénicas que comprenden dicha célula vegetal transformada, incluyendo plantas descendientes de cualquier generación, semillas y productos vegetales, que comprenden cada uno el ADN recombinante.
Los procedimientos y composiciones de la presente invención pueden aplicarse a cualquier planta monocotiledónea y dicotiledónea, dependiendo del control de plagas de coleópteros deseado. Específicamente, se pretende que las
plantas incluyan, sin limitación, plantas de alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, banana, cebada, judías, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, col, colza, cantalupo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítrico, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabaza común, uva, pomelo, melazo, jicama, kiwi, lechuga, puerros, limón, lima, pino taeda, mango, melón, champiñón, nuez, avena, ocra, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada, chopo, patata, calabaza gigante, membrillo, pino radiata, achicoria, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino sureño, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, boniato, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, césped, una vid, sandía, trigo, ñame y calabacín. Por lo tanto, una planta transformada con una secuencia de ADN recombinante como se expone en SEQ ID NO: 704, o concatémero, fragmento o complemento de la misma, que se transcribe para producir al menos una molécula de ARNbc que actúa cuando se ingiere por una plaga de coleóptero para inhibir la expresión de un gen diana en la plaga también se proporciona por la invención.
El procedimiento del aspecto (7) incluye una combinación de nucleótidos para controlar infestaciones por plagas de coleópteros. Un medio proporciona un procedimiento de ARNbc como se describe en el presente documento para proteger plantas de infestación por insectos junto con uno o más agentes insecticidas que muestran características diferentes de las mostradas por los procedimientos y composiciones de ARNbc. Por ejemplo, pueden proporcionarse una o más proteínas Bt en la dieta de plagas de insectos en combinación con una o más ARNbc como se describe en el presente documento. Una composición formulada para aplicación tópica o derivada usando un enfoque transgénico que combina procedimientos de ARNbc y composiciones con Bt puede usarse para proporcionar sinergias que no se conocían previamente en la técnica para controlar infestación por insectos. Una sinergia es la reducción del nivel de expresión requerido para el ARNbc o los ARNbc y la proteína o las proteínas Bt. Cuando se combinan entre sí, podría usarse una dosis eficaz menor de cada agente de control de plagas. Se cree que las proteínas insecticidas Bt crean poros de entrada a través de los que las moléculas de ARNbc son capaces de penetrar más eficazmente en espacios lejos del intestino de la plaga de insectos, o más eficazmente en las células en la proximidad de lesiones creadas por las proteínas Bt, requiriendo de este modo menos del Bt o el ARNbc para conseguir el resultado de insecticida deseado o la inhibición o supresión deseada de una función biológica diana en la plaga diana.
Una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis puede ser cualquiera de varias proteínas insecticidas incluyendo pero sin limitación una Cry1, una Cry3, una TIC851, una CryET70, una Cry22, una TIC901, una TIC1201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria CryET33 y CryET34, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC 100 y TIC101, una proteína insecticida binaria PS149B1, una proteína insecticida VIP, una TIC900 o proteína relacionada, o combinaciones de las proteínas insecticidas ET29 o ET37 con las proteínas insecticidas TIC810 o TIC812, y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes.
Un ácido ribonucleico que se proporciona en una dieta puede proporcionarse en una dieta artificial formulada para cumplir requisitos nutricionales particulares para mantener una plaga en dicha dieta. La dieta puede complementarse con una cantidad de control de plagas de un ARN que se ha purificado a partir de un sistema de expresión separado para determinar una cantidad controladora de plagas de composición de ARN o para determinar el grado de actividad supresora tras la ingesta de la dieta complementada por la plaga. La dieta también puede ser una célula recombinante transformada con una secuencia de ADN construida para expresión del agente, el ARN, o el agente de supresión génica. Tras la ingesta de una o más de dichas células transformadas por la plaga, se observa un resultado fenotípico deseado, lo que indica que el agente ha actuado para inhibir la expresión de una secuencia de nucleótidos diana que está dentro de las células de la plaga.
Un gen diana para supresión puede codificar una proteína esencial, cuya función predicha se selecciona del grupo que consiste en formación de músculo, formación de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, síntesis y transporte de proteínas, síntesis de enzimas digestivas, mantenimiento de potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación, desarrollo y diferenciación de patas, formación de huevos, maduración de larvas, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración, una función desconocida y apoptosis.
El aspecto (8) de la presente invención también proporciona procedimientos para mejorar el rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plagas de insectos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de a) introducir un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 704
o un complemento o concatémero o fragmento del mismo en dicha planta de cultivo; y b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de rendimiento debida a infestación por plagas.
En ciertas realizaciones, la expresión del polinucleótido produce una molécula de ARN que suprime al menos un primer gen diana en una plaga de insectos que ha ingerido una parta de dicha planta de cultivo, en la que el gen diana realiza al menos una función esencial seleccionada del grupo que consiste en alimentación de la plaga,
viabilidad de la plaga, apoptosis de células de la plaga, diferenciación y desarrollo de la plaga o cualquier célula de la plaga, reproducción sexual de la plaga, formación de músculo, fasciculación muscular, contracción muscular, formación y/o reducción de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, transición de estado larvario, pupación, aparición desde la pupación, división celular, metabolismo energético, respiración, síntesis y mantenimiento de la estructura citoesquelética, metabolismo de nucleótidos, metabolismo de nitrógeno, uso de agua, retención de agua y percepción sensorial.
En otras realizaciones, la plaga de insecto es una plaga de crisomélido del maíz seleccionada del grupo que consiste en Diabrotica undecimpunctata howardi (Crisomélido del Maíz Meridional (SCR)), Diabrotica virgifera virgifera (Crisomélido del Maíz Occidental (WRC)), Diabrotica barberi (Crisomélido del Maíz Septentrional (NCR)), Diabrotica virgifera zea (Crisomélido del Maíz Mejicano (MCR)), Diabrotica balteata (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)), Diabrotica viridula (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)) y Diabrotica speciosa (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)).
El aspecto (9) de la invención proporciona un procedimiento para mejorar la tolerancia a sequía de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plaga de insectos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de a) introducir una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 704, o un fragmento de la misma, en dicha planta de cultivo; y b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de tolerancia a la sequía debida a infestación por plagas.
El aspecto (5) de la invención proporciona productos agrícolas y comercialmente importantes y/o composiciones de materia incluyendo pienso animal, artículos, productos y productos secundarios que se pretende usar como alimento para consumo humano o para uso en composiciones y mercancías que se pretende usar para consumo humano incluyendo harina de maíz, harina gruesa de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, maíz palomero, tortas de maíz y cereales. Puede definirse que dichas composiciones contienen cantidades aceptables de una secuencia de nucleótidos expuesta en el presente documento, y por lo tanto también son de diagnóstico para cualquier acontecimiento transgénico que contenga dichas secuencias de nucleótidos. Dichos productos son útiles al menos porque probablemente deriven de cultivos propagados con menos pesticidas y organofosfatos como resultado de su incorporación de los nucleótidos de la presente invención para controlar la infestación de plagas de coleópteros en plantas. Dichos artículos y productos de consumo pueden producirse a partir de semillas producidas de una planta transgénica, en la que la planta transgénica expresa ARN de uno o más nucleótidos contiguos de la presente invención o nucleótidos de una o más plagas de coleópteros y los complementos de los mismos. Dichos artículos y productos de consumo también pueden ser útiles en el control de plagas de coleópteros de dichos artículos y productos de mercancía, tales como por ejemplo, control de gorgojos de la harina, debido a la presencia en el artículo o producto de consumo del ARN supresor génico de la plaga expresado a partir de una secuencia génica como se expone en la presente invención. El aspecto (10) de la invención proporciona un procedimiento para producir dicho producto de consumo de una planta transformada con un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 704, o un concatémero o fragmento o complemento del mismo, y preparar un productor de consumo a partir de la planta o parte de la misma. El aspecto (10) de la invención proporciona un procedimiento para producir dicho alimento o pienso a partir de una planta transformada con un polinucleótido de SEQ ID NO: 704
o un fragmento o complemento del mismo, y preparar alimento o pienso a partir de dicha planta o parte de la misma.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1: Bioensayo de acontecimientos de plantas de maíz F1 transformados con pMON98503 (SEQ ID NO: 820) y expuestos a Crisomélido del Maíz Occidental (WCR).
FIG. 2: Bioensayo de acontecimientos de plantas de maíz F1 transformados con pMON98504 que comprende concatémero C1 (SEQ ID NO: 821) y expuestos a Crisomélido del Maíz Occidental (WCR).
FIG. 3: Selección de fragmentos de Dv49 y Dv248 y diseño esquemático del concatémero de Dv49-Dv248 C38.
FIG. 4: ARNbc F1-F3 sintetizados basándose en el concatémero C38.
FIG. 5: Respuesta a dosis de concatémero 38 de DV49-DV248 (Fragmentos F1-F6).
FIG. 6: Respuesta a dosis de concatémero 38 de DV49-DV248 (Fragmentos F7-F10).
FIG. 7: Respuesta a dosis de concatémero 38 de DV49-DV248 (Fragmentos F11-F13).
Descripción detallada de la invención
A continuación se presenta una descripción detallada de la invención proporcionada para ayudar a los expertos en la
materia en la práctica de la presente invención.
La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para el control genético de infestaciones por plagas. Por ejemplo, la presente invención proporciona tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de una secuencia codificante diana en la célula de una plaga para proporcionar un efecto protector de plagas alimentando a la plaga con una o más moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de interferencia pequeño o bicatenario transcritas a partir de toda o una parte de una secuencia codificante diana, controlando de este modo la infestación. Por lo tanto, la presente invención se refiere a inhibición específica de secuencia de expresión de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNbc), incluyendo ARN de interferencia pequeña (ARNip), para conseguir los niveles pretendidos de control de plagas.
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas y sustancialmente purificadas incluyendo secuencias de nucleótidos de origen no natural y construcciones de ADN recombinante para transcribir moléculas de ARNbc de la presente invención que suprimen o inhiben la expresión de una secuencia codificante endógena o una secuencia codificante diana en la plaga cuando se introducen en la misma. También se proporcionan plantas transgénicas que
(a) contienen secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de ácido nucleico aisladas y sustancialmente purificadas y las construcciones de ADN recombinante de origen no natural para transcribir las moléculas de ARNbc para controlar infestaciones por plagas vegetales y (b) presentan resistencia y/o tolerancia potenciada a las infestaciones por insectos. También se describen composiciones que contienen las secuencias de nucleótidos de ARNbc de la presente invención para su uso en aplicaciones tópicas en plantas o en animales o en el ambiente de un animal para conseguir la eliminación o reducción de infestaciones por plagas.
Los inventores han descubierto en el presente documento que, a diferencia de las enseñanzas de la técnica anterior, la alimentación con una composición que contiene moléculas de ARN bicatenario que consiste en secuencias halladas dentro de una o más secuencias de nucleótidos expresadas de una especie de coleóptero a la especie de la que se obtuvieron las secuencias de nucleótidos da como resultado la inhibición de una o más funciones biológicas dentro de la especie de coleóptero. Particularmente, los inventores han descubierto que la alimentación con las moléculas de ARN bicatenario descritas en el presente documento de especies de plagas de cultivos tales como crisomélidos del maíz da como resultado la muerte o inhibición del desarrollo y diferenciación de plagas de insectos que ingieren estas composiciones.
Los inventores han identificado que las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento proporcionan efectos protectores de plantas contra especies de plagas de coleópteros. Se han deducido secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADNc y se han comparado con secuencias de aminoácidos conocidas. Se predice que muchas de las secuencias codifican proteínas que tienen alguna información de anotación asociada con ellas. La información de anotación que se asocia con una secuencia de nucleótidos particular y secuencia de proteínas codificada a partir de la misma se basa en la homología o similitud entre las secuencias de aminoácidos deducidas mediante traducción de las secuencias codificantes descritas en el presente documento como se exponen y secuencias de aminoácidos que se conocen en la técnica en bases de datos públicamente disponibles.
Se seleccionaron secuencias de ADNc que codificaban proteínas o partes de proteínas esenciales para la supervivencia, tales como secuencias de aminoácidos implicadas en diversas rutas bioquímicas metabólicas o catabólicas, división celular, reproducción, metabolismo energético, digestión, función neurológica y similares para su uso en la preparación de moléculas de ARN bicatenario que se proporcionaron en la dieta de plagas de coleópteros. Como se describe en el presente documento, la ingesta por una plaga diana de composiciones que contienen uno o más ARNbc, al menos un segmento de los cuales corresponde a al menos un segmento sustancialmente idéntico de ARN producido en las células de la plaga diana, dio como resultado muerte, atrofia u otra inhibición de la plaga diana. Estos resultados indicaron que una secuencia de nucleótidos, bien ADN o bien ARN, derivada de una plaga de coleópteros puede usarse para construir células vegetales resistentes a infestación por la plaga. El huésped de la plaga, por ejemplo, puede transformarse para contener una o más de las secuencias de nucleótidos derivadas de la plaga de coleópteros. La secuencia de nucleótidos transformada en el huésped de plaga o simbionte puede codificar uno o más ARN que se forman en una secuencia de ARNbc en las células o fluidos biológicos dentro del huésped transformador o simbionte, preparando de este modo el ARNbc disponible en la dieta de la plaga si/cuando la plaga se alimente del huésped transgénico o simbionte, dando como resultado la supresión de expresión de uno o más genes en las células de la plaga y en última instancia la muerte, atrofia u otra inhibición de la plaga.
La presente invención se refiere en general al control genético de infestaciones por plagas de coleópteros en organismos huéspedes. Más particularmente, la presente invención incluye los procedimientos para el suministro de agentes de control de plagas a una plaga de coleópteros. Dichos agentes de control de plagas provocan, directa o indirectamente, una alteración de la capacidad de la plaga para mantenerse, crecer o de otro modo infestar un huésped o simbionte diana. La presente invención proporciona procedimientos para emplear moléculas de ARNbc estabilizadas en la dieta de la plaga como un medio para la supresión de genes diana en la plaga, consiguiendo de este modo control deseado de infestaciones por la plaga en, o en torno al huésped o simbionte al que se dirige la plaga.
Al conseguir lo anterior, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de un gen diana en una plaga de coleóptero, incluyendo por ejemplo, crisomélidos del maíz u otras especies de insectos coleópteros, dando como resultado el cese de la alimentación, el crecimiento, el desarrollo, la reproducción, la infecciosidad y con el tiempo puede dar como resultado la muerte de la plaga. El procedimiento comprende en una realización introducir moléculas de nucleótidos de ARN bicatenario (ARNbc) parcial o completamente estabilizadas en una composición nutricional que la plaga utiliza como una fuente de alimento, y poner la composición nutricional a disposición de la plaga para alimentación. La ingesta de la composición nutricional que contiene las moléculas bicatenarias o de ARNip da como resultado la captación de las moléculas por las células de la plaga, dando como resultado la inhibición de la expresión de al menos un gen diana en las células de la plaga. La inhibición del gen diana ejerce un efecto deletéreo sobre la plaga.
En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNbc proporcionadas por la invención comprenden secuencias de nucleótidos complementarias de una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 704, cuya inhibición en un organismo de plaga da como resultado la reducción o retirada de un agente de secuencia proteica o de nucleótidos que es esencial para el crecimiento de las plagas y el desarrollo u otra función biológica. La secuencia de nucleótidos seleccionada puede mostrar del 80 % a al menos 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 704, como se expone en el listado de secuencias, incluyendo el complemento de las mismas. Dicha inhibición puede describirse como específica porque se elige una secuencia de nucleótidos de una parte del gen diana de la que se transcribe ARNbc o ARNip inhibidor. El procedimiento es eficaz para inhibir la expresión de al menos un gen diana y puede usarse para inhibir muchos tipos diferentes de genes dianas en la plaga.
Las secuencias que se ha identificado que tienen efecto protector de plagas pueden expresarse fácilmente como moléculas de ARNbc mediante la creación de construcciones de expresión apropiadas. Por ejemplo, dichas secuencias pueden expresarse como una estructura en horquilla y de tallo y bucle tomando un primer segmento correspondiente a una secuencia de SEQ ID NO: 704 o un fragmento del mismo, ligando esta secuencia a una segunda región espaciadora de segmentos que no es homóloga o complementaria del primer segmento, y ligando esta a un tercer segmento que transcribe un ARN, en el que al menos una parte del tercer segmento es sustancialmente complementaria del primer segmento. Dicha construcción forma una estructura de tallo y bucle por hibridación del primer segmento con el tercer segmento y se forma una estructura en bucle que comprende el segundo segmento (documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814A1 y US 2003/0018993A1).
A. Composiciones y construcciones de ácido nucleico
La invención proporciona construcciones de ADN recombinante para su uso en la consecución de transformación estable de dianas de plagas simbiontes o huéspedes particulares. Las dianas de plagas simbiontes o huéspedes transformadas pueden expresar niveles eficaces desde un punto de vista pesticida de moléculas de ARNbc o ARNip preferidas de las construcciones de ADN recombinantes, y proporcionan las moléculas en la dieta de la plaga. Pueden proporcionarse pares de secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas a partir de información de biblioteca de ADNc y/o biblioteca genómica. Los pares de secuencias de nucleótidos pueden derivar de cualquier plaga de coleóptero preferida para su uso como cebadores de amplificación térmica para generar moldes de ADN para la preparación de moléculas de ARNbc y ARNip de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión “ácido nucleico” se refiere a un polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. El “ácido nucleico” también puede contener opcionalmente bases de nucleótidos de origen no natural o alteradas que permiten la lectura correcta mediante una polimerasa y no reducen la expresión de un polinucleótido codificado por ese ácido nucleico. La expresión “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácido nucleico” se refiere a las cadenas tanto con sentido como antisentido de un ácido nucleico como cadenas sencillas individuales o en la doble cadena. La expresión “ácido ribonucleico” (ARN) incluye ARNi (ARN inhibidor), ARNbc (ARN bicatenario), ARNip (ARN de interferencia pequeño), ARNm (ARN mensajero), miARN (micro-ARN), ARNt (ARN de transferencia, bien cargado o bien descargado con un aminoácido acilado correspondiente) y ARNc (ARN complementario) y la expresión “ácido desoxirribonucleico” (ADN) incluye ADNc y ADN genómico e híbridos de ADN-ARN. Las expresiones “segmento de ácido nucleico”, “segmento de secuencia de nucleótidos” o más en general “segmento” se entenderán por los expertos en la materia como una expresión funcional que incluye secuencias genómicas, secuencias de ARN ribosómico, secuencias de ARN de transferencia, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operón y secuencias de nucleótidos modificadas técnicamente más pequeñas que expresan o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos o péptidos.
Se proporcionan de acuerdo con la invención secuencias de nucleótidos, cuya expresión da como resultado una secuencia de ARN que es sustancialmente homóloga de una molécula de ARN de un gen diana en un insecto que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma del insecto. Por lo tanto, después de la ingesta de la secuencia de ARN estabilizada puede obtenerse regulación negativa de la secuencia de nucleótidos del gen diana en las células del insecto dando como resultado un efecto deletéreo en el mantenimiento, la viabilidad, la proliferación, la reproducción y la infestación del insecto.
Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente homólogo” u “homología sustancial”, en
referencia a una secuencia de ácido nucleico, incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia codificante como se expone en SEQ ID NO: 704 como expone en el listado de secuencias, o los complementos de la misma. Son secuencias que hibridan en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 704 como se expone en el listado de secuencias, o los complementos de las mismas, las que permiten que se produzcan un alineamiento antiparalelo entre las dos secuencias, y las dos secuencias son capaces después, en condiciones rigurosas, de formar enlaces de hidrógeno con bases correspondientes en la cadena opuesto para formar una molécula bicatenaria que es suficientemente estable en las condiciones rigurosas para ser detectable usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Las secuencias sustancialmente homólogas tienen preferentemente del 70 % al 80 % de identidad de secuencia, o más preferentemente del 80 % al 85 % de identidad de secuencia, o más preferentemente del 90 % al 95 % de identidad de secuencia, hasta 99 % de identidad de secuencia, con las secuencias de nucleótidos de referencia como se expone en SEQ ID NO: 704 como se expone en el listado de secuencias, o los complementos de las mismas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “identidad de secuencia”, “similitud de secuencia” u “homología” se usa para describir relaciones de secuencias entre dos o más secuencias de nucleótidos. El porcentaje de “identidad de secuencia” entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en el que la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idéntico aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Se dice que una secuencia que es idéntica en comparación con una secuencia de referencia es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Se dice que una primera secuencia de nucleótidos cuando se observa en la dirección 5’ a 3’ es un “complemento” de, o es complementaria de, una segunda secuencia de nucleótidos o secuencia de nucleótidos de referencia observada en la dirección de 3’ a 5’ si la primera secuencia de nucleótidos muestra complementariedad completa con la segunda secuencia o secuencia de referencia. Como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas de secuencias de ácido nucleico muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las secuencias leída de 5’ a 3’ es complementario de cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee de 3’ a 5’. Una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de referencia mostrará una secuencia idéntica a la secuencia de complemento inversa de la secuencia de nucleótidos de referencia. Estas expresiones y descripciones están bien definidas en la técnica y se entienden fácilmente por los expertos habituales en la materia.
Como se usa en el presente documento, una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de 50 a 100, más habitualmente de 100 a 150, en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse de forma óptima las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir huecos) de 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Los expertos en la materia deberían referirse a los procedimientos detallados usados para alineamiento de secuencias en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., Estados Unidos) o referirse a Ausubel y col. (1998) para un análisis detallado del análisis de secuencia.
La presente invención proporciona secuencias de ADN capaces de expresarse como un ARN en una célula o microorganismo para inhibir la expresión génica diana en una célula, un tejido o un órgano de un insecto. Las secuencias comprenden una molécula de ADN que codifica una o más secuencias de nucleótidos diferentes, en la que cada una de las secuencias de nucleótidos diferentes comprende una secuencia de nucleótidos con sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido conectadas por una secuencia espaciadora que codifica una molécula de ARNbc de la presente invención. La secuencia espaciadora constituye parte de la secuencia de nucleótidos con sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido y se forma dentro de la molécula de ARNbc entre las secuencias con sentido y antisentido. La secuencia de nucleótidos con sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido son sustancialmente idénticas a la secuencia de nucleótidos del gen diana o un derivado de la misma o una secuencia complementaria de la misma. La molécula de ADNbc puede colocarse operativamente bajo el control de una secuencia promotora que actúa en la célula, el tejido o el órgano del huésped que expresa el ADNbc para producir moléculas de ARNbc. En una realización, la secuencia de ADN puede derivar de una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 704 en el listado de secuencias.
La invención también proporciona una secuencia de ADN para expresión en una célula de una planta que, tras la expresión del ADN a ARN e ingesta por una plaga diana consigue supresión de un gen diana en una célula, un tejido
o un órgano de una plaga de insecto. El ARNbc comprende al menos una o múltiples secuencias génicas estructurales, en las que cada una de las secuencias génicas estructurales comprende una secuencia de nucleótidos con sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido conectadas por una secuencia espaciadora que forma un bucle dentro de las secuencias complementarias y antisentido. La secuencia de nucleótidos con sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen diana, derivado del mismo, o secuencia complementaria del mismo. La o las secuencias génicas estructurales se colocan
operativamente bajo el control de una o más secuencias promotoras, al menos una de las cuales es operativa en la célula, tejido u órgano de un organismo procariota o eucariota, particularmente una planta.
Una secuencia génica o fragmento para control de plagas de acuerdo con la invención puede clonarse entre dos promotores específicos de tejido, tales como dos promotores específicos de raíz que son operativos en una célula vegetal transgénica y se expresan en la misma para producir ARNm en la célula vegetal transgénica que forma moléculas de ARNbc para el mismo. Las moléculas de ARNbc contenidas en tejidos vegetales se ingieren por un insecto de modo que se consigue la supresión pretendida de la expresión génica diana.
Una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención puede comprender una repetición invertida separada por una “secuencia espaciadora”. La secuencia espaciadora puede ser una región que comprende cualquier secuencia de nucleótidos que facilita la formación de estructura secundaria entre cada repetición, cuando esto se requiera. En una realización de la presente invención, la secuencia espaciadora es parte de la secuencia codificante con sentido o antisentido para ARNm. La secuencia espaciadora puede comprender como alternativa cualquier combinación de nucleótidos u homólogos de los mismos que sean capaces de unirse covalentemente con una molécula de ácido nucleico. La secuencia espaciadora puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 10-100 nucleótidos de longitud, o como alternativa al menos aproximadamente 100-200 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 200-400 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 400-500 nucleótidos de longitud.
Las moléculas de ácido nucleico o fragmento de las moléculas de ácido nucleico u otras moléculas de ácido nucleico en el listado de secuencias son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en ciertas circunstancias. Como se usa en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenaria, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el complemento de otra molécula de ácido nucleico si muestran complementariedad completa. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre sí al menos en condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. De forma similar, se dice que las moléculas son complementarias si puede hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre sí en condiciones de “alta rigurosidad” convencionales. Se describen condiciones de rigurosidad convencionales en Sambrook, y col. (1989), y en Haymes y col. (1985).
Son por lo tanto permisibles variaciones de la complementariedad completa, siempre que dichas variaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Por lo tanto, para que una molécula de ácido nucleico o un fragmento de la molécula de ácido nucleico actúe como un cebador o sonda solamente es necesario que sea suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable con las concentraciones de disolvente y sales particulares empleadas.
Son condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6,0 x a aproximadamente 45 ºC, seguido de un lavado de SSX 2,0 x a 50 ºC, se conocen por los expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology (1989). Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de SSC 2,0 x a 50 ºC hasta una alta rigurosidad de SSC 0,2 x a 50 ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 ºC, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 ºC. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o pueden mantenerse constantes la temperatura o la concentración salina mientras que se cambia la otra variable. Un ácido nucleico para uso en la presente invención puede hibridar específicamente con una o más moléculas de ácido nucleico de WCR o complementos de las mismas en dichas condiciones. Preferentemente, un ácido nucleico para uso en la presente invención mostrará al menos de 80 %, al menos de 90 %, o al menos de 95 % o al menos de 98 % o incluso 100 % de identidad de secuencia con una o más moléculas de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 704 como se expone en el listado de secuencias.
También pueden sintetizarse ácidos nucleicos de la presente invención, bien completamente o bien en parte, especialmente cuando sea deseable proporcionar secuencias preferidas por plantas, por procedimientos conocidos en la técnica. Por lo tanto, todos o una parte de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden sintetizarse usando codones preferidos por un huésped seleccionado. Pueden determinarse codones preferidos por especies, por ejemplo, a partir de los codones usados más frecuentemente en las proteínas expresadas en una especie huésped particular. Otras modificaciones de las secuencias de nucleótidos pueden dar como resultado mutantes que tengan actividad ligeramente alterada.
Las secuencias de nucleótidos de ARNbc o ARNip comprenden dobles cadenas de ribonucleótido polimerizado y pueden incluir modificaciones a la cadena principal de azúcar-fosfato o al nucleósido. Las modificaciones en estructura de ARN pueden adaptarse para permitir inhibición genética específica. En una realización, las moléculas de ARNbc pueden modificarse mediante un procedimiento enzimático de modo que puedan generarse moléculas de ARNip. El ARNip puede mediar eficazmente en el efecto de regulación negativa para algunos genes diana en algunos insectos. Este proceso enzimático puede conseguirse utilizando una enzima RNAsa III o una enzima DICER, presente en las células de un insecto, un animal vertebrado, un hongo o una planta en la ruta de ARNi
eucariota (Elbashir y col., 2002; Hamilton y Baulcombe, 1999). Este proceso también puede utilizar una DICER o RNAsa III recombinante introducida en las células de un insecto diana mediante técnicas de ADN recombinante que se conocen fácilmente por los expertos en la materia. Tanto la enzima DICER como RNAsa III, que aparecen de forma natural en un insecto o se preparan mediante técnicas de ARN recombinante, escinden cadenas de ARNbc mayores en oligonucleótidos más pequeños. Las enzimas DICER cortan específicamente las moléculas de ARNbc en trozos de ARNip cada uno de los cuales es de aproximadamente 19-25 de nucleótidos de longitud mientras que las enzimas RNAsa III escinden normalmente las moléculas de ARNbc en ARNip de 12-15 pares de bases. Las moléculas de ARNip producidas por una de las enzimas tienen salientes 3’ de 2 a 3 nucleótidos y extremos 5’ fosfato y 3’ hidroxilo. Las moléculas de ARNip generadas por enzima RNAsa III son iguales que las producidas por enzimas Dicer en la ruta de ARNi eucariota y por lo tanto son objetivo de y se degradan por un mecanismo degradante de ARN celular inherente después de haberse desenrollado posteriormente, separado en ARN monocatenario e hibridan con las secuencias de ARN transcritas por el gen diana. Este proceso da como resultado la degradación o retirada eficaz de la secuencia de ARN codificada por la secuencia de nucleótidos del gen diana en el insecto. El resultado es el silenciamiento de una secuencia de nucleótidos diana particular dentro del insecto. Pueden encontrarse descripciones detalladas de procesos enzimáticos en Hannon (2002).
Como se usa en el presente documento, “un motivo estructural diana” o “motivo diana”, se refiere a cualquier secuencia o combinación de frecuencias seleccionadas racionalmente en la que la secuencia o las secuencias se eligen basándose en una configuración tridimensional que se forma tras el plegamiento del motivo diana. Existe una diversidad de motivos diana conocidos en la técnica. Los motivos diana de proteínas incluyen, pero sin limitación, sitios activos enzimáticos y secuencias señal. Los motivos diana de ácidos nucleicos incluyen secuencias promotoras, elementos en cis, estructuras en horquilla y elementos de expresión inducible (secuencias de unión a proteínas).
B. Vectores recombinantes y transformación de células huéspedes
Un vector de ADN recombinante puede ser, por ejemplo, un plásmido lineal o uno circular cerrado. El sistema de vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contienen juntos el ADN total para introducir el genoma del huésped bacteriano. Además, un vector bacteriano puede ser un vector de expresión. Las moléculas de ácido nucleico como se exponen en SEQ ID NO: 704 o fragmentos o complementos de las mismas pueden insertarse, por ejemplo, convenientemente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que actúa en uno o más huéspedes microbianos para conducir la expresión de una secuencia codificante ligada u otra secuencia de ADN. Muchos vectores están disponibles para este fin, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico para insertar en el vector y la célula huésped particular para transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped particular con la que es compatible. Los componentes de vector para transformación bacteriana incluyen en general, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores seleccionables y un promotor inducible que permite la expresión de ADN exógeno.
Los vectores de expresión y clonación contienen en general un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huéspedes transformadas que han crecido en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para bacilos. Las células que se transforman con éxito con una proteína heteróloga o fragmento de la misma producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor inducible que reconoce el organismo bacteriano huésped y está unido operativamente con el ácido nucleico que codifica, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARNm de D. v. virgifera o fragmento del mismo de interés. Los promotores inducibles adecuados para uso con huéspedes bacterianos incluyen promotor de -lactamasa, promotores PL y PR de fago  de E. coli y promotor de galactosa de
E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp) y el promotor de operón de lactosa y variaciones de los mismos y promotores híbridos tales como el promotor de tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores inducibles bacterianos conocidos.
La expresión “unido operativamente”, como se usa en referencia a una secuencia reguladora y una secuencia de nucleótidos estructural, significa que la secuencia reguladora provoca expresión regulada de la secuencia de nucleótidos estructural ligada. Las “secuencias reguladoras” o “elementos de control” se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5’), dentro de o cadena abajo (secuencias 3’ no traducidas) de una secuencia de nucleótidos estructural y que influyen en el momento y nivel o cantidad de transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN o traducción de la secuencia de nucleótidos estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, potenciadores, estructuras del tallo-bucle, secuencias de unión a represores y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.
Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector integrador. Los vectores integradores típicamente contienen al menos una secuencia homóloga del cromosoma
bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integradores construidos con ADN de diversas cepas de bacilo se integran en el cromosoma de bacilo (documento EP 0 127.328). Los vectores integradores también pueden estar comprendidos por secuencias de bacteriófagos o transposones. También se conocen en la técnica vectores suicida.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente enumerados emplea técnicas de ADN recombinante convencionales. Plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Los ejemplos de vectores de expresión bacteriana disponibles incluyen los vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), en los que, por ejemplo, una proteína de D. v. virgifera o fragmento de la misma, puede ligarse en el vector en fase con secuencias para la Met amino terminal y los 7 restos posteriores de -galactosidasa de modo que se produzca una proteína híbrida y vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989).
Una construcción recombinante de levadura puede incluir típicamente uno o más de los siguientes: una secuencia promotora, secuencia compañera de fusión, secuencia líder, secuencia de terminación de la transcripción, un marcador seleccionable. Estos elementos pueden combinarse en un casete de expresión, que puede mantenerse en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmido) con capacidad de mantenimiento estable en un huésped, tal como levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga, por ejemplo, en levadura para expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de bacterias-levadura incluyen YEp24 (Botstein y col., 1979), pCl/1 (Brake y col., 1984) e YRp17 (Stinchcomb y col., 1982). Además, un replicón puede ser un plásmido de un número de copias alto o bajo. Un plásmido de un número de copias alto generalmente tendrá un número de copias que varía de 5 a 200, y típicamente de 10 a 150. Un huésped que contenga un plásmido de un número de copias alto tendrá preferentemente al menos 10 y más preferentemente al menos 20.
Pueden derivarse secuencias promotoras de levadura útiles de genes que codifican enzimas en la ruta metabólica. Los ejemplos de dichos genes incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (documento EP 0 284044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fofatodeshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK) (documento EP 0 3215447). El gen PHO5 de levadura, que codifica fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles (Myanohara y col., 1983). Además, promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza también actúan como promotores de levadura. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH ligada a la región de activación de la transcripción de GAP (Patente de Estados Unidos N.º 4.876.197 y 4.880.734). Los expertos en la materia conocen ejemplos de secuencias terminadoras de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por levadura, tales como las que codifican enzimas glucolíticas.
Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de levadura con un vector integrador. Los vectores integradores típicamente contienen al menos una secuencia homóloga de un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y preferentemente contienen dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura (Orr-Weaver y col., 1983). Un vector integrador puede dirigirse a un locus específico en levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., mencionado anteriormente. Una o más construcciones de expresión pueden integrarse, posiblemente afectando a los niveles de proteína recombinante producida (Rine y col., 1983).
La presente invención también contempla la transformación de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en una planta para conseguir niveles inhibidores de plagas de la expresión de una o más moléculas de ARNbc. Un vector de transformación puede prepararse fácilmente usando procedimientos disponibles en la técnica. El vector de transformación comprende una o más secuencias de nucleótidos que son capaces de transcribirse a una molécula de ARN y que son sustancialmente homólogas y/o complementarias de una o más secuencias de nucleótidos codificadas por el genoma del insecto, de modo que tras la captación del ARN haya regulación negativa de la expresión de al menos una de las secuencias de nucleótidos respectivas del genoma del insecto.
El vector de transformación puede denominarse construcción de ADNbc y también puede definirse como una molécula recombinante, un agente de control de insectos, una molécula genética o una construcción genética quimérica. Una construcción genética quimérica de la presente invención puede comprender, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican uno o más transcritos antisentido, uno o más transcritos con sentido, uno o más de cada uno de los anteriormente mencionados, en los que todo o una parte de un transcrito de los mismos es homólogo de toda o una parte de una molécula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma de un insecto.
En una realización el vector de transformación de plantas comprende una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor unido operativamente con una o más secuencias de nucleótidos de la presente invención. La secuencia de nucleótidos tiene SEQ ID NO: 704 como se expone en el listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos incluye un segmento que codifica todo o una parte de un ARN presente dentro de un transcrito de ARN de plaga diana y puede comprender repeticiones invertidas de todo o una parte de un ARN de plaga diana. La
molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede contener una secuencia intrónica funcional situada cadena arriba de la secuencia codificante o incluso dentro de la secuencia codificante, y también puede contener una secuencia líder no traducida cinco prima (5’) (es decir, una UTR o 5’-UTR) situada entre el promotor y el punto de inicio de la traducción.
Un vector de transformación de plantas puede contener secuencias de más de un gen, permitiendo de este modo la producción de más de un ARNbc para inhibir la expresión de dos o más genes en células de una plaga diana. Un experto en la materia apreciará fácilmente que los segmentos de ADN cuya secuencia corresponde a la presente en genes diferentes puede combinarse en un único segmento de ADN compuesto para expresión en una planta transgénica. Como alternativa, un plásmido de la presente invención que ya contiene al menos un segmento de ADN puede modificarse por la inserción secuencial de segmentos de ADN adicionales entre las secuencias potenciadora y promotora y terminadora. En el agente de control de insectos de la presente invención diseñado para la inhibición de múltiples genes, los genes para inhibir pueden obtenerse de la misma especie de insecto para potenciar la eficacia del agente de control de insectos. En ciertas realizaciones, los genes pueden derivar de diferentes insectos para ampliar el intervalo de insectos contra los que el agente es eficaz. Cuando múltiples genes son dianas de supresión o una combinación de expresión y supresión, puede fabricarse un elemento de ADN policistrónico como se ilustra y se desvela en Fillatti, Publicación de Solicitud N.º US 2004-0029283.
También se conocen bien en la técnica promotores que actúan en diferentes especies vegetales. Los promotores útiles para expresión de polipéptidos en plantas incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos como se describe en Odell y col., (1985) y/o promotores que están regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espacio-temporalmente. Los promotores preferidos incluyen los promotores de CaMV35S potenciados y el promotor de FMV35S. Para el fin de la presente invención, por ejemplo, para el control óptimo de especies que se alimentan de raíces, puede ser preferible conseguir los niveles mayores de expresión de estos genes dentro de las raíces de plantas. Se han identificado varios promotores potenciados en raíces y se conocen en la técnica (Lu y col., 2000; Patente de Estados Unidos N.º 5.837.848 y 6.489.542).
Un vector de ADN recombinante o construcción de la presente invención comprenderá típicamente un marcador seleccionable que confiere un fenotipo seleccionable en células vegetales. También pueden usarse marcadores seleccionables para seleccionar plantas o células vegetales que contengan los ácidos nucleicos exógenos que codifican polipéptidos o proteínas de la presente invención. El marcador puede codificar resistencia a biocida, resistencia a antibiótico (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418 e higromicina) o resistencia a herbicida (por ejemplo, glifosato). Los ejemplos de marcadores seleccionados incluyen un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina G418, un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen de EPSP sintasa mutante que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitralasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen de acetolactato sintasa mutante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea; y un gen DHFR resistente a metotrexato. Se ilustran ejemplos de dichos marcadores seleccionables en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047
Un vector recombinante o construcción de la presente invención también puede incluir un marcador explorable. Pueden usarse marcadores explorables para supervisar la expresión. Los marcadores explorables ejemplares incluyen un gen de -glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, 1987; Jefferson y col., 1987); un gen del locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y col., 1988); un gen de -lactamasa (Sutcliffe y col., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow y col, 1986) un gen xylE (Zukowsky y col., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de -amilasa (Ikatu y col., 1990); un gen de tirosina (Katz y col., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa a melanina; una -galactosidasa, que cataliza un sustrato de -galactosa cromogénico.
Los vectores de transformación de plantas preferidos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.º 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 y documento EP 0 122 791). También son útiles y se conocen en la técnica plásmidos de Agrobacterium rhizogenes (o “Ri”). Otros vectores de transformación de plantas preferidos incluyen los desvelados, por ejemplo, en Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) y documento EP 0 120 516.
En general se prefiere introducir un ADN recombinante funcional en una localización no específica en un genoma vegetal. En casos especiales puede ser útil insertar una construcción de ADN recombinante por integración específica de sitio. Existen varios sistemas de recombinación específicos de sitio que se sabe que actúan en implantes incluyendo cre-lox como se desvela en la Patente de Estados Unidos 4.959.317 y FLP-FRT como se desvela en la Patente de Estados Unidos 5.527.695.
Se cree que los procedimientos adecuados para transformación de células huéspedes para su uso con la presente invención incluyen prácticamente cualquier procedimiento por el que pueda introducirse ADN en una célula, tal como mediante suministro directo de ADN tal como mediante transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993), mediante captación de ADN mediada por inhibición/desecación (Potrykus y col., 1985), mediante
electroporación (Patente de Estados Unidos N.º 5.384.253), mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; Patente de Estados Unidos N.º 5.302.523 y 5,464,765), mediante transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de Estados Unidos N.º 5.591.616 y 5.563.055) y mediante aceleración de partículas revestidas con ADN (Patentes de Estados Unidos N.º 5.550.318; 5.538.877 y 5.538.880). Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, las células de prácticamente cualquier especie pueden transformarse de forma estable. En el caso de especies multicelulares, las células transgénicas pueden regenerarse en organismos transgénicos.
Se conocen procedimientos para la creación de plantas transgénicas y expresión de ácidos nucleicos heterólogos en plantas en particular y pueden usarse con los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento para preparar plantas transgénicas que muestren susceptibilidad reducida a alimentación de un organismo de plaga diana tal como crisomélidos del maíz. Pueden prepararse vectores de transformación de plantas, por ejemplo, insertando los ácidos nucleicos productores de ARNbc desvelados en el presente documento en vectores de transformación de plantas e introduciendo estos en plantas. Se ha derivado un sistema de vector conocido modificando el sistema de transferencia génica natural de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti (inductores de tumores) grandes que contienen un gran segmento, conocido como ADN-T, que se transfiere a plantas transformadas. Otro segmento de plásmido Ti, la región vir, es responsable de transferencia de ADN-T. La región de ADN-T está limitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados los genes inductores de tumores se han suprimido y las funciones de la región vir se utilizan para transferir ADN ajeno limitado por las secuencias limítrofes de ADN-T. La región T también puede contener un marcador seleccionable para recuperación eficaz de plantas y células transgénicas, y un sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para transferencia tales como un ácido nucleico que codifica ARNbc.
Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación por Agrobacterium contiene típicamente una secuencia de ADN recombinante sencilla individual insertada en un cromosoma y se denomina acontecimiento transgénico. Puede indicarse que dichas plantas transgénicas son heterocigotas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homocigota con respecto a un transgén puede obtenerse autopolinizando una planta transgénica segregante independiente para producir semillas F1. Un cuarto de las semillas F1 producidas serán homocigotas con respecto al transgén. La germinación de semillas F1 da como resultado plantas que pueden ensayarse con respecto a heterocigosidad u homocigosidad, típicamente usando un ensayo de SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotos y homocigotos (es decir, un ensayo de cigosidad).
C. Expresión de ácido nucleico y supresión de gen diana
La presente invención proporciona, como un ejemplo, un organismo diana de plaga simbionte o huésped transformado, células vegetales transformadas y plantas transformadas y su descendencia. Las células vegetales transformadas y plantas transformadas pueden modificarse técnicamente para expresar una o más de las secuencias de ARNbc o ARNip descritas en el presente documento para proporcionar un efecto protector contra plagas. Estas secuencias pueden usarse para supresión génica en un organismo de plaga, reduciendo de este modo la depredación por la plaga en un organismo simbionte o huésped transformado protegido. Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión “supresión génica” se refiera a cualquiera de los procedimientos bien conocidos para reducir los niveles de transcripción génica a ARNm y/o posterior traducción del ARNm.
También se pretende que la supresión génica signifique la reducción de la expresión de proteínas de un gen o una secuencia codificante incluyendo supresión génica postranscripcional y supresión transcripcional. La supresión génica postranscripcional está mediada por la homología entre todo o una parte de un ARNm transcrito a partir de un gen o una secuencia codificante diana de supresión y el ADN bicatenario correspondiente usado para supresión, y se refiere a la reducción sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la célula para unión por ribosomas. El ARN transcrito puede estar en la orientación con sentido para efectuar lo que se denomina cosupresión, en la orientación antisentido para efectuar lo que se denomina supresión antisentido, o en ambas orientaciones produciendo un ARNbc para efectuar lo que se denomina interferencia de ARN (ARNi).
La supresión transcripcional está mediada por la presencia en la célula de un agente de supresión génica de ARNbc que muestra identidad de secuencia sustancial con una secuencia de ADN promotora o el complemento de la misma para efectuar lo que se denomina supresión trans promotora. La supresión génica puede ser eficaz contra un gen vegetal nativo asociado con un rasgo, por ejemplo, para proporcionar a las plantas niveles reducidos de una proteína codificada por el gen nativo o niveles potenciados o reducidos de un metabolito afectado. La supresión génica también puede ser eficaz contra genes diana en plagas de plantas que pueden ingerir o entrar en contacto con material vegetal que contiene agentes de supresión génica, específicamente diseñados para inhibir o suprimir la expresión de una o más secuencias homólogas o complementarias en las células de la plaga. Se desvela supresión génica postranscripcional por ARN en orientación antisentido o con sentido para regular la expresión génica en células vegetales en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.107.065, 5.759.829, 5.283.184 y 5.231.020. El uso de ARNbc para suprimir genes en plantas se desvela en los documentos WO 99/53050, WO 99/49029, Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 2003/0175965 y 2003/0061626, Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 10/465.800 y Patentes de Estados Unidos N.º 6.506.559 y 6.326.193.
Un procedimiento beneficioso de supresión génica postranscripcional en plantas emplea ARN transcrito tanto en orientación con sentido como en orientación antisentido, que se estabiliza, por ejemplo, como una estructura en
horquilla y de tallo y bucle. Una construcción de ADN preferida para efectuar supresión génica postranscripcional es una en la que un primer segmento codifica un ARN que muestra una orientación antisentido que muestra identidad sustancial con un segmento de un gen diana de supresión, que se une con un segundo segmento en orientación con sentido que codifica un ARN que muestra complementariedad sustancial con el primer segmento. Dicha construcción forma una estructura de tallo y bucle mediante hibridación del primer segmento con el segundo segmento y una estructura de bucle de las secuencias de nucleótidos que unen los dos segmentos (véase documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993).
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos para la que la expresión in vitro da como resultado transcripción de una secuencia de ARN estabilizada que es sustancialmente homóloga de una molécula de ARN de un gen diana en un insecto que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma del insecto. Por lo tanto, después de que el insecto ingiera la secuencia de ARN estabilizada incorporada en una dieta o pulverizada en una superficie vegetal, se ve afectada una regulación negativa de la secuencia de nucleótidos correspondiente al gen diana en las células de un insecto diana.
La inhibición de un gen diana usando la tecnología de ARNbc estabilizada de la presente invención es específica de secuencia porque secuencias de nucleótidos correspondientes a la región de doble cadena del ARN son diana de inhibición genética. Se prefiere para inhibición ARN que contenga una secuencia de nucleótidos idéntica a una parte del gen diana. También se ha descubierto que secuencias de ARN con inserciones, supresiones y mutaciones puntuales en relación con la secuencia diana son eficaces para inhibición. En la realización de la presente invención, se prefiere que el ARNbc inhibidor y la parte del gen diana compartan al menos del 80 % de identidad de secuencia, del 90 % de identidad de secuencia, del 95 % de identidad de secuencia, del 99 % de identidad de secuencia o incluso el 100 % de identidad secuencia. Como alternativa, la región de doble cadena del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una parte del transcrito génico diana. Una secuencia de longitud menor que la completa que muestre una mayor homología compensa una secuencia menos homóloga más larga. La longitud de las secuencias de nucleótidos idénticas puede ser de al menos 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos 1000 bases. Normalmente, debería usarse una secuencia de más de 20-100 nucleótidos, aunque se preferiría una secuencia de más de 200-300 nucleótidos, y se preferiría especialmente una secuencia de más de 500-1000 nucleótidos dependiendo del tamaño del gen diana. La invención tiene la ventaja de poder tolerar variaciones de secuencias que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cadena o divergencia evolutiva. Puede que no sea necesario que la molécula de ácido nucleico introducida tenga homología absoluta, puede que no sea necesario que sea de longitud completa, en relación con el producto de transcripción primario o ARN completamente procesado del gen diana. Por lo tanto, los expertos en la materia deben darse cuenta de que, como se desvela en el presente documento, no se requiere 100 % de identidad de secuencia entre el ARN y el gen diana para practicar la presente invención.
La inhibición de la expresión del gen diana puede cuantificarse midiendo el ARN diana endógeno o la proteína producida por traducción del ARN diana y las consecuencias de inhibición pueden confirmarse examinando las propiedades externas de la célula o el organismo. Los expertos en la materia conocen bien técnicas para cuantificar ARN y proteínas. Están disponibles múltiples marcadores seleccionables que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina y tetraciclina y similares.
En ciertas realizaciones la expresión génica se inhibe en al menos 10 %, preferentemente en al menos 33 %, más preferentemente en al menos 50 % y aún más preferentemente en al menos 80 %. En realizaciones particularmente preferidas de la invención la expresión génica se inhibe en al menos 80 %, más preferentemente en al menos 90 %, más preferentemente en al menos 95 % o en al menos 99 % dentro de células en el insecto de modo que tenga lugar una inhibición significativa. Se entiende que la inhibición significativa se refiere a inhibición suficiente que dé como resultado un fenotipo detectable (por ejemplo, cese de crecimiento larvario, parálisis o mortalidad) o una reducción detectable en ARN y/o proteína correspondiente al gen diana que se inhibe. Aunque en ciertas realizaciones de la invención se produce inhibición sustancialmente en todas las células del insecto, en otras realizaciones preferidas se produce inhibición solamente en un subconjunto de células que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen para inhibir desempeña un papel esencial en células en el tracto alimentario del insecto, la inhibición del gen dentro de estas células es suficiente para ejercer un efecto deletéreo en el insecto.
Las moléculas de ARNbc pueden sintetizarse in vivo o in vitro. El ARNbc puede formarse por una única cadena de ARN autocomplementaria o a partir de dos cadenas de ARN complementarias. La ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar en la transcripción in vivo o puede usarse ARN polimerasa clonada para la transcripción in vivo
o in vitro. La inhibición puede ser diana de transcripción especifica en un tipo de órgano, tejido o célula; estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, tensión, temperatura, inductores químicos); y/o modificación de la transcripción en un estadio de desarrollo o edad. Las cadenas de ARN pueden estar o no poliadeniladas; las cadenas de ARN pueden ser capaces o no de traducirse a un polipéptido por el aparato de traducción de una célula.
Un ARN, ARNbc, ARNip o miARN de la presente invención puede producirse químicamente o enzimáticamente por un experto en la materia mediante reacciones manuales o automáticas o in vivo en otro organismo. También puede producirse ARN por síntesis orgánica parcial o total; puede introducirse cualquier ribonucleótido modificado por
síntesis enzimática u orgánica in vitro. El ARN puede sintetizarse por una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6). El uso y la producción de una construcción de expresión se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, WO 97/32016; patentes de Estados Unidos N.º 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693). Si se sintetiza químicamente o mediante síntesis enzimática in vitro, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, puede purificarse ARN a partir de una mezcla mediante extracción con disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía, o una combinación de los mismos. Como alternativa, el ARN puede usarse sin o con un mínimo de purificación para evitar pérdidas debido a procesamiento de muestras. El ARN puede secarse para almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para promover la hibridación y/o estabilización de las dobles cadenas.
Para transcripción a partir de un transgén in vivo o una construcción de expresión, puede usarse una región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador, silenciador y poliadenliación) para transcribir la cadena (o cadenas) de ARN. Por lo tanto, en una realización, las secuencias de nucleótidos para uso en la producción de moléculas de ARN pueden unirse operativamente con una o más secuencias promotoras funcionales en un microorganismo, un hongo o una célula huésped vegetal. Idealmente, las secuencias de nucleótidos se colocan bajo el control de un promotor endógeno, normalmente residente en el genoma del huésped. La secuencia de nucleótidos de la presente invención, bajo el control de una secuencia promotora unida operativamente, puede flanquearse adicionalmente mediante secuencias adicionales que afectan provechosamente a su transcripción y/o la estabilidad de un transcrito resultante. Dichas secuencias se localizan en general cadena arriba del promotor unido operativamente y/o cadena abajo del extremo 3’ de la construcción de expresión y puede aparecer tanto cadena arriba del promotor como cadena abajo del extremo 3’ de la construcción de expresión, aunque también se contempla solamente dicha secuencia cadena arriba.
Como se usa en el presente documento, la expresión “agente de control de insectos” o “agente de supresión génica” se refiere a una molécula de ARN particular que comprende un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN, en la que la complementariedad entre el primer y el segundo segmentos de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos para hibridar in vivo e in vitro para formar una molécula bicatenaria. Puede ser en general preferible incluir un tercer segmento de ARN que se una con y estabilice las primera y segunda secuencias de modo que la estructura completa se forma en una estructura de tallo y bucle, o estructuras de hibridación aún más estrecha puede formar una estructura anudada de tallo-bucle. Como alternativa, podría formarse una horquilla asimétrica sin un tercer segmento en el que no haya un bucle designado, pero por razones estéricas una horquilla crearía su propio bucle cuando el tallo sea suficientemente largo para estabilizarse. El primer y segundo segmentos de ARN generalmente quedarán dentro de la longitud de la molécula de ARN y serán sustancialmente repeticiones invertidas el uno del otro y estarán ligados entre sí por el tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmentos corresponden invariablemente y no respectivamente a una secuencia con sentido y una antisentido respecto al ARN diana transcrito del gen diana en la plaga de insecto diana que se suprime por la ingesta de la molécula de ARNbc. El agente de control de insectos también puede ser una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada (o aislada) y más específicamente moléculas de ácido nucleico o moléculas de fragmentos de ácido nucleico de las mismas de una biblioteca de ADN genómico (ADNg) o ADNc. Como alternativa, los fragmentos pueden comprender oligonucleótidos más pequeños que tienen de 15 a 250 restos de nucleótidos, y más preferentemente de 15 a 30 restos de nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, el término “genoma” como se aplica a células de un insecto o un huésped abarca no solamente ADN cromosómico hallado dentro del núcleo, sino ADN de orgánulos hallado dentro de componentes subcelulares de la célula. Los ADN de la presente invención introducidos en células vegetales pueden por tanto integrarse cromosómicamente o localizarse en orgánulos. El término “genoma” como se aplica a bacterias abarca tanto el cromosoma como plásmidos dentro de una célula huésped bacteriana. Los ADN de la presente invención introducidos en las células huésped bacterianas pueden por lo tanto estar integrados cromosómicamente
o localizarse en plásmidos.
Como se usa en el presente documento, el término “plaga” se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, ascárides, oxiuros, anquilostomas, cestodos, tripanosomas, esquistosomas, éstridos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos que son dominantes en el ambiente humano y que pueden ingerir o entrar en contacto con una o más células, tejidos o fluidos producidos por un huésped o simbionte de plaga transformado para expresar o revestir con un agente de supresión génica bicatenario o que puede ingerir material vegetal que contiene el agente de supresión génica. Como se usa en el presente documento, un rasgo de “resistencia a plaga” es una característica de una planta transgénica, un animal transgénico, un huésped transgénico
o un simbionte transgénico que provoca que la planta, el animal, el huésped o el simbionte sea resistente al ataque de una plaga que típicamente es capaz de infligir daño o pérdida a la planta, el animal, el huésped o el simbionte. Dicha resistencia a plaga puede surgir de una mutación natural o más típicamente de incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia a plagas. Para transmitir resistencia de insectos a una planta transgénica un ADN recombinante puede transcribirse, por ejemplo, en una molécula de ARN que forma una molécula de ARNc dentro de los tejidos o fluidos de la planta recombinante. La molécula de ARNbc está comprendida en parte por un segmento de ARN que es idéntico a un segmento de ARN correspondiente codificado a partir de una secuencia de ADN dentro de una plaga de insecto que prefiere alimentarse de la planta recombinante. La expresión del gen dentro de la plaga de insecto diana se suprime por el ARNbc, y la supresión de expresión del gen en la plaga de insecto diana da como resultado que la planta sea resistente a insectos. Fire y col. (patente de Estados Unidos N.º
6.506.599) describió en general la inhibición de infestación por plagas, proporcionando información específica solamente acerca de varias secuencias de nucleótidos que fueron eficaces para la inhibición de la función génica en la especie de nematodo Caenorhabditis elegans. De forma similar, Plaetinck y col. (documento US 2003/0061626) describen el uso de ARNbc para inhibir la función génica en una diversidad de plagas de nematodos. Mesa y col. (documento US 2003/0150017) describen el uso de secuencias de ADNbc para transformar células huéspedes para expresar secuencias de ARNbc correspondientes que son sustancialmente idénticas a secuencias diana en patógenos específicos, y más particularmente describen construcción de plantas recombinantes que expresan dichas secuencias de ARNbc para ingesta por diversas plagas de plantas, facilitando la regulación negativa de un gen en el genoma de la plaga y mejorando la resistencia de la planta a la infestación por plaga.
La presente invención posibilita la inhibición de la expresión génica de uno o múltiples genes diana en una plaga diana usando procedimientos de ARNbc estabilizado. La invención es particularmente útil en la modulación de la expresión génica eucariota, en particular la modulación de la expresión de genes presentes en plagas que muestran un nivel de pH del sistema digestivo que es de 4,5 a 9,5, más preferentemente de 5,0 a 8,0, y aún más preferentemente de 6,5 a 7,5. Para plagas de plantas con un sistema digestivo que muestra niveles de pH fuera de estos intervalos, pueden desearse procedimientos de suministro para uso que no requiera la ingesta de moléculas de ARNbc.
El efecto modulador de ARNbc es aplicable a una diversidad de genes expresados en las plagas incluyendo, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o la transformación celular, incluyendo genes constitutivos, factores de transcripción y otros genes que codifican polipéptidos implicados en el metabolismo celular.
Como se usa en el presente documento, la expresión “inhibición de la expresión génica” o “inhibición de la expresión de un gen diana en la célula de un insecto” se refiere a la ausencia (o la reducción observable) en el nivel de proteína y/o producto de ARNm del gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin manifestar efectos en otros genes de la célula y sin ningún efecto sobre ningún gen dentro de la célula que produce la molécula de ARNbc. La inhibición de la expresión génica del gen diana en la plaga de insectos puede dar como resultado rasgos fenotípicos nuevos en la plaga de insectos.
La presente invención proporciona en parte un sistema de suministro para el suministro de los agentes de control de insectos a insectos a través de su exposición a una dieta que contiene los agentes de control de insectos de la presente invención. De acuerdo con una de las realizaciones, las moléculas de ARNbc o ARNip estabilizadas pueden incorporarse en la dieta del insecto o pueden superponerse sobre la dieta para consumo por un insecto. La presente invención también proporciona en parte un sistema de suministro para el suministro de los agentes de control de insectos a insectos a través de su exposición a un microorganismo o huésped tal como una planta que contiene los agentes de control de insectos de la presente invención mediante ingesta del microorganismo o las células huésped o los contenidos de las células. De acuerdo con otra realización la presente invención implica generar una célula vegetal transgénica o una planta que contiene una construcción de ADN recombinante que transcribe las moléculas de ARNbc estabilizadas de la presente invención. Como se usa en el presente documento, la expresión “generar una célula vegetal o una planta transgénica” se refiere a los procedimientos para emplear las tecnologías de ADN recombinante fácilmente disponibles en la técnica (por ejemplo, en Sambrook, y col., 1989) para construir un vector de transformación de plantas que transcribe las moléculas de ARNbc estabilizadas de la presente invención, para transformar la célula vegetal o la planta y para generar la célula vegetal transgénica o la planta transgénica que contiene las moléculas de ARNbc estabilizadas transcritas.
En otra realización más, pueden usarse cepas atenuadas, no patógenas, de microorganismos como un vehículo para los agentes de control de insectos y, en esta perspectiva, los microorganismos que portan dichos agentes también se denominan agentes de control de insectos. Los microorganismos pueden modificarse técnicamente para expresar una secuencia de nucleótidos de un gen diana para producir moléculas de ARN que comprendan secuencias de ARN homólogas o complementarias de secuencias de ARN típicamente halladas dentro de las células de un insecto. La exposición de los insectos a los microorganismos da como resultado ingesta de los microorganismos y regulación negativa de la expresión de genes diana mediada directa o indirectamente por las moléculas de ARN o fragmentos o derivados de las mismas.
La presente invención proporciona como alternativa exposición de un insecto a los agentes de control de insectos de la presente invención incorporados en un mezclador de pulverización y aplicados a la superficie de un huésped, tal como una planta huésped. En una realización ejemplar, la ingesta de los agentes de control de insectos por un insecto suministra los agentes de control de insectos al intestino del insecto y posteriormente a las células dentro del cuerpo del insecto. En otra realización, la infección del insecto por los agentes de control de insectos mediante otros medios tales como mediante inyección u otros procedimientos físicos también permite el suministro de los agentes de control de insectos. En otra realización más, las moléculas de ARN en sí mismas se encapsulan en una matriz sintética tal como un polímero y se aplican a la superficie de un huésped tal como una planta. La ingesta de las células huéspedes por el insecto permite el suministro de los agentes de control de insectos al insecto y da como resultado la regulación negativa de un gen diana en el huésped.
Se prevé que las composiciones de la presente invención puedan incorporarse dentro de las semillas de una especie vegetal bien como un producto de expresión de un gen recombinante incorporado en un genoma de las
células vegetales, o bien incorporadas en un revestimiento o tratamiento de semillas que se aplica a las semillas antes de plantar. Se considera en el presente documento que la célula vegetal que contiene un gen recombinante es un acontecimiento transgénico.
Se cree que un tratamiento de semillas con pesticida puede proporcionar ventajas significativas cuando se combina con un acontecimiento transgénico que proporciona protección de la infestación por plagas de coleópteros que está dentro del intervalo de eficacia preferido contra una plaga diana. Además, se cree que existen situaciones que se conocen bien por los expertos en la materia, en las que es ventajoso tener dichos acontecimientos transgénicos dentro del intervalo preferido de eficacia.
La presente invención proporciona en parte un sistema de suministro para el suministro de agentes de control de insectos a insectos. Las moléculas de ARNbc o ARNip estabilizadas de la presente invención pueden introducirse directamente en las células de un insecto, o introducirse en una cavidad extracelular, espacio intersticial, sistema linfático, sistema digestivo, en la circulación del insecto mediante ingesta oral u otros medios que pueda emplear un experto en la materia. Los procedimientos para introducción oral pueden incluir mezclado directo de ARN con alimento del insecto, así como enfoques modificados técnicamente en los que una especie que se usa como alimento se modifica técnicamente para expresar el ARNbc o ARNip, y después se administrar al insecto al que se quiera afectar. En una realización, por ejemplo, las moléculas de ARNbc o ARNip pueden incorporarse en, o superponerse sobre, la dieta del insecto. En otra realización, el ARN puede pulverizarse en una superficie vegetal. En otra realización más, el ARNbc o ARNip puede expresarse por microorganismos y los microorganismos pueden aplicarse a una superficie vegetal o introducirse en una raíz, tallo por un medio físico tal como una inyección. En otra realización más, una planta puede modificarse por ingeniería genética para expresar el ARNbc o ARNip en una cantidad suficiente para matar a los insectos que se sabe que infectan la planta.
Específicamente, en la práctica de la presente invención en WCR, el ARNbc o ARNip estabilizado puede introducirse en el intestino medio dentro del insecto y conseguir la inhibición deseada de los genes diana. Las moléculas de ARNbc o ARNip pueden incorporarse en una dieta o superponerse sobre la dieta como se ha analizado anteriormente y pueden ingerirse por los insectos. En cualquier caso, los ARNbc de la presente invención se proporcionan en la dieta de la plaga diana. La plaga diana de la presente invención mostrará un pH del tracto digestivo de 4,5 a 9,5, de 5 a 8,5, de 6 a 8 o de 6,5 a 7,7, o de aproximadamente 7,0. El tracto digestivo de una plaga diana se define en el presente documento como la localización dentro de la plaga en la que el alimento que ingiere la plaga diana se expone a un ambiente que es favorable para la captación de las moléculas de ARNbc de la presente invención sin padecer un pH tan extremo que se provoque que el enlace de hidrógeno entre las dobles cadenas del ARNbc se disocien y formen moléculas monocatenarias.
También se anticipa que los ARNbc producidos por síntesis química o enzimática pueden formularse de una manera coherente con las prácticas agrícolas comunes y usarse como productos pulverizados para controlar infestaciones por insectos. Las formulaciones pueden incluir los adhesivos y humectantes apropiados requeridos para cobertura foliar eficaz, así como protectores de UV para proteger los ARNbc del daño por UV. Dichos aditivos se usan habitualmente en la industria bioinsecticida y se conocen bien por los expertos en la materia. Dichas aplicaciones podrían combinarse con otras aplicaciones de insecticidas pulverizados, de base biológica o no, para potenciar la protección de la planta de daño por alimentación de insectos.
Los presentes inventores contemplan que pueden usarse cepas bacterianas que producen proteínas insecticidas para producir ARNbc para fines de control de insectos. Estas cepas pueden mostrar propiedades de control de insectos mejoradas. Puede usarse una diversidad de huéspedes bacterianos diferentes para producir ARNbc de control de insectos. Las bacterias ejemplares pueden incluir E. coli, B. thuringiensis, Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Serratia entomophila y Serratia sp. relacionada B. sphaericus, B. cereus, B. laterosporus, B. popilliae, Clostridium bifermentans y otras especies de Clostridium, u tras bacterias gram positivas formadoras de esporas. Ciertas realizaciones, pueden modificarse técnicamente bacterias para el control de plagas tales como mosquitos.
La presente invención también se refiere a construcciones de ARN recombinante para expresión en un microorganismo. Pueden introducirse ácidos nucleicos exógenos de los que se transcribe un ARN de interés en una célula huésped microbiana, tal como una célula bacteriana o una célula fúngica, usando procedimientos conocidos en la técnica.
Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden introducirse en una amplia diversidad de huéspedes de microorganismos procariotas y eucariotas para producir las moléculas de ARNbc o ARNip estabilizadas. El término “microorganismo” incluye especies microbianas procariotas y eucariotas tales como bacterias, hongos y algas. Los hongos incluyen levaduras y hongos filamentosos, entre otros. Los procariotas ilustrativos, tanto gram negativos como gram positivos incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomycetales, y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas están hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluye levadura, tal como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium y Sporobolomyces.
Para el fin de la protección de plantas contra insectos, un gran número de microorganismos que se sabe que habitan en la fitosfera (la superficie de las hojas de plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raíces de plantas) de una amplia diversidad de cultivos importantes también pueden ser células huéspedes deseables para manipulación, propagación, almacenamiento, suministro y/o mutagénesis de las construcciones recombinantes desveladas. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, géneros Bacillus (incluyendo las especies y las subespecies B. thuringiensis kurstaki HD-1,
B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis y B. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ejemplo, géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interés especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans.
D. Plantas transgénicas
La presente invención proporciona semillas y plantas que tienen uno o más acontecimientos transgénicos. Las combinaciones de acontecimientos se denominan acontecimientos transgénicos “apilados”. Estos acontecimientos transgénicos apilados pueden ser acontecimientos que se dirigen a la misma plaga diana o pueden dirigirse a diferentes plagas diana. En una realización, una semilla que tiene la capacidad de expresar un ácido nucleico proporcionado en el presente documento también tiene la capacidad de expresar al menos otro agente insecticida, incluyendo una molécula de ARN cuya secuencia deriva de la secuencia de un ARN expresado en una plaga diana y que forma una estructura de ARN bicatenaria tras expresión en la semilla o células de una planta que ha crecido a partir de la semilla, en la que la ingesta de una o más células de la planta por la plaga diana da como resultado la supresión de la expresión del ARN en las células de la plaga diana.
En ciertas realizaciones, una semilla que tiene la capacidad de expresar un ARNc cuya secuencia deriva de una plaga diana también tiene un acontecimiento transgénico que proporciona tolerancia a herbicida. Un ejemplo beneficioso de un gen de tolerancia a herbicida proporciona resistencia a glifosato, N-(fosfonometil) glicina, incluyendo la forma de sal isopropilamina de dicho herbicida.
En el presente procedimiento, puede usarse combinación de la expresión de una cantidad insecticida de un ARNbc dentro de las células de una semilla transgénica o planta que ha crecido a partir de la semilla acoplado con el tratamiento de la semilla o planta con ciertos pesticidas químicos o proteicos para proporcionar ventajas sinérgicas inesperadas, incluyendo eficacia inesperadamente superior para protección contra daño a la planta transgénica resultante por la plaga diana. En realizaciones particulares, el tratamiento de una semilla transgénica que es capaz de expresar ciertas construcciones que forman moléculas de ARNbc cuya secuencia deriva de una o más secuencias expresadas en un crisomélido del maíz, con de 100 g a 400 g de pesticida por cada 100 kg de semillas proporciona protección inesperadamente superior contra crisomélido del maíz. Además, se cree que dichas combinaciones también son eficaces para proteger las plantas emergentes contra la depredación por otras plagas. Las semillas de la presente invención también pueden usarse para reducir el coste del uso de pesticida, porque puede usarse menos pesticida para obtener una cantidad requerida de protección que cuando no se usan dichos procedimientos. Además, debido a que se usa menos pesticida y debido a que se aplica antes de plantar y sin una aplicación de campo separada, se cree que el procedimiento objeto es por tanto más seguro para el operador y para el ambiente, y es potencialmente menos caro que los procedimientos convencionales.
Por “sinérgico” se entiende que incluye los efectos sinérgicos de la combinación en la actividad (o eficacia) pesticida de la combinación del acontecimiento transgénico y el pesticida. Sin embargo, no se pretende que dichos efectos sinérgicos se limiten a la actividad pesticida, sino que también deberían incluir ventajas inesperadas tales como aumento del alcance de la actividad, perfil de actividad ventajoso en referencia al tipo y cantidad de reducción de daño, coste reducido de pesticida y aplicación, distribución de pesticida reducido en el ambiente, exposición a pesticida reducida del personal que produce, manipula y planta semillas de maíz, y otras ventajas conocidas por los expertos en la materia.
Pueden encontrarse pesticidas e insecticidas que son útiles en composiciones en combinación con los procedimientos y composiciones de la presente invención, incluyendo como tratamientos de semillas y revestimientos, así como procedimientos para usar dichas composiciones, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 6.551.962. Aunque se cree que los tratamientos de semillas pueden aplicarse a una semilla transgénica en cualquier estado fisiológico, puede preferirse que la semilla esté en un estado suficientemente duradero de modo que no inflijan ningún daño durante el proceso de tratamiento. Típicamente, la semilla sería una semilla que se había recolectado del campo; retirado de la parte transgénica; y separado de cualquier otro material vegetal distinto de semilla. La semilla preferentemente también sería biológicamente estable en la medida en que el tratamiento no
provocaría ningún daño biológico a la semilla. En una realización, por ejemplo, el tratamiento puede aplicarse a semilla de maíz que se ha recolectado, limpiado y secado hasta un contenido de humedad por debajo de aproximadamente 15 % en peso. En una realización alternativa, la semilla puede ser una que se ha secado y después sensibilizado con agua y/u otro material y después se ha vuelto a secar antes o durante el tratamiento con el pesticida. Dentro de las limitaciones descritas, se cree que el tratamiento puede aplicarse a la semilla en cualquier momento entre la recolección de la semilla y la siembra de la semilla. Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión “semilla no sembrada” incluye semilla en cualquier periodo entre la recogida de la semilla y la siembra de la semilla en la tierra para el fin de germinación y crecimiento de la planta. Cuando se dice que la semilla no sembrada se “trata” con el pesticida, no se entiende que dicho fragmento incluya las prácticas en las que el pesticida se aplica al suelo, en lugar de a la semilla. Por ejemplo, no se considera que tratamientos tales como la aplicación del pesticida en bandas, bandas “T” o en surco, al mismo tiempo que siembra estén incluidos en la presente invención.
El pesticida, o la combinación de pesticidas, puede aplicarse “puro”, es decir sin ninguna dilución o componentes adicionales presentes. Sin embargo, el pesticida se aplica típicamente a las semillas en forma de una formulación de pesticida. Esta formulación puede contener uno o más componentes deseables adicionales incluyendo, pero sin limitación diluyentes líquidos, aglutinantes para actuar como una matriz para el pesticida, cargas para proteger las semillas durante condiciones de tensión y plastificantes para mejorar la flexibilidad, adhesión y/o untabilidad del revestimiento.
Los pesticidas objeto pueden aplicarse a una semilla como un componente de un revestimiento de semilla. Los procedimientos de revestimiento de semillas y composiciones que se conocen en la técnica son útiles cuando se modifican mediante la adición de una de las realizaciones de la combinación de pesticidas de la presente invención. Dichos procedimientos de revestimiento y aparatos para su aplicación se desvelan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.º 5.918.413. 5.891.246. 5.554.445. 5.389.399. 5.107.787. 5.080.925. 4.759.945 y 4.465.017. Se desvelan composiciones de revestimientos de semillas, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.º 5.939.356, 5.882.713, 5.876.739, 5.849.320, 5.834.447, 5.791.084, 5.661.103, 5.622.003, 5.580.544, 5.328.942, 5.300.127, 4.735.015, 4.634.587, 4.383.391, 4.372.080, 4.339.456, 4.272.417 y 4.245.432.
Los pesticidas que son útiles en el revestimiento son los pesticidas que se describen en el presente documento. La cantidad de pesticida que se usa para el tratamiento de semilla variará dependiendo del tipo de semilla y el tipo de principios activos, pero el tratamiento comprenderá poner en contacto las semillas con una cantidad de la combinación de pesticidas que es pesticidamente eficaz. Cuando los insectos son la plaga diana, esa cantidad será una cantidad de insecticida que sea insecticidamente eficaz. Como se usa en el presente documento, una cantidad insecticidamente eficaz significa la cantidad de insecticida que matará las plagas de insectos en el estado de crecimiento larvario o de pupa, o reducirá uniformemente o retardará la cantidad de daño producida por plagas de insectos.
En general, la cantidad de pesticida que se aplica a la semilla en el tratamiento variará de 10 g a 2000 g del principio activo del pesticida por cada 100 kg del peso de las semillas. Preferentemente, la cantidad de pesticida estará dentro del intervalo de 50 g a 1000 g de activo por cada 100 kg de semillas, más preferentemente dentro del intervalo de 100 g a 600 g de activo por cada 100 kg de semillas, y aún más preferentemente dentro del intervalo de 200 g a 500 g de activo por cada 100 kg de peso de las semillas. Como alternativa, se ha descubierto que se prefiere que la cantidad del pesticida esté por encima de 60 g del principio activo del pesticida por cada 100 kg de las semillas, y más preferentemente por encima de 80 g por cada 100 kg de semillas.
Los pesticidas que se usan en el tratamiento no deben inhibir la germinación de la semilla y deberían ser eficaces en la protección de la semilla y/o la planta durante el tiempo en el ciclo de vida del insecto diana en el que provoca lesión a la semilla o la planta. En general, el revestimiento será eficaz durante 0 a 120 días después de la siembra. Los pesticidas de la invención objeto pueden aplicarse a la semilla en forma de un revestimiento.
Los beneficios proporcionados por la presente invención pueden incluir, pero sin limitación: la facilidad de introducción de ARNbc en las células de insecto, la baja concentración de ARNbc que puede usarse, la estabilidad de ARNbc y la eficacia de la inhibición. La capacidad de usar una baja concentración de un ARNbc estabilizado evita varias desventajas de interferencia antisentido. La presente invención no se limita al uso in vitro o a composiciones de secuencias específicas, a un conjunto particular de genes diana, una parte particular de la secuencia de nucleótidos del gen diana o un transgén particular o a un procedimiento de suministro particular, a diferencia de algunas de las técnicas disponibles conocidas en este campo, tales como antisentido y co-supresión. Además, la manipulación genética se hace posible en organismos que no son modelos genéticos clásicos.
En la práctica de la presente invención, puede llevarse a cabo selecciones para asegurar que la presencia de las secuencias de nucleótidos que se transcriben a partir de la construcción recombinante no es perjudicial para células que no son de plaga. Esto puede conseguirse dirigiendo a genes que muestran un bajo grado de identidad de secuencia con genes correspondientes en una planta o un animal vertebrado. Preferentemente el grado de la identidad de secuencia es menor del 80 %. Más preferentemente el grado de identidad de secuencia es menor del 70 %. Más preferentemente el grado de identidad de secuencia es menor del 60 %.
Además de transformación directa de una planta con una construcción de ADN recombinante, pueden prepararse plantas transgénicas cruzando una primera planta que tenga una construcción de ADN recombinante con una segunda planta que carezca de la construcción. Por ejemplo, puede introducirse ADN recombinante para supresión génica en la primera línea vegetal que es susceptible de transformación para producir una planta transgénica que puede cruzarse con una segunda línea vegetal para introgresión del ADN recombinante para supresión génica en la segunda línea vegetal.
La presente invención puede, en la práctica, combinarse con otros rasgos de control de insectos en una planta para conseguir rasgos deseados para potenciar el control de la infestación por insectos. La combinación de rasgos de control de insectos que emplean distintos modos de acción puede proporcionar plantas transgénicas protegidas de insectos con durabilidad superior frente a plantas que albergan un único rasgo de control de insectos debido a la probabilidad reducida de que se desarrolle resistencia en el campo.
El mecanismo de actividad insecticida de proteínas cristal de B. thuringiensis se ha estudiado exhaustivamente en la última década. Se ha mostrado que las proteínas cristal son tóxicas para la forma larvaria del insecto solamente tras ingesta de la proteína. En larvas de lepidópteros, un pH alcalino y enzimas proteolíticas en el intestino medio de insecto solubilizan las proteínas, permitiendo de este modo la liberación de componentes que son tóxicos para el insecto. Estos componentes tóxicos alteran las células del intestino medio, provocan que el insecto deje de alimentarse y, con el tiempo, provocan la muerte del insecto. Por esta razón, las toxinas de B. thuringiensis han demostrado ser insecticidas eficaces y ambientalmente seguros para tratar diversas plagas de insectos. Los insectos coleópteros y hemípteros, y probablemente dípteros, lygus y otros insectos picadores y chupadores muestran un pH del intestino que es ligeramente ácido, y por lo tanto las toxinas Bt que son eficaces contra larvas de lepidópteros son ineficaces contra estas plagas. También se cree que el pH ligeramente ácido del intestino de estos insectos es más favorable para las composiciones de la presente invención, y sin pretender quedar limitado a una teoría particular, es probable que el pH alcalino del intestino de larvas de lepidópteros sea una razón que contribuya a que los intentos anteriores de mostrar eficacia de ARNbc hayan fracasado (Fire y col. Patente de Estados Unidos N.º 6.506.559; Mesa y col. Publicación de Patente N.º US2003/0150017; Rajagopal y col., 2002; Tabara y col., 1998). Se cree por lo tanto que los procedimientos de ARNbc desvelados en el presente documento deberían usarse preferentemente en composiciones y en plantas para controlar insectos coleópteros, dípteros, hemípteros, lygus y picadores y chupadores. Los procedimientos y composiciones expuestos en el presente documento son particularmente útiles para dirigir genes para supresión en insectos que muestran un pH intestinal de 4,5, a 9,5, de 5,0 a 9,0, de 5,5 a 8,5, de 6,0 a 8,0, de 6,5 a 7,7, de 6,8 a 7,6 o aproximadamente 7,0. Sin embargo, también se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención insectos y otras especies de plagas que muestren un pH intestinal de 7,5 a 11,5, de 8,0 a 11,0 o de 9,0 a 10,0, tales como larvas de insectos lepidópteros. Esto es particularmente cierto cuando se proporciona un ARNbc específico para inhibir un gen en una larva de lepidóptero en la dieta de la larva junto con una o más proteínas Bt, que, con respecto a la proteína Bt, serían habitualmente tóxicas para esa larva de lepidóptero cuando se proporcionen a o por encima de un nivel umbral. La presencia de una o más toxinas Bt tóxicas para la misma especie de insecto reduciría eficazmente el pH del intestino, proporcionando un ambiente estable para que las moléculas de ARN bicatenario ejerzan sus efectos en la supresión de un gen diana en la plaga de insectos.
Se anticipa que la combinación de ciertas construcciones de ARNbc estabilizadas con uno o más genes de proteínas de control de insectos dé como resultado sinergias que potencien el fenotipo de control de insectos de una planta transgénica. Pueden usarse bioensayos de insectos que emplean tejido de planta completo o de dieta artificial para definir respuestas a dosis para mortalidad larvaria o inhibición del crecimiento usando tanto ARNbc como proteínas de control de insectos. Un experto en la materia puede ensayar mezclas de moléculas de ARNbc y proteínas de control de insectos en un bioensayo para identificar combinaciones de activos que sean sinérgicos y deseables para el despliegue en plantas protegidas contra insectos (Tabashnik, 1992). Se ha presentado sinergia en la destrucción de plagas de insectos entre diferentes proteínas de control de insectos (para una revisión, véase Schnepf y col., 1998). Se anticipa que existirán sinergias entre ciertos ARNbc y entre ciertos ARNbc y ciertas proteínas de control de insectos.
La invención también se refiere a productos de consumo que contienen una o más de las secuencias de la presente invención, y los producidos a partir de una planta o semilla recombinante que contiene una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención se contemplan específicamente como realizaciones de la presente invención. Se entiende que un producto de consumo que contiene una o más de las secuencias de la presente invención incluye harinas, aceites, granos molidos o completos o semillas de una planta, o cualquier producto alimentario que comprenda cualquier harina, aceite o grano triturado o completo de una planta o semilla recombinante que contenga una o más de las secuencias de la presente invención. La detección de una o más de las secuencias de la presente invención en uno o más artículos o productos de consumo contemplados en el presente documento es una prueba de facto de que el artículo o producto de consumo está compuesto por una planta transgénica diseñada para expresar una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención para el fin de controlar la infestación por insectos usando procedimientos de supresión génica mediada por ARNbc.
E. Obtención de ácidos nucleicos
La presente invención proporciona un procedimiento para obtener un ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos para producir un ARNbc o ARNip. En una realización, dicho procedimiento comprende: (a) explorar una biblioteca de ADNc o ADNg con una sonda de hibridación que comprende toda o una parte de una secuencia de nucleótidos o un homólogo de la misma de un insecto diana; (b) identificar un clon de ADN que hibrida con la sonda de hibridación; (c) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (d) secuenciar el fragmento de ADNc o ADNg que comprende el clon aislado en la etapa (c) en el que la molécula de ácido nucleico secuenciada transcribe toda o una parte sustancial de la secuencia de ácido nucleico de ARN o un homólogo de la misma.
En otra realización, un procedimiento de la presente invención para obtener un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos para producir una parte sustancial de un ARNbc o ARNip comprende: (a) sintetizar un primer y un segundo cebadores oligonucleotídicos correspondientes a una parte de una de las secuencias de nucleótidos de un insecto diana; y (b) amplificar un molde de ADNc o ADNg en un vector de clonación usando los primer y segundo cebadores oligonucleotídicos de la etapa (a) en el que la molécula de ácido nucleico amplificada transcribe una parte sustancial de un ARNbc/ARNip de la presente invención.
En la práctica de la presente invención, un gen diana puede derivar de un crisomélido del maíz (CRW), tal como un WCR o un SCR, o cualquier especie de insecto que provoque daño a las plantas de cultivo y pérdidas de producción consecuentes. Se contempla que pueden emplearse varios criterios en la selección de genes diana preferidos. El gen es uno cuyo producto proteico tiene una tasa de renovación rápida, de modo que la inhibición de ARNbc dará como resultado una rápida reducción de los niveles de proteínas. En ciertas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el que un pequeño descenso en el nivel de expresión dé como resultado efectos deletéreos para el insecto. Si se desea dirigir a una serie amplia de especies de insecto se selecciona un gen que está altamente conservado entre estas especies. Por el contrario, para el fin de conferir especificidad, en ciertas realizaciones de la invención, se selecciona un gen que contenga regiones que estén escasamente conservadas entre especies de insectos individuales, o entre insectos y otros organismos. En ciertas realizaciones puede ser deseable seleccionar un gen que no tenga homólogos conocidos en otros organismos.
Como se usa en el presente documento, la expresión “derivado de” se refiere a una secuencia de nucleótidos específica que puede obtenerse de una fuente o especie específica particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie específica.
En una realización, se selecciona un gen que se expresa en el intestino del insecto. Los genes de dirección expresados en el intestino evitan el requisito de que el ARNbc se propague dentro del insecto. Los genes diana para uso en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, los que comparten homologías sustanciales con las secuencias de nucleótidos de genes expresados en el intestino conocidos que codifican componentes proteicos de la protón V-ATPasa de membrana plasmática y vacuolar (Dow y col., 1997; Dow, 1999). Este complejo proteico es el único activador del transporte de iones epitelial y es responsable de la alcalinización de la luz del intestino medio. La V-ATPasa también se expresa en los túbulos de Malpighi, un crecimiento del intestino posterior del insecto que actúa en equilibrio fluido y destoxificación de compuestos ajenos de una manera análoga a un órgano renal de un mamífero. En otra realización, la V-ATPasa puede ser Vha68-2, o un homólogo u ortólogo de la misma (por ejemplo como se encuentra en SEQ ID NO: 821).
En otra realización, se selecciona un gen que está implicado esencialmente en el crecimiento, desarrollo y reproducción de un insecto. Los genes ejemplares incluyen pero sin limitación un gen de CHD3, un gen de tubulina y un gen que codifica una proteína que se ha predicho que está implicada en el transporte. El gen de CHD3 en Drosophila melanogaster codifica una proteína con actividad ADN helicasa dependiente de ATP que está implicada en el ensamblaje/desensamblaje de cromatina en el núcleo. Se han descubierto secuencias similares en diversos organismos tales como Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae. La familia del gen de beta-tubulina codifica proteínas asociadas a microtúbulos que son un constituyente del citoesqueleto celular. Se encuentran secuencias relacionadas en organismos diversos tales como C. elegans y Manduca sexta. Se han encontrado proteínas que se ha predicho que son subunidades del complejo de clasificación endosómica requerido para el transporte (ESCRT)-III (Babst y col., 2002), por ejemplo Dv49, en diversos organismos incluyendo mamíferos, levadura e insectos tales como D. virgifera. Otra proteína relacionada con el transporte es la proteína de ’-coatómero, abreviada como ’Cop, que codifica un producto implicado en el transporte retrógrado (de Golgi a RE). Se han identificado secuencias similares o predichas en C. elegans y D. virgifera, por ejemplo Dv248.
Otros genes diana para su uso en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, los que desempeñan papeles importantes en la viabilidad, el crecimiento, el desarrollo, la reproducción y la infecciosidad. Estos genes dianas pueden ser uno de los genes constitutivos, factores de transcripción y genes específicos de insectos o mutaciones de desactivación letales en Drosophila. Los genes diana para uso en la presente invención también pueden ser los que son de otros organismos, por ejemplo, de un nematodo (por ejemplo C. elegans). Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos para uso en la presente invención pueden derivar también de genes vegetales, virales, bacterianos o fúngicos cuyas funciones se han establecido en la bibliografía y cuyas secuencias de nucleótidos comparten similitud sustancial con los genes diana en el genoma de un insecto. De acuerdo con un aspecto de la presente invención para control de WCR, las secuencias diana pueden derivar esencialmente del insecto WCR diana. Algunas de las secuencias diana ejemplares de la biblioteca de ADNc de WCR que codifican proteínas de D. virgifera o fragmentos de las mismas que son homólogos de proteínas conocidas pueden encontrarse en el listado de secuencias. Se conocen moléculas de ácidos nucleicos de D. virgifera que codifican homólogos de proteínas
conocidas (Andersen y col., Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º de Serie 10/205.189).
Para el fin de la presente invención, las moléculas de ARNbc o ARNip pueden obtenerse de CRW mediante amplificación en cadena de la polimerasa (PCR™) de una secuencia génica de CRW diana derivada de una biblioteca de ADNg o ADNc de crisomélido del maíz o partes de la misma. Las larvas de WCR pueden prepararse usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia y puede extraerse ADN/ARN. Pueden usarse larvas con diversos tamaños que varían de CRW de fase 1 a adultos para el fin de la presente invención para extracción de ADN/ARN. Pueden usarse bibliotecas de ADN genómico o ADNc generadas a partir de WCR para amplificación por PCR™ para la producción del ARNbc o ARNip.
Los genes diana pueden después amplificarse por PCR™ y secuenciarse usando los procedimientos fácilmente disponibles en la técnica. Un experto en la materia puede ser capaz de modificar las condiciones de PCR™ para asegurar la formación de producto de PCR™ óptima. El producto de PCR™ confirmado puede usarse como un molde para transcripción in vitro para generar ARN con sentido y antisentido con los promotores mínimos incluidos.
Los presentes inventores contemplan que pueden usarse secuencias de ácido nucleico identificadas y aisladas de cualquier especie de insecto en el reino de los insectos en la presente invención para el control de WCR y otros insectos diana. En un aspecto de la presente invención, el ácido nucleico puede derivar de una especie de coleóptero. Específicamente, el ácido nucleico puede derivar de crisomélidos que pertenecen al género Diabrotica (Coleoptera, Chrysomelidae) y más específicamente las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden derivar de especies en el grupo de virgifera. Más específicamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden derivar de Diabrotica virgifera virgifera LeConte que normalmente se denomina WCR. Los ácidos nucleicos aislados pueden ser útiles, por ejemplo, para identificar un gen diana y para construir un vector recombinante que produce ARNbc o ARNip estabilizados de la presente invención para proteger plantas de infestaciones por insectos WCR.
Por lo tanto, en una realización, la presente invención comprende secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas de WCR o Lygus que pueden usarse como los agentes de control de insectos. Las secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas pueden comprender las expuestas en el listado de secuencias.
Los ácidos nucleicos de WCR u otros insectos que pueden usarse en la presente invención también pueden comprender moléculas de ácido nucleico de EST y Unigenes aisladas y sustancialmente purificadas o moléculas de fragmentos de ácido nucleico de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico de EST pueden codificar partes significativas de, o de hecho la mayoría de, los polipéptidos. Como alternativa, los fragmentos pueden comprender oligonucleótidos más pequeños que tengan de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 restos de nucleótidos, y más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 restos de nucleótidos. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico para uso en la presente invención pueden ser de bibliotecas de ADNc de WCR, o de cualquier otra especie de plaga de coleópteros.
Pueden emplearse moléculas de ácido nucleico y fragmentos de las mismas de WCR, u otras especies de plagas de coleópteros para obtener otras moléculas de ácido nucleico de otras especies para su uso en la presente invención para producir moléculas de ARNbc y ARNip deseadas. Dichas moléculas de ácido nucleico incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia codificante completa de una proteína y promotores y secuencias flanqueantes de dichas moléculas. Además, dichas moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican miembros de una familia génica. Dichas moléculas pueden obtenerse fácilmente usando las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas o fragmentos de las mismas para explorar, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o ADNg obtenidas de D. v. virgifera u otros coleópteros, o de Lygus hesperus. Se conocen bien en la técnica procedimientos para formar dichas bibliotecas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia codificante”, “secuencia de nucleótidos estructural”
o “molécula de ácido nucleico estructural” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se traduce en un polipéptido, habitualmente mediante ARNm, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio de la traducción en el extremo 5’ y un codón de terminación de la traducción en extremo 3’. Una secuencia codificante puede incluir ADN genómico, ADNc, EST y secuencias de nucleótidos recombinantes.
La expresión “ADN recombinante” o “secuencia de nucleótidos recombinante” se refiere a ADN que contiene una modificación por ingeniería genética mediante manipulación por mutagénesis, enzimas de restricción y similares.
Para muchos de los insectos que son dianas potenciales para el control por la presente invención, puede existir información limitada con respecto a las secuencias de la mayoría de los genes o del fenotipo resultante de mutación de genes particulares. Por lo tanto, los presentes inventores contemplan que la selección de genes apropiados de plagas de insectos para uso en la presente invención puede conseguirse mediante el uso de información disponible del estudio de los genes correspondientes en un organismo modelo tal como Drosophila, en alguna otra especie de insectos, o incluso en una especie de nematodo, en una especie fúngica, en una especie vegetal, en la que los genes se han caracterizado. En algunos casos será posible obtener la secuencia de un gen correspondiente de un insecto diana buscando en bases de datos tales como GenBank usando el nombre del gen o la secuencia de, por
ejemplo, Drosophila, otro insecto, un nematodo, un hongo o una planta de la que se haya clonado el gen. Una vez que se ha obtenido la secuencia, puede usarse PCR™ para amplificar un segmento seleccionado de forma apropiada del gen en el insecto para su uso en la presente invención.
Para obtener un segmento de ADN del gen correspondiente en una especie de insecto, pueden diseñarse cebadores de PCR™ basándose en la secuencia como se encuentra en WCR u otros insectos de los que se ha clonado el gen. Los cebadores se diseñan para amplificar un segmento de ADN de suficiente longitud para su uso en la presente invención. Se prepara ADN (bien ADN genómico o bien ADNc) de la especie de insecto, y los cebadores de PCR™ se usan para amplificar el segmento de ADN. Se seleccionan condiciones de amplificación de modo que se produzca amplificación incluso si los cebadores no coinciden exactamente con la secuencia diana. Como alternativa, gen (o una parte del mismo) puede clonarse a partir de una biblioteca de ADNg o ADNc preparada a partir de la especie de plaga de insectos, usando el gen de WCR u otro gen de insecto conocido como una sonda. Se conocen técnicas para realizar PCR™ y clonar a partir de bibliotecas. Se proporcionan en los ejemplos detalles adicionales del proceso por el que los segmentos de ADN de especies de plagas de insectos diana pueden aislarse basándose en la secuencia de genes previamente clonados de WCR u otras especies de insecto. Un experto habitual en la materia reconocerá que puede usarse una diversidad de técnicas para aislar segmentos génicos de especies de plagas de insectos que corresponden a genes previamente aislados de otras especies.
Cuando un insecto es la plaga diana para la presente invención, dichas plagas incluyen: del orden Lepidópteros, por ejemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; del orden Coleópteros, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; del orden Ortópteros, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. y Schistocerca spp.; del orden Isópteros, por ejemplo, Reticulitemes ssp; del orden Psocópteros, por ejemplo, Liposcelis spp.; del orden Anopluros, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; del orden Malófagos, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; del orden Tisanópteros, por ejemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; del orden Heterópteros, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa. spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., familia de Miridae spp. tal como Lygus hesperus y Lygus lineoloris, familia de Lygaeidae spp. tal como Blissus leucopterus, y familia de Pentatomidae spp.; del orden Homópteros, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri;
del orden Himenópteros, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius sppp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. y Vespa ssp.; del orden Dípteros, por ejemplo,
Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Tipula spp., del orden Sifonápteros, por ejemplo, Ceratophyllus spp. y Xenopsylla cheopis y del orden Tisanuros, por ejemplo, Lepisma saccharina.
Se ha descubierto que la presente invención es particularmente eficaz cuando la plaga de insecto es una Diabrotica spp., y especialmente cuando la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (Crisomélido del Maíz Occidental, WCR), Diabrotica barberi (Crisomélido del Maíz Septentrional, NCR), Diabrotica virgifera zea (Crisomélido del Maíz Mejicano, MCR), Diabrotica balteata (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR) o complejo de Crisomélido del Maíz Brasileño (BCR) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa), o Diabrotica undecimpunctata howardi (Crisomélido del Maíz Meridional, SCR).
Ejemplos
Los inventores del presente documento han identificado medios para controlar infestación por plaga de coleópteros proporcionando moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias en la dieta de plagas. Sorprendentemente, los inventores han descubierto moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias que actúan tras la ingesta por la plaga para inhibir una función biológica en la plaga, dando como resultado uno o más de los siguientes atributos: reducción en la alimentación por la plaga, reducción en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibición de la diferenciación y el desarrollo de la plaga, ausencia de o reducción de la capacidad de reproducción sexual por la plaga, formación de músculo, formación de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación, desarrollo y diferenciación de patas, formación de huevos, maduración de larvas, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración, apoptosis y cualquier componente de una estructura citoesquelética de células eucariotas, tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas. Uno cualquiera o cualquier combinación de estos atributos puede dar como resultado una inhibición eficaz de la infestación de plagas, y en el caso de una plaga vegetal, inhibición de la infestación vegetal. Por ejemplo, cuando se usa como dieta una composición que contiene una cantidad suficientemente inhibidora de plagas de una o más moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias proporcionadas por vía tópica a una planta, como un tratamiento de semilla, como una aplicación al suelo alrededor de una planta, o cuando se produce por una planta a partir de una molécula de ADN recombinante presente dentro de las células de una planta, la infestación por plaga vegetal se reduce drásticamente de forma inesperada. Los Ejemplos expuestos en el presente documento posteriormente son ilustrativos de la invención cuando se aplican a una única plaga. Los Ejemplos no abarcados por el alcance de las reivindicaciones son para fines ilustrativos.
Ejemplo 1
Identificación de secuencias de nucleótidos diana para preparación de ARNbc útil para controlar crisomélidos del maíz.
Se construyeron bibliotecas de ADNc de crisomélido del maíz (LIB149, LIB 150, LIB3027, LIB3373) a partir de larvas completas, pupas y de secciones del intestino medio diseccionadas, y se obtuvo información de secuencias de nucleótidos (véase Andersen y col., Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º de Serie 10/205.189 presentada el 24 de julio de 2002). Además, se construyeron bibliotecas de ADNc a partir de larvas completas en diferentes estadios del desarrollo y en momentos diferentes dentro de cada estadio del desarrollo para maximizar el número de secuencias de EST diferentes de las especies de Diabrotica. Se construyeron bibliotecas LIB5444 y LIB5462 respectivamente a partir de grupos de ARNm obtenidos de larvas de Crisomélido del Maíz Occidental de primera (1 g) y tercera (2,9 g) etapa. Los insectos recogidos se congelaron rápidamente por inserción en nitrógeno líquido. Los insectos se molieron en un mortero mantenido a o por debajo de -20 ºC enfriando en hielo seco y/o con la adición de nitrógeno líquido al mortero hasta que el tejido se molió en un polvo fino. Se extrajo ARN usando reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aisló ARN Poly A+ a partir del prep de ARN total usando DYNABEADS Oligo dT (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc a partir de ARN de Poly A+ usando el Sistema de Plásmido SuperScript™ (Invitrogen). El ADNc se fraccionó por tamaño usando cromatografía. Se recogieron las cuarta y quinta fracciones y se ligaron en el vector pSPORT1 (Life Technologies Inc., Gaithersburg MD) entre los sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción Sal1 y Not1, y se transformó en células electro-componentes de E. coli DH10B mediante electroporación. La biblioteca de larvas de primera etapa produjo aproximadamente 420.000 unidades formadoras de colonias. La biblioteca de larvas de tercera etapa produjo aproximadamente 2,78 x 106 unidades formadoras de colonias. Se lavaron colonias LIB 149, LIB150 de las placas, se mezclaron hasta su uniformidad agitando vorticialmente brevemente, y se agruparon en tampón de Tris-EDTA. La mitad del lavado se llevó a glicerol 10 %, se separaron alícuotas en crioviales, y se almacenaron a -70 ºC. La otra mitad se usó para producir ADN plasmídico usando una columna de purificación midi
prep Quiagen, o su equivalente. Se separaron alícuotas ADN de plásmido purificado a tubos de microcentrífuga y se almacenó a -20 ºC.
Se amplificaron colonias de las bibliotecas de ADNc de Diabrotica virgifera LIB5444 y LIB5462 invidualmente en un medio de viscosidad alta. Se mezclaron aproximadamente 200.000 unidades formadoras de colonias de LIB5444 y
600.000 unidades formadoras de colonias de LIB5462 en una placa de agitación por separado en 500 ml de medio LB que contenía agarosa SeaPrep 0,3% y carbenicilina 50 mg/l a 37 ºC y después se enfrió rápidamente en un baño de agua/hielo durante 1 hora permitiendo la suspensión uniforme de las colonias bacterianas. Las bibliotecas inoculadas se cultivaron después a 30 ºC durante 42 horas. Después de la incubación, las células se mezclaron durante 5 minutos en una placa de agitación. El medio se transfirió después a dos frascos de centrífuga de 250 ml. Las células bacterianas se sedimentaron a 10.000 x g durante 10 minutos. El medio se retiró de los frascos y las células se resuspendieron en un total de 20 ml de medio LB con carbenicilina 50 mg/l. Se añadió dimetil sulfóxido a 10 % para conservar las células congeladas. Ambas bibliotecas se amplificaron hasta un título final de 108 unidades formadoras de colonias por mililitro. Las muestras de las bibliotecas de ADNc de Diabrotica virgifera LIB5444 y LIB5462 se combinaron y se ajustaron hasta una concentración de ADN de aproximadamente 1,25 microgramos por microlitro en agua estéril destilada y desionizada y se separaron en alícuotas en veinticinco crioviales, conteniendo cada criovial aproximadamente 8,75 microgramos de ADN. Estas muestras se depositaron por el solicitante o los solicitantes/inventores en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) localizada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, Estados Unidos ZIP 20110-2209 el 10 de junio de 2004 y se denominaron LIB5444/62. La ATCC proporcionó al Solicitante un recibo de depósito, que asignaba la Referencia de Depósito de ATCC N.º PTA-6072.
Se prepararon bibliotecas de ADNc de alto peso molecular de crisomélido del maíz, es decir, LIB5496 y LIB5498, esencialmente como se ha descrito anteriormente para la producción de bibliotecas de ADNc de crisomélido del maíz. Se construyeron bibliotecas LIB5496 y LIB5498 respectivamente a partir de grupos de ARNm obtenidos de larvas de Crisomélido del Maíz Occidental de primera (1 gramo) y segunda y tercera (1 gramo) etapas. Brevemente, los insectos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los insectos congelados se redujeron hasta un polvo fino moliendo en un mortero. Se extrajo ARN usando reactivo de TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aisló ARN de Poli A+ a partir del prep de ARN total usando DYNABEADS Oligo dT (Invitrogen). Se preparó una biblioteca de ADNc de alto peso molecular a partir de 20 microgramos de ARN de Poli A+ usando el Sistema de Plásmido SuperScript™ (Invitrogen). El ADNc se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa 1 % en TAE, y se recogió ADNc en el intervalo de entre 1 Kb y 10 Kb y se ligó en el vector pSPORT1 entre los sitios de restricción Sal1 y Not1 y se transformó en células electro-componentes de E. coli DH10B mediante electroporación. LIB5496 produjo un título total de aproximadamente 3,5 x 106 unidades formadoras de colonias. LIB5498 produjo un título total de aproximadamente 1,0 x 106 unidades formadoras de colonias. Se amplificaron colonias de las bibliotecas de ADNc de alto peso molecular de crisomélido del maíz LIB5496 e LIB5498 individualmente en un medio de alta viscosidad. Se mezclaron aproximadamente 600.000 unidades formadoras de colonias de LIB5496 y LIB5498 en una placa de agitación por separado en 500 ml de medio LB que contenía agarosa SeaPrep 0,3% y carbenicilina 50 mg/l a 37 ºC y después se enfrió rápidamente en un baño de agua/hielo durante 1 hora permitiendo la suspensión uniforme de las colonias bacterianas. Las bibliotecas se cultivaron después a 30 ºC durante 42 horas. Después de incubación, las células se mezclaron durante 5 minutos en una placa de agitación. El medio se transfirió después a dos frascos de centrífuga de 250 ml. Las células bacterianas se sedimentaron a 10.000 x g durante 10 minutos. El medio se retiró de los frascos y las células se resuspendieron en un total de 20 ml de medio LB con carbenicilina 50 mg/l. Se añadió dimetil sulfóxido a 10 % para conservar las células congeladas. Ambas bibliotecas se amplificaron hasta un título final de 108 unidades formadoras de colonias por mililitro. Se obtuvo información de secuencia de ADNc insertado a partir de las bibliotecas de plásmidos específicos de especies de crisomélidos del maíz.
Las bibliotecas de crisomélidos de Andersen y col. junto con secuencias adicionales de las bibliotecas LIB5444 y LIB5462 produjeron inicialmente aproximadamente 18.415 secuencias de EST individuales que consistían en aproximadamente 1,0 x 107 restos de nucleótidos. La longitud promedio de una secuencia de EST era de aproximadamente 586 restos de nucleótidos. Estas secuencias de EST se sometieron a algoritmos de bioinformática que dieron como resultado el ensamblaje de secuencias de contig indicadas en el presente documento como secuencias de UNIGENE y secuencias de EST individuales que no podrían compilarse por identidad solapante con otras secuencias de EST, denominadas en el presente documento conjuntos individuales. Las bibliotecas LIB5444 y LIB5462 se secuenciaron después en mucha mayor profundidad, dando como resultado secuencias de EST individuales adicionales. Se seleccionaron secuencias de EST obtenidas de bibliotecas, es decir, LIB149, LIB150, LIB3027, LIB3373, LIB5444, LIB5462, LIB5496 y LIB5503 para investigación adicional en bioensayos de alimentación como se expone posteriormente y las secuencias correspondientes se proporcionan en el listado de secuencias.
Las secuencias de EST aisladas de bibliotecas de ADNc de CRW se ensamblaron, cuando fue posible, en conjuntos de UNIGENE y estas secuencias de Unigene ensambladas se incluyen en el listado de secuencias. Un UNIGENE es un grupo orientado a genes formado a partir del solapamiento de secuencias de EST individuales dentro de regiones de identidad de secuencia para formar una secuencia mayor. Pontius y col. (2003). Cada secuencia de nucleótidos como se expone en el listado de secuencias se analizó para identificar la presencia de fases de lectura abiertas. Se
comparó la información de secuencia de aminoácidos deducida a partir de fases abiertas de lectura para conocer información de secuencias de aminoácidos disponible en bases de datos públicas para deducir el grado de identidad
o similitud de secuencias de aminoácidos para las secuencias de aminoácidos conocidas. Se anotó función biológica, si la hubiera, asociada con secuencias de aminoácidos conocidas en bases de datos públicas para las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de la información de secuencia de nucleótidos de biblioteca de ADNc. Las anotaciones proporcionaron información que sugería la función de una proteína que puede expresarse a partir de un gen particular que dio lugar a una secuencia de ADNc particular, pero no fue determinante del resultado. Basándose en la información de anotación sugerente, ciertas secuencias de ADNc se caracterizaron como las que codificaron una proteína que probablemente estaba implicada en alguna función biológica dentro de células de crisomélidos del maíz que era esencial para la vida o que era necesaria para asegurar la salud y vitalidad de una célula, o que era probable que estuvieran implicadas en la integridad celular, el mantenimiento celular, la capacidad de reproducción y similares.
Se usaron secuencias seleccionadas para investigación adicional en la construcción de moléculas de ARN bicatenario para incorporación en la dieta de CRW. Se diseñaron pares de cebadores de amplificación térmica basándose en secuencias de partida de ADNc y EST para obtener secuencias usadas en ensayos de alimentación. Se construyeron pares de cebadores como un par de secuencias de nucleótidos, mostrando cada miembro de un par de cebadores complementariedad perfecta con una secuencia con sentido o una antisentido. Algunas secuencias de pares de cebadores se construyeron de modo que cada miembro del par mostrara una secuencia que contuviera un promotor de ARN polimerasa de fago T7 en su extremo 5’. Preferentemente, se llevó a cabo una primera reacción de amplificación de mayor fidelidad usando un primer par de cebadores que carecía de un promotor T7 para generar un primer amplicón usando ADN genómico de CRW como molde. Preferentemente, se usa una secuencia de ADNc o una de ARNm como el molde para la síntesis de una molécula de ARNbc para uso en la presente invención debido a que se reconoce en la técnica que secuencias genómicas o eucariotas contienen secuencias que no están presentes dentro de la molécula de ARN madura. Después se usó una muestra del primer amplicón generado a partir de la primera reacción de amplificación de mayor fidelidad como un molde en una segunda reacción de amplificación térmica con un segundo par de cebadores que contenía la secuencia promotora T7 para producir un segundo amplicón que contenía un promotor T7 en o incluido dentro del extremo 5’ de cada cadena del segundo amplicón. La secuencia de nucleótidos completa del segundo amplicón se obtuvo en ambas direcciones y se comparó con la secuencia de nucleótidos como se indicó para el ADNc, y se anotaron las discrepancias entre las dos secuencias, si las hubiera. En general, las secuencias preparadas usando ADN genómico como molde fueron contradictorias con el uso adicional como moléculas de ARNbc para su uso en la consecución de niveles significativos de supresión debido a las variaciones dentro de las secuencias genómicas que no estaban presentes dentro de la secuencia de ARN o ADNc.
Una reacción de transcripción in vitro típicamente contenía de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 microgramos de molde de ADN linealizado, tampón de reacción de polimerasa T7 de un concentrado 10X, ribonucleótidos ATP, CTP, GTP y UTP a una concentración final de entre 50 y 100 mM cada uno, y 1 unidad de enzima ARN polimerasa T7. La reacción de ARN polimerasa se incubó a aproximadamente 37 ºC, dependiendo de la temperatura óptima de la ARN polimerasa usada de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, durante un periodo de tiempo que varió de varios minutos a varias horas. En general, las reacciones se llevaron a cabo de aproximadamente 2 a aproximadamente a 6 horas para transcripción de secuencias molde hasta aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, y durante hasta 20 horas para transcripción de secuencias molde mayores de aproximadamente 400 nucleótidos de longitud. Calentar la reacción a 65 ºC durante quince minutos termina la transcripción de ARN. Se precipitaron productos de transcripción de ARN en etanol, se lavaron, se secaron al aire y se resuspendieron en agua sin RNAsa hasta una concentración de aproximadamente 1 microgramo por microlitro. La mayoría de los transcritos que aprovecharon la estrategia de promotor de T7 opuesta perfilada anteriormente produjeron ARN bicatenario en la reacción de transcripción in vitro, sin embargo, se obtuvo un mayor rendimiento de ARN bicatenario calentando el ARN purificado hasta 65 ºC y después enfriando lentamente hasta temperatura ambiente para asegurar la hibridación apropiada de segmentos de ARN con sentido y antisentido. Se incubaron después productos de ARN bicatenario con DNAsa I y RNAsa a 37 ºC durante una hora para retirar cualquier ADN o ARN monocatenario presente en la mezcla. Se purificaron productos de ARN bicatenario sobre una columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KIT de ARNi AMBION MEGAscript) y se resuspendieron en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) o agua sin RNAsa hasta una concentración de entre 0,1 y 1,0 microgramos por microlitro.
Las siguientes secuencias de nucleótidos se derivaron en primer lugar como secuencias de ADNc identificadas en una biblioteca de ADNc de intestino medio de crisomélido del maíz (Andersen y col., en el mismo lugar), y se adaptaron para su uso en la construcción de moléculas de ARN bicatenario para su uso en ensayos de la eficacia de inhibición de una función biológica en una plaga suministrando moléculas de ARN bicatenario en la dieta de la plaga.
A. Secuencias homólogas de Chd3
Se han identificado genes de CHD en numerosos eucariotas, y se ha propuesto que las proteínas correspondientes actúan como factores de remodelación de cromatina. El término CHD deriva de los tres dominios de homología de secuencia hallados en proteínas CHD: un dominio cromo (modificador de la organización de cromatina), un dominio de helicasa/ATPasa relacionado con SNF2 y un dominio de unión a ADN, cada uno de los cuales se cree que confiere una actividad relacionada con cromatina distinta. Las proteínas CHD se separan en dos categorías
basándose en la presencia o ausencia de otro dominio de homología de secuencia, un dominio de dedo de cinc PHD, típicamente asociado con actividad relacionada con cromatina. Proteínas relacionadas con CHD3 poseen un dominio de dedo de cinc de PHD, pero las proteínas relacionadas con CHD1 no. Las observaciones experimentales han sugerido un papel para las proteínas CHD3 en la represión de la transcripción, y en algunas especies se ha mostrado que son un componente de un complejo que contiene histona desacetilasa como una subunidad. La desacetilación de histonas se correlaciona con inactivación de la transcripción, y por lo tanto se ha implicado que proteínas CHD3 actúan como represores de la transcripción en virtud de ser un componente de un complejo de histona desacetilasa (Ogas y col., 1999). Por lo tanto, la supresión de síntesis de proteína CHD3 puede ser una diana útil para inhibición mediada por ARN bicatenario de plagas de coleópteros.
B. Secuencias homólogas de beta-tubulina
Las proteínas tubulinas son componentes estructurales importantes de muchas estructuras celulares en todas las células eucariotas y principalmente en la formación de microtúbulos. La inhibición de la formación de microtúbulos en células da como resultado efectos catastróficos incluyendo interferencia con la formación de husos mitóticos, bloqueo de la división celular y similares. Por lo tanto, la supresión de formación de proteína tubulina puede ser una diana útil para inhibición mediada por ARN bicatenario.
C. Secuencias homólogas de V-ATPasa de 40 kDa
El metabolismo energético dentro de orgánulos subcelulares en sistemas eucariotas es una función esencial. Las ATP sintasas vacuolares están implicadas en el mantenimiento de niveles suficientes de ATP dentro de vacuolas. Por lo tanto, las ATP sintasas vacuolares pueden ser una diana útil para inhibición mediada por ARN bicatenario.
D. Secuencias homólogas de EF1
Los factores de terminación de la transcripción y elongación de la transcripción son esenciales para el metabolismo y pueden ser dianas ventajosas para inhibición mediada por ARN bicatenario.
E. Secuencias homólogas de subunidad de proteasoma 26S p28
El proteasoma 26S es una proteasa de múltiples subunidades, dependiente de ATP, grande, que está altamente conservada en todos los eucariotas. Tiene una función general en la retirada selectiva de diversas proteínas de vida corta que se unen en primer lugar covalentemente con ubiquitina y después se degradan posteriormente por el complejo de proteasoma 26S. La ruta de ubiquitina desempeña un papel importante en el control del ciclo celular por la degradación específica de varias proteínas reguladoras incluyendo ciclinas mitóticas e inhibidores de quinasas dependientes de ciclina tales como p27 de células de mamífero. Por lo tanto, la supresión de la síntesis de proteasoma 26S y supresión de síntesis de sus subunidades componentes pueden ser dianas preferidas para inhibición mediada por ARN bicatenario (Smith y col., 1997).
F. Secuencias homólogas de hormona juvenil epóxido hidrolasa
La hormona juvenil de insectos controla y regula una diversidad de procesos biológicos necesarios dentro del ciclo de vida del insecto incluyendo pero no necesariamente limitado a metamorfosis, reproducción y diapausa. Se requiere que las concentraciones de hormona juvenil (JH) alcancen máximos en momentos apropiados dentro de la hemolinfa de la forma larvaria de una plaga de insectos, en particular larvas de lepidópteros y coleópteros, y después debe degradarse para terminar los efectos de la respuesta hormonal. Las enzimas implicadas en la reducción de la concentración de hormona juvenil son eficaces mediante dos rutas primarias de degradación metabólica. Una ruta implica la hormona juvenil esterasa (JHE), que hidroliza el metil éster que proporciona el ácido correspondiente. La segunda ruta utiliza la hormona juvenil epóxido hidrolasa (JHEH) para conseguir hidrólisis del epóxido, dando como resultado la formación del diol. La contribución de JHE en la degradación de JH se entiende bien y se ha descubierto que es invariable entre las especies de lepidópteros y coleópteros. La inhibición de JH esterasa se ha asociado con varios cambios morfológicos incluyendo pero sin limitación desplazamiento larvario, pupación diferida y desarrollo de intermedios malformados. Por el contrario, la contribución de JHEH en el metabolismo de JH se entiende peor y se ha mostrado que varía entre especies, pero estudios recientes apuntan a pruebas que sugieren que JHEH puede ser la vía primaria del metabolismo de JH (Brandon J. Fetterolf, Tesis Doctoral, Universidad Estatal de Carolina del Norte (10 feb. 2002) Synthesis and Analysis of Mechanism Based Inhibitors of Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase from Insect Trichoplusia ni). En cualquier caso, la alteración de la ruta de degradación de JH usando tecnología de supresión génica podría ser una diana eficaz para inhibición de plagas mediada por ARN bicatenario.
G. Secuencias homólogas de proteínas de canal de cloruro dependiente de hinchamiento
Se ha postulado que las proteínas de canal de cloruro dependiente de hinchamiento desempeñan un papel crítico en la osmorregulación en sistemas de células animales eucariotas. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos que muestra la capacidad para expresar una secuencia de aminoácidos que muestra homología con proteínas de canales de cloruro dependientes de hinchamiento previamente identificadas puede ser una diana útil para inhibición de ARN en una plaga.
H. Secuencias homólogas de proteínas de glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa
La proteína glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD) cataliza la oxidación de glucosa-6-fosfato a 6fosfogluconato reduciendo al mismo tiempo simultáneamente la forma oxidada de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) a NADPH. NADPH se conoce en la técnica como un cofactor requerido en muchas reacciones biosintéticas eucariotas, y se sabe que mantiene glutatión en su forma reducida. El glutatión reducido actúa como un eliminador de metabolitos oxidantes peligrosos en células eucariotas, y con la ayuda de la enzima glutatión peroxidasa, convierte peróxido de hidrógeno perjudicial en agua (Beutler y col., 1991). Por lo tanto, G6PD puede ser una diana preferible para inhibición mediada por ARN bicatenario en una plaga de coleópteros.
I. Secuencias homólogas de proteína Act42A
La actina es una proteína eucariota ubicua y altamente conservada requerida para la motilidad y movilidad celular (Lovato y col., 2001). Se han identificado varias secuencias de ADNc de CRW que se ha predicho que probablemente codifiquen actina o proteínas que muestran estructura de secuencia de aminoácidos relacionada con proteínas de actina. Por lo tanto, los genes que codifican homólogos de actina en una célula de plaga pueden ser dianas útiles para inhibición mediada por ARN bicatenario.
J. Secuencias homólogas de factor de ribosilación de ADP 1
Se ha demostrado que los factores de ribosilación de ADP son esenciales en la función celular por que desempeñan papeles integrales en los procesos de reparación de daño de ADN, carcinogénesis, muerte celular y estabilidad genómica. Por lo tanto, sería útil poder alterar selectivamente la transcripción de factores de ribosilación de ADP en especies de plagas de coleópteros usando inhibición mediada por ARN bicatenario.
K. Secuencias homólogas de proteínas de Factor IIB de transcripción
Los factores de terminación de la transcripción y elongación de la transcripción, como se ha indicado anteriormente, son esenciales para el metabolismo y pueden ser dianas ventajosas para inhibición mediada por ARN bicatenario para controlar o eliminar la infestación por plaga de coleópteros.
L. Secuencias homólogas de quitinasa
La quitina es un homopolímero (14) de N-acetilglucosamina y se encuentra en exoesqueletos de insectos. La quitina se forma a partir de UDP-N-acetilglucosamina en una reacción catalizada por quitina sintasa. La quitina es un polisacárido homopolimérico estructural, y hay muchas etapas enzimáticas implicadas en la construcción de esta estructura altamente ramificada y reticulada. La quitina da forma, rigidez y soporte a insectos y proporciona un armazón al que se unen dichos órganos internos tales como músculos. La quitina también debe degradarse en algún grado para mediar en las etapas implicadas en el proceso de muda de insectos. Por lo tanto, se cree que la inhibición mediada por ARN bicatenario de proteínas en estas rutas sería útil como un medio para controlar la infestación por plagas de coleópteros.
M. Secuencias homólogas de enzimas que se conjugan con ubiquitina
La ruta de ubiquitina desempeña un papel importante en el control del ciclo celular por la degradación específica de varias proteínas reguladoras incluyendo ciclinas mitóticas e inhibidores de quinasas dependientes de ciclina tales como p27 de células de mamífero. Por lo tanto, los genes que codifican ubiquitina y componentes asociados pueden ser una diana preferida para inhibición mediada por ARN bicatenario (Smith y col., 1997). La ruta proteolítica dependiente de ubitiquina es una de las rutas principales por las que las proteínas intracelulares se destruyen selectivamente en eucariotas. La conjugación de ubiquitina con proteínas de sustrato está mediada por una serie notablemente diversa de enzimas. La dirección proteotílica también puede estar regulada en etapas entre la ubiquitinación del sustrato y su degradación a péptidos por la proteasa 26S de múltiples subunidades. La complejidad del sistema de ubiquitina sugiere un papel central para la renovación de proteína en regulación de células eucariotas, e implica otras proteínas en la ruta incluyendo enzima activadora de ubiquitina, enzima conjugadora de ubiquitina, ubiquitina-proteína ligasa, y componentes subunitarios del proteasoma 26S. Por lo tanto, se cree que la inhibición mediada por ARN bicatenario de proteínas en esta ruta sería útil como un medio para controlar la infestación por plagas de coleópteros.
N. Secuencias homólogas de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
La ruta glucolítica es una ruta esencial en la mayoría de organismos y está implicada en la producción de energía metabólica a partir de la degradación de glucosa. Una enzima importante en el segundo estadio de la ruta glucolítica es gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH), que, en presencia de NAD+ y fosfato inorgánico, cataliza la oxidación de 3-fosfo-gliceraldehído a 3-fosfoglicerol-fosfato junto con la formación de NADH. El componente importante de esta reacción es el almacenamiento de energía mediante la formación de NADH. Genes que codifican enzimas asociadas con la ruta glucolítica, y particularmente genes que codifican enzimas implicadas en las etapas útiles en la formación de reservas de energía pueden ser dianas particularmente útiles para inhibición mediada por ARN bicatenario en especies de plagas de coleópteros.
O. Secuencias homólogas de ubiquitina B
Como se ha descrito anteriormente, la ruta de degradación de proteína ubiquitina desempeña un papel importante en el control del ciclo celular mediante la degradación específica de varias proteínas reguladoras incluyendo ciclinas mitóticas e inhibidores de quinasas dependientes de ciclina tales como p27 de células de mamífero. Por lo tanto, los genes que codifican ubiquitina y componentes asociados pueden ser una diana preferida para la inhibición mediación por ARN bicatenario (Smith y col., 1997).
P. Homólogos de hormona juvenil esterasa
Como se ha indicado anteriormente, la hormona juvenil de insectos controla y regula una diversidad de procesos biológicos necesarios dentro del ciclo de vida del insecto, incluyendo pero sin limitarse necesariamente a metamorfosis, reproducción y diapausa. La alteración de las rutas de síntesis o degradación de JH usando tecnología de supresión génica podría ser una diana eficaz para inhibición de plagas mediada por ARN bicatenario.
Q. Secuencias homólogas de alfa tubulina
Las células eucariotas utilizan en general elementos estructurales citoesqueléticos que son importantes, no solamente como un armazón mecánico, sino también en el mantenimiento de la forma de la célula. Los microfilamentos semiflexibles hacen a las células móviles, ayudándoles a dividirse en mitosis (citocinesis) y, en animales vertebrados e invertebrados, son responsables de la contracción muscular. Los microtúbulos relativamente rígidos que están compuestos de proteínas de tubulina alfa y beta desempeñan un papel importante en la actuación como un tipo de vía de transporte de vesículas y orgánulos y en la separación de cromosomas durante la mitosis (cariocinesis). Los filamentos flexibles intermedios proporcionan al menos fuerza adicional a la estructura celular general. También se sabe que el citoesqueleto está implicado en la señalización a través del citoplasma celular. Teniendo en cuenta estas funciones, se cree que cualquier alteración de citoesqueleto o incluso cambios sutiles de su integridad puede provocar consecuencias patológicas a una célula.
R. Secuencias relacionadas con el transporte
Como se ha indicado anteriormente, la clasificación y el transporte de diversas moléculas dentro de una célula, incluyendo a orgánulos apropiados, así como su secreción es una función fisiológica importante. Dichas rutas de clasificación podrían incluir las que se basan en el complejo de clasificación endosómica requerido para el transporte (ESCRT), complejos I-III, entre otros. Por lo tanto, las funciones relacionadas con el transporte de polipéptidos y otras moléculas también puede ser una diana preferida para inhibición mediada por ARNbc.
Ejemplo 2
Bioensayos de alimentación de insectos
Se sometieron muestras de ARN bicatenario (ARNbc) a bioensayo con un número seleccionado de plagas diana. El ARNbc se preparó a partir de secuencias identificadas de acuerdo con el Ejemplo 1 usando una secuencia de contig completa en el caso de SEQ ID NO: 1-6, o una secuencia amplificada a partir del contig ensamblado usando los pares de cebadores como se exponen en el listado de secuencias. Se aplicaron dosis variantes de ARNbc como una superposición sobre dieta artificial de crisomélido del maíz de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se obtuvieron huevos de Diabrotica virgifera virgifera (WCR) de Crop Characteristics, Inc., Farmington, Minnesota. Los huevos de WCR no en diapausa se incubaron en suelo durante aproximadamente 13 días a 24 ºC, 60 % de humedad relativa, en oscuridad completa. El día 13 el suelo que contenía huevos de WCR se colocó entre tamices de malla n.º 30 y n.º 60 y los huevos se separaron por lavado del suelo usando una manguera de jardín de alta presión. Los huevos se desinfestaron en superficie empapando en LYSOL durante tres minutos, se aclararon tres veces con agua estéril, se lavaron una vez con una solución de formalina al 10 % y después se aclararon tres veces adicionales en agua estéril. Los huevos tratados de esta manera se distribuyeron en filtros de café estériles y eclosionaron durante una noche a 27 ºC, 60 % de humedad relativa, en oscuridad completa.
Para preparar ARNbc, se clonaron amplicones de secuencias seleccionadas en un vector plasmídico con capacidad de replicación en E. coli y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de ARN polimerasa T7 in vitro a partir de los promotores de T7 convergentes incluidos en uno de los extremos del fragmento clonado. Se produjo ARN bicatenario y se sometió a bioensayo; un segmento de ARN que comprendía la secuencia como se expone en el listado de secuencias, siendo el otro segmento de ARN sustancialmente el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos, uiridinas situadas apropiadamente en lugar de timidinas. Se trató una muestra de ARN bicatenario (ARNbc) con DICER o con RNAsa III para producir cantidades suficientes de ARN de interferencia pequeños (ARNip). Se superpusieron muestras que contenían ARNip o ARNbc en bioensayo de dieta de CRW como se ha descrito anteriormente y se permitió que las larvas se alimentaran como se expone posteriormente.
Se añadió una muestra de ARN bicatenario directamente a cada pocillo que contenía dieta de insectos como se ha indicado anteriormente, o se modificó antes de añadirse a la dieta de insectos. La modificación de ARN bicatenario siguió las instrucciones para RNAsa III (AMBION CORPORATION, Austin, Texas) o DICER (STRATAGENE, La
Jolla, California) proporcionadas por el fabricante. La digestión con RNAsa III de ARN bicatenario produjo veintiuna y veintidós dobles cadenas de nucleótidos que contenían extremos fosforilados 5’ y extremos hidroxilo 3’ con salientes de 2-3 bases, similares a los fragmentos de ARN de interferencia pequeño (ARNip) de doble cadena de ∼21-26 pares de base producidos por la enzima dicer en la ruta eucariota identificada por Hamilton y col. (1999) y Elbashir y col. (2001a). Esta colección de dobles cadenas de ARN de interferencia pequeño se purificó adicionalmente y una muestra se caracterizó por electroforesis en gel de poliacrilamida para determinar la integridad y eficacia de la formación de doble cadena. La pureza y cantidad de la muestra se determinó después por espectrofotometría a una longitud de onda de 250 nanómetros, y la muestra no usada se conservó para su uso posterior mediante almacenamiento a -20 ºC.
Se preparó dieta de insectos esencialmente de acuerdo con Pleau y col. (2002), con las siguientes modificaciones. Se distribuyeron 9,4 gramos de agar SERVA en 540 mililitros de agua purificada y se agitó hasta que el agar se distribuyó exhaustivamente. La mezcla de agua/agar se calentó hasta hervir para disolver completamente el agar, y después se vertió en una batidora WARING. La batidora se mantuvo a velocidad baja mientras que se añadían 62,7 gramos de mezcla de DIETA BIO-SERV (F9757), 3,75 gramos de raíz de maíz liofilizada, 1,25 mililitros de colorante alimentario verde, y 0,6 mililitros de formalina a la mezcla de agar caliente. La mezcla se ajustó después a pH 9,0 con la adición de una solución de reserva de hidróxido de potasio 10 %. El volumen de aproximadamente 600 mililitros de dieta líquida se mezcló continuamente a alta velocidad y se mantuvo de aproximadamente 48 ºC a aproximadamente 60 ºC usando una barra de agitación magnética revestida con NALGENE esterilizada en una placa caliente de agitación magnética mientras se distribuía en alícuotas de 200 microlitros en cada pocillo de placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos FALCON. Se permitió que la dieta en las placas se solidificara y se secara al aire en una campana biológica estéril durante aproximadamente diez minutos.
Se superpusieron volúmenes de treinta (30) microlitros de muestras de ensayo que contenían reactivos de control o ARN bicatenario en cantidades variantes en la superficie de la dieta de insectos en cada pocillo usando un repetidor micro-pipeteador. Se permitió que la dieta de insectos reposara en campana biológica estéril durante hasta media hora después de aplicación de muestras de ensayo para permitir que los reactivos se difundieran en la dieta y para permitir que la superficie de la dieta se secara. Se depositó una larva de neonato de WCR en cada pocillo con un pincel fino. Las placas se sellaron después con MYLAR y se ventilaron usando un alfiler de insecto. Se ensayaron 12-72 larvas de insectos por dosis dependiendo del diseño del ensayo. Las placas de bioensayo se incubaron a 27 ºC, 60 % de humedad relativa en oscuridad completa durante 12-14 días. El número de larvas supervivientes por dosis se registró en el punto temporal de 12-14 días. Se determinó la masa larvaria usando una microbalanza adecuada para cada larva superviviente. Los datos se analizaron usando software estadístico JMP4 (SAS Institute, 1995) y se realizó un ANOVA factorial completo con un ensayo de Dunnet para buscar efectos de tratamiento en comparación con el control no tratado (P<0,05). Se realizó un ensayo post hoc de Tukey-Kramer para comparar todos los pares de los tratamientos (P<0,05). Los resultados de los ensayos de alimentación de larvas de CRW mostraron inhibición de crecimiento y mortalidad significativas en comparación con controles como se explica posteriormente.
Ejemplo 3
Resultados de bioensayos de alimentación de insectos
Se preparó una dieta artificial suficiente para criar larvas de crisomélidos del maíz aplicando muestras de secuencias de ARN bicatenario identificadas como se ha descrito en el Ejemplo 1 usando bioensayos llevados a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se permitió que las larvas de crisomélidos del maíz típicamente se alimentaran con la dieta durante doce días y se supervisó la mortalidad y atrofia en comparación con crisomélidos a los que se permitió alimentarse solamente con dietas de control negativo y positivo. Los resultados de los estudios confirmaron niveles significativos (p<0,05) de atrofia y/o mortalidad larvaria usando ARNbc que contenían partes de secuencias homólogas de una diversidad de clases de genes diferentes. Las secuencias y vectores que producían atrofia y/o mortalidad significativas y las SEQ ID NO correspondientes para la secuencia expresada como un ARNbc se proporcionan en las Tablas 1-5 posteriores.
Tabla 1: Construcciones de ARNbc que demuestran atrofia y/o mortalidad significativas en efecto en bioensayos de alimentación de insectos con crisomélido de maíz meridional o crisomélido de maízoccidental
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
ARNi-pIC17553:001
Apple 697
ARNi-pIC17504:049
V-ATPasa de longitud completa de EST 695
ARNi-pIC17554:001
Rpl 9 698
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
ARNi-pIC17555:001
Rpl 19 699
ARNi-pIC17504:050
V-ATPasa de Sección 6.0 711
ARNi-pIC19514:001
Enzima de recubrimiento de ARNm de WCR LIB5496-028-A1-M1-A7 696
ARNi-pIC17552:003
LIB5462-042-A1-M1-H10 Dv.6_CG9355 CONSTITUYENTE ESTRUCTURAL DE CUTÍCULA OSCURO 700
ARNi-pIC17546:003
LIB5462-091-A1-M1-G3 Dv.1_CG6217 KNICKKOPF UNK 701
ARNi-pIC17546:001
Dv.1_CG6217 1
ARNi-pIC17549:001
Dv.4_CG1435 4
ARNi-pIC17550:001
LIB5444-065-A1-M1-D5 Dv.5_cg1915_1 5
ARNi-pIC17551:001
LIB5462-012-A1-M2-B2 Dv.5_cg1915_2 703
ARNi-pIC17552:001
Dv.6_CG9355 6
ARNipMON78412:002
Dv.7_CG3416; Mov34 potencial: ortólogo de CG3416 10
ARNipMON96172:002
Dv.8_CG1088; subunidad de H+ATPasa E vacuolar potencial: ortólogo de CG1088 14
ARNipMON96168:002
Dv.9_CG2331; actividad ATPasa potencial: ortólogo de CG2331 18
ARNipMON78424:002
Dv.10_CG6141; proteína ribosómica potencial L9: ortólogo de CG6141 22
ARNipMON78425:001
Dv.11_CG2746 26
ARNipMON78444:002
Dv.12_CG1341; partícula reguladora de proteasoma potencial, rpt1: ortólogo de CG1341 30
ARNipMON78416:002
Dv.13_CG11276; proteína ribosómica potencial S4: ortólogo de CG11276 34
ARNipMON78434:001
Dv.14_CG17927_2; cadena pesada de miosina potencial: ortólogo de CG17927 38
ARNipMON78439:001
Dv.16_CG5394; glutamil-prolil-ARNt sintetasa potencial: ortólogo de CG5394 46
ARNipMON78438:001
Dv.17_CG10149; subunidad de proteasoma p44.5 potencial, rpn6: ortólogo de CG10149 50
ARNipMON78435:002
Dv.18_CG1404, GTPasa monomérica pequeña de RAN potencial: ortólogo de CG1404 54
ARNipMON78449:002
Dv.19_CG18174; partícula reguladora de proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11: ortólogo de CG18174 58
ARNipMON78419:001
Dv.20_CG3180_1; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG3180 62
ARNipMON78440:002
Dv20_CG3180_2; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG3180 706
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
ARNipMON78420:001
Dv.21_CG3320; Rab1 potencial: ortólogo de CG3320 70
ARNipMON78410:002
Dv.22_CG3395; proteína ribosómica potencial S9: ortólogo de CG3395 74
ARNipMON78422:001
Dv.23_CG7269; helicasa potencial: ortólogo de CG7269 78
ARNipMON78423:001
Dv.25_CG9012; cadena pesada de Clatrina potencial: ortólogo de CG9012 86
ARNipMON78414:006
DV.26 mitad sec1 ∼5’ de EST 710
ARNipMON78414:001
Dv.26_CG9261; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261 90
ARNipMON78413:001
Dv.27_CG12052; factor de transcripción de ARN polimerasa II potencial: ortólogo de CG12052. 94
ARNipMON78427:001
Dv.35_CG3762; Vha68-2potencial: ortólogo de CG3762. 126
ARNipMON97122:001
C1_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero 713
ARNipMON97127:001
C2_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero 714
ARNipMON97125:001
C3_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero 715
ARNipMON78441:001
Dv.39_CG9078; esfingolípido delta-4 desaturasa potencial; estearoil-CoA 9-desaturasa: ortólogo de G9078 142
ARNipMON97114:001
Dv.41_CG2637; Ketel Hembra estéril; implicado en la importación de proteína-núcleo: ortólogo de CG2637 150
ARNipMON97140:001
Dv.44_CG1244; actividad de unión a ácido nucleico potencial: ortólogo de CG1244 162
ARNipMON78429:001
Dv.46_CG10689; ARN helicasa potencial: ortólogo de CG10689 170
ARNipMON78432:001
Dv.48_CG33196; proteína tirosina quinasa receptora transmembrana potencial: ortólogo de CG33196 178
ARNipMON78428:001
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1 182
ARNipMON78428:003
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1 Región libre seleccionada de DV.49 704
ARNipMON78426:001
Dv.50_CG10110_1; factor de especificidad de poliadenilación y escisión potencial: ortólogo de CG10110_1 186
ARNipMON96185:001
Dv.55_CG5931; actividad de factor de corte y empalme potencial, actividad ARN helicasa: ortólogo de CG5931 202
ARNipMON78442:001
Dv.57_CG2968; ATPasa exportadora de hidrógeno potencial: ortólogo de CG2968 206
ARNi
Dv.58_CG1751; peptidasa señal potencial: ortólogo de CG1751 210
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON78431:001
ARNipMON96177:001
Dv.61_CG3725_1; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725 222
ARNipMON96183:001
Dv.62_CG3612; indicador potencial: ortólogo de CG3612 230
ARNipMON96180:002
Dv.65_CG7033; actividad chaperona potencial: ortólogo de CG7033 242
ARNipMON96176:001
Dv.66_CG32019; bent potencial: ortólogo de CG32019 246
ARNipMON96170:002
Dv.67_CG16916; actividad endopeptidasa potencial: ortólogo de CG16916 250
ARNipMON96166:001
Dv.70_CG5771; proteína Rab 11 potencial: ortólogo de CG5771 258
ARNipMON96179:001
Dv.72_CG6831; rhea potencial: ortólogo de CG6831 266
ARNipMON96186:001
Dv.73_CG10119; Lámina C potencial: ortólogo de CG10119 270
ARNipMON96160:002
Dv.74_CG6375; pitchoune potencial: ortólogo de CG6375 274
ARNipMON97137:001
Dv.77_CG4214; Sintaxina 5 potencial; implicada en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG4214 286
ARNipMON96167:001
Dv.82_CG8264; Bx42 potencial: ortólogo de CG8264 302
ARNipMON96171:001
Dv.83_CG11397; gluon potencial: ortólogo de CG11397 306
ARNipMON96187:003
Dv.85_CG4494; actividad de unión a proteína potencial: ortólogo de CG4494 314
ARNipMON96174:001
Dv.86_CG5055; bazooka potencial: ortólogo de CG5055 318
ARNipMON97126:001
Dv.88_CG8756; función desconocida; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8756 326
ARNipMON97130:001
Dv.93_CG8515; constituyente estructural potencial de cutícula; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8515 342
ARNipMON97109:001
Dv.99_CG2446; Desconocido; letal en Drosophila y baja homología con ser humano: ortólogo de CG2446 366
ARNipMON97111:001
Dv.105_CG1250_1; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250 390
ARNipMON97112:001
Dv.105_CG1250_2; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250 394
ARNipMON97107:001
Dv.107_CG14813; revestimiento de vesícula COPI; implicado en el transporte de proteínas intracelular de Golgi a RE: ortólogo de CG14813 398
ARNi
Dv.108_CG17248; n-sinaptobrevina; implicado en el transporte de 402
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON97115:001
proteínas intracelular: ortólogo de CG17248
ARNipMON97133:001
Dv.113; función desconocida; secuencia única de WCR 422
ARNipMON97121:001
Dv.122_CG3164; actividad de transportador de casete de unión a ATP potencial: ortólogo de CG3164 454
ARNipMON97134:001
Dv.127; función desconocida; sin homología con ser humano 470
ARNipMON97171:001
Dv.146; función desconocida, secuencia única de WCR 514
ARNipMON97166:001
Dv.147; función desconocida, secuencia única de WCR 518
ARNipMON97167:001
Dv.149; función desconocida, secuencia única de WCR 526
ARNipMON97169:001
Dv.155; función desconocida, secuencia única de WCR 550
ARNipMON97173:001
Dv.162; función desconocida, secuencia única de WCR 578
ARNipMON97170:001
Dv.170; función desconocida, secuencia única de WCR 610
Tabla 2: Construcciones de ARNbc que provocan niveles de atrofia significativos en bioensayos dealimentación con larvas de crisomélido de maíz occidental (WCR)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pIC17553:001
Apple
ARNi-pIC17504:049
V-ATPasa de longitud completa de EST
ARNi-pIC17554:001
Rpl 9
ARNi-pIC17555:001
Rpl 19
ARNi-pIC17504:050
V-ATPasa de Sección 6.0
ARNi-pIC16005:001
Subunidad 1 de V-ATPasa D
ARNi-pIC19514:001
Enzima de recubrimiento de ARNm de WCR LIB5496-028-A1-M1-A7
ARNi-pIC17546:001
Dv.1_CG6217
ARNi-pIC17549:001
Dv.4 CG1435
ARNi-pIC17551:001
LIB5462-012-A1-M2-B2 Dv.5_cg1915_2
ARNi-pIC17552:001
Dv.6_CG9355
ARNi-pMON78412:001
Dv.7_CG3416
ARNi-pMON78412:002
Dv.7_CG3416; Mov34 potencial: ortólogo de CG3416
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pMON96172:002
Dv.8_CG1088; subunidad de H+ATPasa E vacuolar potencial: ortólogo de CG1088
ARNi-pMON96168:002
Dv.9_CG2331; actividad ATPasa potencial: ortólogo de CG2331
ARNi-pMON78424:002
Dv.10_CG6141; proteína ribosómica potencial L9: ortólogo de CG6141
ARNi-pMON78425:001
Dv.11_CG2746
ARNi-pMON78444:002
Dv.12_CG1341; partícula reguladora de proteasoma potencial, rpt1: ortólogo de CG1341
ARNi-pMON78416:002
Dv.13_CG11276; proteína ribosómica potencial S4: ortólogo de CG11276
ARNi-pMON78434:001
Dv.14_CG17927_2; cadena pesada de miosina potencial: ortólogo de CG17927
ARNi-pMON78439:001
Dv.16_CG5394; glutamil-prolil-ARNt sintatasa potencial: ortólogo de CG5394
ARNi-pMON78435:002
Dv.18_CG1404, GTPasa monomérica pequeña de RAN potencial: ortólogo de CG1404
ARNi-pMON78449:002
Dv.19_CG18174; partícula reguladora de proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11: ortólogo de CG18174
ARNi-pMON78440:002
Dv.20_CG3180_1; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG3180
ARNi-pMON78420:002
Dv.21_CG3320; Rab1 potencial: ortólogo de CG3320
ARNi-pMON78410:001
Dv.22_CG3395; proteína ribosómica potencial S9: ortólogo de CG3395
ARNi-pMON78422:001
Dv.23_CG7269; helicasa potencial: ortólogo de CG7269
ARNi-pMON78423:001
Dv.25_CG9012; cadena pesada de Clatrina potencial: ortólogo de CG9012
ARNi-pMON78414:001
Dv.26_CG9261; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261
ARNi-pMON78413:001
Dv.27_CG12052; factor de transcripción de ARN polimerasa II potencial: ortólogo de CG12052.
ARNi-pMON97122:001
C1_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON97127:001
C2_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON97125:001
C3_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON78427:007
Dv.35_CG3762; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762.
ARNi-pMON78441:001
Dv.399_CG9078; esfingolípido delta-4 desaturasa potencial; estearoil-CoA 9-desaturasa: ortólogo de G9078
ARNi-pMON97114:001
Dv.41_CG2637; Ketel Hembra estéril; implicado en la importación de proteína-núcleo: ortólogo de CG2637
ARNi-pMON78429:001
Dv.46_CG10689; ARNA helicasa potencial: ortólogo de CG10689.
ARNi-pMON78432:001
Dv.48_CG33196; proteína tirosina quinasa receptora
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
transmembrana potencial: ortólogo de CG33196
ARNi-pMON78428:001
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1
ARNi-pMON78428:003
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1 Región libre seleccionada de DV.49
ARNi-pMON78426:001
Dv.50_CG10110_1; factor de especificidad de poliadenilación y escisión potencial: ortólogo de CG10110_1
ARNi-pMON96185:001
Dv.55_CG5931; actividad de factor de corte y empalme potencial, actividad ARN helicasa: ortólogo de CG5931
ARNi-pMON78442:001
Dv.57_CG2968; ATPasa exportadora de hidrógeno potencial: ortólogo de CG2968
ARNi-pMON78431:001
Dv.58_CG1751; peptidasa señal potencial: ortólogo de CG1751
ARNi-pMON96177:001
Dv.61_CG3725_1; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96182:001
Dv.61_CG3725_2; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96183:001
Dv.62_CG3612; indicador potencial: ortólogo de CG3612
ARNi-pMON96180:002
Dv.65_CG7033; actividad chaperona potencial: ortólogo de CG7033
ARNi-pMON96180:001
Dv.65_CG7033; actividad chaperona potencial: ortólogo de CG7033
ARNi-pMON96176:001
Dv.66_CG32019; bent potencial: ortólogo de CG32019
ARNi-pMON96170:002
Dv.67_CG16916; actividad endopeptidasa potencial: ortólogo de CG16916
ARNi-pMON96166:001
Dv.70_CG5771; proteína Rab 11 potencial: ortólogo de CG5771
ARNi-pMON96179:001
Dv.72_CG6831; rhea potencial: ortólogo de CG6831
ARNi-pMON96186:001
Dv.73_CG10119; Lámina C potencial: ortólogo de CG10119
ARNi-pMON96160:002
Dv.74_CG6375; pitchoune potencial: ortólogo de CG6375
ARNi-pMON96160:001
Dv.74_CG6375; pitchoune potencial: ortólogo de CG6375
ARNi-pMON97137:002
Dv.77_CG4214; Sintaxina 5 potencial; implicada en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG4214
ARNi-pMON96167:001
Dv.82_CG8264; Bx42 potencial: ortólogo de CG8264
ARNi-pMON96171:001
Dv.83_CG11397; gluon potencial: ortólogo de CG11397
ARNi-pMON96187:003
Dv.85_CG4494; actividad de unión a proteína potencial: ortólogo de CG4494
ARNi-pMON97126:001
Dv.88_CG8756; función desconocida; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8756
ARNi-pMON97109:001
Dv.99_CG2446; Desconocido; letal en Drosophila y baja homología con ser humano: ortólogo de CG2446
ARNi-pMON97111:001
Dv.105_CG1250_2; activador de GTPasa, implicado en el
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250
ARNi-pMON97107:001
Dv.107_CG14813; revestimiento de vesícula COPI; implicado en el transporte de proteínas intracelular de Golgi a RE: ortólogo de CG14813
ARNi-pMON97115:001
Dv.108_CG17248; n-sinaptobrevina; implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG17248
ARNi-pMON97121:001
Dv.122_CG3164; actividad de transportador de casete de unión a ATP potencial: ortólogo de CG3164
ARNi-pMON97171:001
Dv.146; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97166:001
Dv.147; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97167:001
Dv.149; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97169:001
Dv.155; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97173:001
Dv.162; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97170:001
Dv.170; función desconocida, secuencia única de WCR
Tabla 3: Construcciones de ARNbc que provocan niveles de mortalidad significativos en bioensayos dealimentación con larvas de crisomélido de maíz occidental (WCR)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pIC17553:001
Apple
ARNi-pIC17504:049
V-ATPasa de longitud completa de EST
ARNi-pIC17555:001
Rpl 9
ARNi-pIC17554:001
Rpl 19
ARNi-pIC17504:050
V-ATPasa de Sección 6.0
ARNi-pIC17504:054
Secuencia de subunidad 2 de V-ATPasa de Diabrotica virgifera virgifera Secuencia de EST completa que actúa como control positivo
ARNi-pIC19514:001
Enzima de recubrimiento de ARNm de WCR LIB5496-028-A1-M1-A7
ARNi-pIC17546:001
Dv.1_CG6217
ARNi-pIC17549:001
Dv.4_CG1435
ARNi-pIC17550:001
LIB5444-065-A1-M1-D5 Dv.5_cg1915_1
ARNi-pMON78412:002
Dv.7_CG3416; Mov34 potencial: ortólogo de CG3416
ARNi-pMON96172:001
Dv.8_CG1088; subunidad de H+ATPasa E vacuolar potencial: ortólogo de CG1088
ARNi-pMON96168:001
Dv.9_CG2331; actividad ATPasa potencial: ortólogo de CG2331
ARNi-pMON78424:002
Dv.10_CG6141; proteína ribosómica potencial L9: ortólogo de CG6141
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pMON78425:001
Dv.11_CG2746
ARNi-pMON78444:001
Dv.12_CG1341; partícula reguladora de proteasoma potencial, rpt1: ortólogo de CG1341
ARNi-pMON78416:002
Dv.13_CG11276; proteína ribosómica potencial S4: ortólogo de CG11276
ARNi-pMON78434:001
Dv.14_CG17927_2; cadena pesada de miosina potencial: ortólogo de CG17927
ARNi-pMON78435:001
Dv.18_CG1404, GTPasa monomérica pequeña de RAN potencial: ortólogo de CG1404
ARNi-pMON78449:001
Dv.19_CG18174; partícula reguladora de proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11: ortólogo de CG18174
ARNi-pMON78440:001
Dv.20_CG3180_1; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG3180
ARNi-pMON78420:001
Dv.21_CG3320; Rab1 potencial: ortólogo de CG3320
ARNi-pMON78410:001
Dv.22_CG3395; proteína ribosómica potencial S9: ortólogo de CG3395
ARNi-pMON78422:001
Dv.23_CG7269; helicasa potencial: ortólogo de CG7269
ARNi-pMON78414:006
DV.26 mitad sec1 ∼5’ de EST
ARNi-pMON78414:001
Dv.26_CG9261; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261
ARNi-pMON97122:001
C1_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON97127:001
C2_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON97125:001
C3_Dv.35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON78427:001
Dv.35_CG3762; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762.
ARNi-pMON97114:001
Dv.41_CG2637; Ketel Hembra estéril; implicado en la importación de proteína-núcleo: ortólogo de CG2637
ARNi-pMON97140:001
Dv.44_CG1244; Actividad de unión a ácido nucleico potencial: ortólogo de CG1244
ARNi-pMON78429:001
Dv.46_CG10689; ARN helicasa potencial: ortólogo de CG10689.
ARNi-pMON78428:001
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1
ARNi-pMON78428:003
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1 Región libre seleccionada de DV.49
ARNi-pMON78426:001
Dv.50_CG10110_1; factor de especificidad de poliadenilación y escisión potencial: ortólogo de CG10110_1
ARNi-pMON96185:001
Dv.55_CG5931; actividad de factor de corte y empalme potencial, actividad ARN helicasa: ortólogo de CG5931
ARNi-pMON78431:001
Dv.58_CG1751; peptidasa señal potencial: ortólogo de CG1751
ARNi-pMON96177:001
Dv.61_CG3725_1; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96182:001
Dv.61_CG3725_2; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96180:001
Dv.65_CG7033; actividad chaperona potencial: ortólogo de CG7033
ARNi-pMON96176:001
Dv.66_CG32019; bent potencial: ortólogo de CG32019
ARNi-pMON96170:001
Dv.67_CG16916; actividad endopeptidasa potencial: ortólogo de CG16916
ARNi-pMON96166:001
Dv.70_CG5771; proteína Rab 11 potencial: ortólogo de CG5771
ARNi-pMON96160:001
Dv.74_CG6375; pitchoune potencial: ortólogo de CG6375
ARNi-pMON97137:001
Dv.77_CG4214; Sintaxina 5 potencial; implicada en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG4214
ARNi-pMON96167:001
Dv.82_CG8264; Bx42 potencial: ortólogo de CG8264
ARNi-pMON96187:002
Dv.85_CG4494; actividad de unión a proteína potencial: ortólogo de CG4494
ARNi-pMON97126:001
Dv.88_CG8756; función desconocida; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8756
ARNi-pMON97130:001
Dv.93_CG8515; constituyente estructural potencial de la cutícula; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8515
ARNi-pMON97111:001
Dv.105_CG1250_1; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250
ARNi-pMON97107:001
Dv.107_CG14813; revestimiento de vesícula COPI; implicado en el transporte de proteínas intracelular de Golgi a RE: ortólogo de CG14813
ARNi-pMON97115:001
Dv.108_CG17248; n-sinaptobrevina; implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG17248
ARNi-pMON97133:001
Dv.113; función desconocida, secuencia única de WCR
ARNi-pMON97121:001
Dv.122_CG3164; actividad de transportador de casete de unión a ATP potencial: ortólogo de CG3164
ARNi-pMON97134:001
Dv.127; función desconocida; sin homología con ser humano
Tabla 4: Construcciones de ARNbc que provocan niveles de atrofia significativos en bioensayos de alimentación con larvas de crisomélido del maíz meridional (SCR)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pMON96172:001
Dv.8_CG1088; subunidad de H+ATPasa E vacuolar potencial: ortólogo de CG1088
ARNi-pMON96168:001
Dv.9_CG2331; actividad ATPasa potencial: ortólogo de CG2331
ARNi-pMON78424:001
Dv.10_CG6141
ARNi-pMON96155:002
Dv.10_CG6141; proteína ribosómica potencial L9: ortólogo de CG6141
ARNi-pMON78425:001
Dv.11_CG2746
ARNi-pMON96158:002
Dv._11CG2746; proteína ribosómica potencial L19: ortólogo de CG2746
ARNi-pMON78416:001
Dv.13_Cog11276
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pMON78434:001
Dv.14_CG17927_2; cadena pesada de miosina potencial: ortólogo de CG17927
ARNi-pMON78435:001
Dv.18_CG1404, GTPasa monomérica pequeña de RAN potencial: ortólogo de CG1404
ARNi-pMON78449:001
Dv.19_CG18174; partícula reguladora de proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11: ortólogo de CG18174
ARNi-pMON78419:001
Dv.20_CG3180
ARNi-pMON78420:001
Dv.21_CG3320; Rab1 potencial: ortólogo de CG3320
ARNi-pMON78414:001
Dv.26_CG9261; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261
ARNi-pMON97122:001
C1_Dv35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON97125:001
C3_Dv35; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero
ARNi-pMON78427:008
Dv.35_CG3762; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762
ARNi-pMON78428:001
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1
ARNi-pMON78442:001
Dv.57_CG2968; ATPasa exportadora de hidrógeno potencial: ortólogo de CG2968
ARNi-pMON96177:001
Dv.61_CG3725_2; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96166:001
Dv.70_CG5771; proteína Rab 11 potencial: ortólogo de CG5771
ARNi-pMON97126:001
Dv.88_CG8756; función desconocida; contiene dominio de unión a quitina: ortólogo de CG8756
ARNi-pMON97111:001
Dv.105_CG1250_1; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250
ARNi-pMON97112:001
Dv105_CG1250_2; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250
ARNi-pMON97107:001
Dv.107_CG14813; revestimiento de vesícula COPI; implicado en el transporte de proteínas intracelular de Golgi a RE: ortólogo de CG14813
ARNi-pMON97121:001
Dv.122_CG3164; actividad de transportador de casete de unión a ATP potencial: ortólogo de CG3164
Tabla 5: Construcciones de ARNbc que provocan niveles de mortalidad significativos en bioensayos dealimentación con larvas de crisomélido de maíz meridional (SCR)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pIC17546:003
LIB5462-091-A1-M1-G3 Dv1_CG6217 KNICKKOPF UNK
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc
ARNi-pIC17504:055
Secuencia de subunidad 2 de V-ATPasa de Diabrotica virgifera virgifera Secuencia de EST completa que actúa como control positivo
ARNi-pMON96155:001
Dv.10_CG6141; proteína ribosómica potencial L9: ortólogo de CG6141
ARNi-pMON96158:001
Dv.11_CG2746; proteína ribosómica potencial L19: ortólogo de CG2746
ARNi-pMON78416:001
Dv.13_CG11276
ARNi-pMON96154:003
Dv.14_CG17927; cadena pesada de miosina potencial: ortólogo de CG17927; células cultivadas en medio completo S.
ARNi-pMON78438:001
Dv.17_CG10149; subunidad p44.5 de proteasoma potencial, rpn6: ortólogo de CG10149
ARNi-pMON78449:001
Dv.19_CG18174; partícula reguladora de proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11: ortólogo de CG18174
ARNi-pMON78440:001
Dv.20_CG3180; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG3180
ARNi-pMON96156:001
Dv.20_CG3180; subunidad de 140 kD de ARN polimerasa II potencial: ortólogo de CG3180
ARNi-pMON78420:001
Dv.21_CG3320; Rab1 potencial: ortólogo de CG3320
ARNi-pMON78427:006
Dv.35_CG3762; Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762.
ARNi-pMON78428:001
Dv.49_CG8055_1; unión potencial, actividad de vehículo: ortólogo de CG8055_1
ARNi-pMON96177:001
Dv61_CG3725_1; ATPasa de calcio potencial: ortólogo de CG3725
ARNi-pMON96166:001
Dv.70_CG5771; proteína Rab 11 potencial: ortólogo de CG5771
ARNi-pMON96174:001
Dv86_CG5055; bazooka potencial: ortólogo de CG5055
ARNi-pMON97111:001
Dv105_CG1250_1; activador de GTPasa, implicado en el transporte de proteínas intracelular: ortólogo de CG1250
ARNi-pMON97107:001
Dv.107_CG14813; revestimiento de vesícula COPI; implicado en el transporte de proteínas intracelular de Golgi a RE: ortólogo de CG14813
Ejemplo 4 Transformación y bioensayos de plantas transgénicas
Brevemente, la secuencia que codifica una construcción de ARNbc como se ha descrito anteriormente se liga en el extremo 5’ con una secuencia que consiste en un promotor 35S unido operativamente con un intrón de hsp70 de maíz y en el extremo 3’ con una secuencia de terminación de la transcripción Nos3’ y poliadenilación. Este casete de
expresión se coloca cadena abajo de un casete de selección de glifosato. Estos casetes ligados se colocan después en un vector funcional de transformación de plantas de Agrobacterium tumefaciens, usado para transformar tejido de maíz a tolerancia a glifosato, y los acontecimientos seleccionadas y se transfieren al suelo. Se alimentan larvas de crisomélido de maíz occidental (WCR, Diabrotica virgifera) con raíces de plantas R0. Las raíces de maíz transgénicas se entregan en placas de Petri con medio MS0D que contiene antibióticos y glifosato para selección in vitro. Se infestan dos larvas de WCR por raíz en cada placa con un pincel de punta fina. Las placas se sellan con Parafilm para evitar que las larvas se escapen. Los ensayos se colocan en un incubador Percival RH 60 %, a 27 ºC, en oscuridad completa. Se supervisa la contaminación y la calidad larvaria. Después de seis días de alimentación con tejido de raíz, las larvas se transfieren a una dieta de WCR en una placa de 96 pocillos. Se permite que las larvas se alimenten de la dieta durante ocho días realizando el ensayo completo de catorce días de duración. Se registran la masa y supervivencia larvarias para análisis. Se realiza un análisis de ANOVA de una vía y ensayo de Dunnett en los datos de masa larvaria para buscar significación estadística en comparación con un control negativo no transformado. Se mide la atrofia de larvas de WCR después de alimentación con dos acontecimientos y en comparación con el crecimiento de larvas alimentadas con plantas de control negativo.
Se plantan plantas de maíz transgénico (R0) en macetas de 25,40 cm que contienen suelo Metromix después de alcanzar un tamaño apropiado. Cuando las plantas alcanzan el estadio de crecimiento V4, aproximadamente 1000 huevos de crisomélido de maíz occidental (WCR, Diabrotica virgifera) infestan la zona de la raíz. Maíz no transgénico del mismo genotipo se infesta en un estadio de crecimiento similar para actuar como un control negativo. Los huevos se preincuban de modo que se produzca eclosión a las 24 horas de la infestación. Se permite que las larvas se alimenten de los sistemas de raíz durante 3 semanas. Las plantas se retiran del suelo de modo que las raíces puedan evaluarse con respecto a alimentación larvaria. El daño de la raíz se valora usando una Escala de Lesión de Nódulos (NIS) para puntuar el nivel de daño en el que un 0 indica ausencia de daño, un 1 indica que un nodo de las raíces se poda a 38,10 mm, un 2 indica que se podan 2 nódulos, mientras que un 3 indica que se podan 3 nodos. Debido a que las plantas usadas para evaluación están directamente fuera del cultivo tisular después de transformación y debido a que los acontecimientos de transformación son únicos, solamente se evalúa una única planta por acontecimiento en este momento. Las plantas en el ensayo que presentan signos o síntomas de alimentación larvaria indican que se ha obtenido una infestación exitosa. Las raíces vegetales de control negativo se dañan de moderada a gravemente en promedio mientras que las raíces de las plantas transgénicas proporcionan control sustancial de la alimentación larvaria, con aproximadamente 0,2 o menos en la Escala de Lesión de Nódulos.
Ejemplo 5
Implementación de supresión de gen de plaga de insectos usando un procedimiento de silenciamiento mediado por ARNip-at
Un procedimiento alternativo para silenciar genes en una plaga de plantas usa la clase recientemente descubierta de ARN de interferencia pequeño de acción en trans (ARNip-at) (Dalmay y col., 2000; Mourrain y col., 2000; Peragine y col., 2004; Vazquez y col., 2004). Los ARNip-at derivan de transcritos de ARN monocatenarios a los que se dirigen miARN de origen natural dentro de la célula. Se describen procedimientos para usar microARN para desencadenar ARNip-at para el silenciamiento génico en plantas en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.º de Serie 60/643.136 (Carrington y col. 2004), incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. Se identifica al menos un miARN específico de plaga expresado en células epiteliales del intestino de larvas de crisomélidos del maíz. Este miARN específico de plaga se usa después para identificar al menos una secuencia de transcrito de ARN diana complementaria de miARN que se expresa en la célula. La secuencia diana correspondiente es una secuencia corta de no más de 21 nucleótidos contiguos que, cuando forma parte de un transcrito de ARN y se pone en contacto con su miARN correspondiente en un tipo celular con una ruta de ARNi funcional, conduce a escisión mediada por cortador de dicho transcrito. Una vez que se han identificado secuencias diana de miARN, al menos una secuencia diana de miARN se fusiona con una segunda secuencia que corresponde a parte de un gen de plaga que va a silenciarse usando este procedimiento. Por ejemplo, la secuencia o las secuencias diana de miARN se fusionan con cualquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 906, o un fragmento de las mismas, tal como una secuencia del gen de la ATPasa vacuolar de crisomélido (V-ATPasa). La secuencia diana de miARN puede colocarse en el extremo 5’, el extremo 3’ o incluirse en el medio de la secuencia diana. Puede ser preferible usar múltiples secuencias diana de miARN correspondientes a múltiples genes de miARN, o usar la misma secuencia diana de miARN múltiples veces en la quimera de la secuencia diana de miARN y la secuencia génica diana. La secuencia génica diana puede ser de cualquier longitud, con un mínimo de 21 pb.
La quimera de la secuencia o las secuencias de miARN y la secuencia génica diana se expresa en células vegetales usando cualquiera de varios elementos promotores y otros reguladores de la transcripción apropiados, siempre que la transcripción suceda en tipos celulares sujetos a proporcionarse en la dieta de la plaga, por ejemplo raíces de maíz para el control del crisomélido del maíz.
Este procedimiento puede tener la ventaja adicional de suministrar moléculas de ARN más largas a la plaga diana. Típicamente, ARNbc producidos en plantas se procesan rápidamente por Dicer en ARN cortos que pueden no ser eficaces cuando se alimentan de forma exógena a algunas plagas. En este procedimiento, se produce un transcrito monocatenario en la célula vegetal, se capta por la plaga y se convierte en un ARNbc en la célula de plaga donde se procesa después en ARNip-at capaz de silenciar postranscripcionalmente uno o más genes en una o más plagas
diana.
Ejemplo 6
Procedimiento para proporcionar una secuencia de ADN para silenciamiento génico mediado por ARNbc
Este ejemplo ilustra un procedimiento para proporcionar una secuencia de ADN para silenciamiento génico mediado por ARNbc. Más específicamente, este ejemplo describe la selección de un ADN mejorado útil en silenciamiento génico mediado por ARNbc (a) seleccionando de un gen diana una secuencia de ADN inicial que incluye más de 21 nucleótidos contiguos; (b) identificando al menos una secuencia de ADN más corta derivada de regiones de la secuencia de ADN inicial que consiste en regiones que se ha predicho que no generan polipéptidos indeseables y que no muestra identidad con secuencias conocidas tales como homólogos/ortólogos y (c) seleccionando una secuencia de ADN para silenciamiento génico mediado por ARNbc que incluye la al menos una secuencia de ADN más corta. Los polipéptidos indeseables incluyen, pero sin limitación, polipéptidos homólogos de polipéptidos alérgenos y polipéptidos homólogos de toxinas polipeptídicas conocidas.
Se ha demostrado que la V-ATPasa de WCR actúa en ensayos de alimentación de crisomélidos del maíz para ensayar silenciamiento mediado por ARNbc como un medio para controlar el crecimiento larvario. Una secuencia de ADNc de un gen diana, tal como gen de ATPasa vacuolar (V-ATPasa) de crisomélido del maíz occidental (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), se selecciona para su uso como una secuencia de ADN inicial. Esta secuencia de ADN inicial puede explorarse para identificar regiones dentro de las que cada fragmento contiguo que incluye al menos 21 nucleótidos coincide con menos de 21 de 21 nucleótidos contiguos de secuencias de vertebrados conocidas. Se identifican segmentos de secuencia que son mayores de aproximadamente 100 nucleótidos contiguos libres de dichos 21/21 aciertos. Por lo tanto pueden usarse criterios que incluyen la longitud del segmento, el contenido de GC, la secuencia, la función predicha basándose en secuencia o función de un gen correspondiente en un organismo modelo, y estructura secundaria predicha (por ejemplo Elbashir, y col., 2001b) para seleccionar y diseñar secuencia o secuencias para su uso. Se combinan diferentes combinaciones de estos segmentos de secuencia para construir secuencias de ADN quimérico para expresión como ARNbc y uso en bioensayos de alimentación de insectos como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 7
Resultados adicionales de bioensayos de alimentación de insectos con secuencias seleccionadas de base de datos de EST
Este ejemplo ilustra secuencias adicionales que se ha descubierto que son eficaces para provocar atrofia y/o mortalidad larvaria cuando las ingieren larvas de crisomélidos como secuencias de ARN bicatenario. Se describen procedimientos para criar larvas de crisomélidos del maíz, aplicación de ARNbc y bioensayos de insectos en los Ejemplos 1-3. Los resultados de los estudios confirmaron niveles significativos (p<0,05) de atrofia y/o mortalidad larvaria usando ARNbc que contienen partes de secuencias homólogas de una diversidad de diferentes clases génicas. Las secuencias y vectores que producen atrofia y/o mortalidad significativas y la SEQ ID NO correspondiente para la secuencia expresada como un ARNbc se proporcionan en la Tabla 6 posterior. pMON98503, un vector binario ejemplar usado en transformación de maíz, contiene los siguientes elementos entre los límites de ADN-T derecho e izquierdo para transferencia a una célula vegetal: e35S -HSP70 -DV49 (orientación antisentido) – espaciador universal -DV49 (orientación con sentido) -hsp17; ACT (promotor e intrón) – señal de tránsito de CTP2 -CP4 -NOS.: pMON98504, otro vector binario ejemplar usado en la transformación del maíz, contiene los siguientes elementos entre los límites derecho e izquierdo: e35S -HSP70 -C1 (orientación antisentido) -espaciador universal -C1 (orientación con sentido) -hsp17; ACT (promotor e intrón) -señal de tránsito de CTP2 -CP4 -NOS.
Tabla 6: Construcciones de ARNbc adicionales que demuestran efecto de atrofia y/o mortalidad significativo en bioensayos de alimentación de insectos con crisomélido del maíz meridional o crisomélido del maízoccidental
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON98356
Dv164; función desconocida, secuencia única de WCR 726
pMON98354
Dv172; función desconocida, secuencia única de WCR 727
pMON97191
Dv189; función desconocida, secuencia única de WCR 728
pMON98359
Dv200; función desconocida, secuencia única de WCR 729
pMON38880
Dv207_F39H11.5; pbs-7 potencial, endopeptidasa: ortólogo de F39H11.5 730
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON101054
Dv208_F58F12_1; F1F0-ATP sintasa Mitocondrial potencial, subunidad delta/ATP16: ortólogo de F58F12_1 731
pMON98437
Dv210_K11H12_2; rpl-15 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de K11H12_2 732
pMON98435
Dv211_R12E2_3; rpn-8 potencial, factor de inicio de la traducción, complejo regulador de proteasoma 26S, subunidad RPN8: ortólogo de R12E2_3 733
pMON98447
Dv212_C17H12_14; vha-8 potencial, ATPasa exportadora de hidrógeno: ortólogo de C17H12_14 734
pMON98448
Dv213_B0464_1; drs-1 potencial, ARNt ligasa: ortólogo de B0464_1 735
pMON101059
Dv214_F53G12_10; rpl-7 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F53G12_10 736
pMON98442
Dv216_C52E4_4; rpt-1 potencial, subunidad de ATPasa del complejo regulador 19S del proteasoma: ortólogo de C52E4_4 737
pMON98441
Dv218_K01G5_4; ran-1 potencial, GTPasa monomérica pequeña: ortólogo de K01G5_4 738
pMON98440
Dv219_C15H11_7; pas-1 potencial, endopeptidasa: ortólogo de C15H11_7 739
pMON101081
Dv223_R10E11.1; cbp-1 potencial, homólogo de cofactores transcripcionales CBP y p300: ortólogo de R10E11.1 740
pMON101050
Dv224_F11C3_3; unc-54 potencial, unión a ATP; actividad motora: ortólogo de F11C3_3 741
pMON101051
Dv225_C37H5_8; hsp-6 potencial, proteína de choque térmico 6: ortólogo de C37H5_8 742
pMON38888
Dv226_C47D12.5; uba-1 potencial, enzima activadora de ubiquitina: ortólogo de C47E12.5 743
pMON38887
Dv227_F54A3.3; componente de complejo de Chaperonina potencial, subunidad TCP-1: ortólogo de F54A3.3 744
pMON101110
Dv229_D1081.8; unión a ADN de tipo Myb potencial: ortólogo de D1081.8 745
pMON101052
Dv230_F55A11_2; syn-3 potencial, transportador de proteína; sintaxina: ortólogo de F55A11_2 746
pMON101107
Dv231_C30C11.1; proteína ribosómica mitocondrial potencial L32: ortólogo de C30C11.1 747
pMON101055
Dv232_B0250_1; rpl-2 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de B0250_1 748
pMON98446
Dv233_F54C9_5; rpl-5 potencial, unión a ARNr 5S, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F54C9_5 749
pMON101139
Dv235_C04F12.4 ; rpl-14 potencial, proteína de subunidad ribosómica grande L14: ortólogo de C04F12.4 750
pMON98449
Dv236_C01G8_5; erm-1 potencial, familia de Ezrina/Radixina/Moesina (ERM) de engarces citoesqueléticos: ortólogo de C01G8_5 751
pMON98439
Dv237_F57B9_10; rpn-6 potencial, Partícula Reguladora de proteasoma, de tipo distinto de ATPasa: ortólogo de F57B9_10 752
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON98436
Dv240_F53A3_3; rps-22 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F53A3_3 753
pMON101078
Dv241_F32H2.5; alcohol deshidrogenasa potencial, dependiente de cinc: ortólogo de F32H2.5 754
pMON101058
Dv242_B0336_2; arf-1 potencial, GTPasa monomérica pequeña: ortólogo de B0336_2 755
pMON101057
Dv244_C14B9_7; rpl-21 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de C14B9_7 756
pMON98444
Dv245_C26F1_4; rps-30 potencial, Proteína ribosómica, subunidad pequeña: ortólogo de C26F1_4 757
pMON98434
Dv247_C13B9_3; subunidad delta potencial del complejo de coatómero (COPI): ortólogo de C13B9_3 758
pMON101053
Dv248_F38E11_5; complejo de revestimiento de vesícula potencial COPI, subunidad beta’: ortólogo de F38E11 5 759
pMON98445
Dv249_F37C12_9; rps-14 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F37C12_9 760
pMON101056
Dv250_CD4_6; pas-6 potencial, endopeptidasa: ortólogo de CD4_6 761
pMON101104
Dv251_D1007.12; rpl-24.1 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de D1007.12 762
pMON101088
Dv252_C49H3.11; rps-2 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de C49H3.11 763
pMON101079
Dv253_C26D10.2; hel-1 potencial, ARN helicasa dependiente de ATP: ortólogo de C26D10.2 764
pMON101085
Dv254_B0336.10; rpl-23 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de B0336.10 765
pMON38879
Dv255_C36A4.2; miembro potencial de la familia de Citocromo P450: ortólogo de C36A4.2 766
pMON101087
Dv256_K05C4.1; pbs-5 potencial, subunidad beta de proteasoma: ortólogo de K05C4.1 767
pMON101082
Dv257_F29G9.5; rpt-2 potencial, complejo regulador de proteasoma 26S: ortólogo de F29G9.5 768
pMON101084
Dv258_F40F8.10; rps-9 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F40F8.10 769
pMON101083
Dv259_K07D4.3; rpn-11 potencial, complejo regulador de proteasoma 26S, subunidad RPN11: ortólogo de K07D4.3 770
pMON101080
Dv260_F49C12.8; rpn-7 potencial, Partícula Reguladora de proteasoma, de tipo distinto de ATPasa: ortólogo de F49C12.8 771
pMON101115
Dv261_D1054.2; pas-2 potencial, endopeptidasa: ortólogo de D1054.2 772
pMON101141
Dv263 _F55A3.3; metaloexopeptidasa potencial: ortólogo de F55A3.3 773
pMON101126
Dv264_F56F3.5; rps-1 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F56F3.5 774
pMON101133
Dv266_C09D4.5; rpl-19 potencial, constituyente estructural de ribosoma: 775
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
ortólogo de C09D4.5
pMON38881
Dv268_R06A4.9; complejo de factor de Poliadenilación I potencial, subunidad PFS2: ortólogo de R06A4.9 776
pMON101135
Dv271_F37C12.4; rpl-36 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F37C12.4 777
pMON101132
Dv273_F54E7.2; rps-12 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F54E7.2 778
pMON101139
Dv274_C23G10.4; rpn-2 potencial, Partícula Reguladora de proteasoma, de tipo distinto de ATPasa: ortólogo de C23G10.4 779
pMON101130
Dv275_C03D6.8; rp1-24.2 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de C03D6.8 780
pMON101119
Dv276_C26E6.4; ARN polimerasa dirigida a ADN potencial: ortólogo de C26E6.4 781
pMON101134
Dv277_R13A5.8; rpl-9 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de R13A5.8 782
pMON101127
Dv279_F42C5.8; rps-8 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F42C5.8 783
pMON101122
Dv280_F13B10.2; rpl-3 potencial, subunidad ribosómica grande L3: ortólogo de F13B10.2 784
pMON101116
Dv281_T05C12.7; cct-1 potencial, componente del complejo de Chaperonina, subunidad TCP-1 alfa: ortólogo de T05C12.7 785
pMON101125
Dv282_F07D10.1; rpl-11.2 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F07D10.1 786
pMON38883
Dv283_T05H4.6; factor de liberación de cadena peptídica 1 (eRF1) potencial: ortólogo de Dv283_T05H4.6 787
pMON101124
Dv284_C47E8.5; daf-21 potencial, proteína de choque térmico 90, actividad de chaperona: ortólogo de C47E8.5 788
pMON101120
Dv285_M03F4.2; act-4 potencial, actina: ortólogo de M03F4.2 789
pMON101137
Dv286_F25H5.4; eft-2 potencial, factor de elongación de la traducción: ortólogo de F25H5.4 790
pMON101140
Dv287_F26D10.3; hsp-1 potencial, proteína de choque térmico: ortólogo de F26D10.3 791
pMON101117
Dv288_F28D1.7; rps-23 potencial, constituyente estructural de ribosoma: ortólogo de F28D1.7 792
pMON38886
Dv290_CG11979; ATPasa exportadora de H potencial: ortólogo de CG11979 793
pMON38885
Dv291_CG13628; ATPasa exportadora de H potencial: ortólogo de CG13628 794
pMON101103
Dv293_CG31237; ARN polimerasa II dirigida a ADN potencial: ortólogo de CG31237 795
pMON101096
Dv294_CG8669; cryptocephal potencial; factor de transcripción, implicado en el ciclo de muda, pupación y metamorfosis: ortólogo de CG8669 796
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON101095
Dv295_CG8048 subunidad C de 44 kD de H+ ATPasa Vacuolar potencial: ortólogo de CG8048 797
pMON101100
Dv298_CG9032; ATPasa exportadora de H potencial: ortólogo de CG9032 798
pMON101111
Dv299_CG17369; ATPasa exportadora de H potencial: ortólogo de CG17369 799
pMON101129
Dv303_CG4152; ARN helicasa dependiente de ATP potencial: ortólogo de CG4152 800
pMON101136
Dv305_CG4916; ARN helicasa dependiente de ATP potencial: ortólogo de CG4919 801
pMON101131
Dv315_CG9160; NADH deshidrogenasa potencial: ortólogo de CG916 802
pMON101123
Dv316_CG8764; ubiquinol-citocromo-c reductasa potencial: ortólogo de CG8764 803
pMON98364
Concatémero C4_Dv49_CG8055; actividad vehículo, de unión potencial: ortólogo de CG8055 804
pMON98365
Concatémero C5_Dv49_CG8055; actividad vehículo, de unión potencial: ortólogo de CG8055 . 805
pMON98368
Concatémero C6 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ∼50 % de GC, que consiste en segmentos en el orden 5’-3’ de Dv26, Dv49, Dv23, Dv20, Dv13, Dv22, Dv18 806
pMON98369
Concatémero C7 de dianas específicas de insecto, criterio de ∼50 % de GC, que consiste en segmentos en el orden 5’-3’ de Dv6, Dv1, Dv88, Dv93, Dv4, Dv9113, Dv127, Dv99 807
pMON98372
Concatémero C8; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261 808
pMON98373
Concatémero C9; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261 809
pMON98366
Concatémero C10 de genes con el mismo/diferente modo de acción potencial, criterio de ∼50 % de GC 810
pMON98367
Concatémero C12 de dianas específicas de insecto, criterio de ∼50 % de GC, que consiste en los segmentos en el orden 5’-3’ de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20. 811
pMON98371
Concatémero C14 de dianas génicas activas en varios organismos diferentes, criterio de ∼50 % de GC 812
pMON98503
Que comprende subunidad de complejo ESCRT-III (complejo de clasificación endosómica requerido para transporte III) potencial DV49 de Diabrotica virgifera 820
pMON98504
Que comprende Vha68-2 potencial: ortólogo de CG3762; concatémero C1 de 250 pb; 821
pMON102862
Dv319_ CG14750; ESCRTII potencial, Vps25: ortólogo de CG14750 835
pMON102863
Dv320_CG9712; ESCRT potencial I, Vps23: ortólogo de CG9712 836
pMON102861
Dv321_CG12770; ESCRTI potencial, Vps28: ortólogo de CG12770 837
pMON102865
Dv322_ CG14542; ESCRT III potencial, Vps2: ortólogo de CG14542 838
(continuación)
Vector
Secuencia expresada como ARNbc SEQ ID NO
pMON102866
Dv323_CG4071; ESCRT III potencial, Vsp20: ortólogo de CG4071 839
pMON102871
Dv326_CG3564; vehículo proteico potencial, componente del revestimiento de vesícula COPI: ortólogo de CG3564 840
pMON102873
Dv327_CG6223; coatómero potencial, componente del revestimiento de vesícula COPI: ortólogo de CG6223 841
pMON102877
Dv328_CG6948; cadena ligera de Clatrina potencial, revestimiento de fosa revestida: ortólogo de CG6948 842
pMON102872
Dv330_CG9543; revestimiento de vesícula COPI potencial: ortólogo de CG9543 843
pMON102879
Dv331_CG5183; unión a secuencia KDEL potencial: ortólogo de CG5183 844
pMON102867
Dv335_F11C1.6; nhr-25 potencial, unión a ADN: ortólogo de F11C1.6 845
pMON102870
Dv337_CG18734; furina 2 potencial, endopeptidasa de tipo serina: ortólogo de CG18734 846
pMON102875
Dv329_CG7961; coatómero potencial, componente del revestimiento de vesícula COPI: ortólogo de CG7961 874
Se realizaron ensayos de eficacia de la siguiente manera, utilizando descendencia de plantas de maíz transformadas con construcciones de control de insecto seleccionadas:
1.
Siete días después de la plantación: incubar 10.000 huevos de WCR por acontecimiento (10 plantas por acontecimiento) a 25 ºC, RH 60 % en oscuridad completa durante siete días.
2.
Catorce días después de la infestación: las plantas se trasplantan de macetas de turba de 10,16 cm a macetas de 20,32 cm; pueden tomarse muestras de la punta de la raíz v4 para estudios de expresión génica.
3.
Catorce días después de la plantación: lavar los huevos de WCR del suelo. Colocar los huevos y el suelo en un tamiz de malla 60 y colocar un tamiz de malla 30 sobre el tamiz de malla 60 para proteger los huevos de la corriente de agua. Aclarar exhaustivamente con agua caliente usando una boquilla de pulverización hasta que se retire el suelo.
4.
Suspender los huevos en una solución de agar Difco 2 % /p/v), 25 ml de solución por cada 1 ml de huevos. Los huevos se infestan en el suelo en aproximadamente 3 o 4 alícuotas usando, por ejemplo, una pipeta repetidora de Eppendorf, aproximadamente 1000 huevos por planta. Se hacen agujeros en el suelo usando una espátula antes de la infestación y se cubre después de la infestación.
5.
Veintiocho días después de la plantación pueden tomarse muestras de la punta de la raíz v8 para estudios de expresión génica.
6.
Treinta y cinco días después de la plantación, se evalúa el ensayo. Las plantas se cortan usando tijeras de poda, dejando aproximadamente 15,25 cm de tallo. Se perforan estacas vegetales que contienen la información del acontecimiento y se atan con cierre al tallo. Se retira tanto suelo como sea posible del sistema de raíces. El resto del suelo se retira por lavado usando una manguera de pulverización.
7.
Las raíces se examinan y se les proporciona una clasificación de daño de raíz usando la escala de NIS Olsen (0-3) para daño por larvas de WCR.
La FIG. 1 y la FIG. 2 ilustran resultados de control de insectos obtenidos después de exposición de plantas de maíz F1 (derivadas de plantas transformadas con pMON98503 o pMON98504) con WCR. En los ensayos de eficacia de cámara de crecimiento realizados esencialmente como se ha descrito anteriormente, se vieron puntuaciones NIS en
o por debajo del umbral de perjuicio económico en descendencia de acontecimientos derivados por transformación con pMON98503 o pMON98504.
Se ensamblaron secuencias de ADN de EST de longitud completa para genes seleccionados descritos en los Ejemplos 3 y 7 que presentan actividad significativa frente a Crisomélido de Maíz Occidental. Estas secuencias de EST se enumeran en la Tabla 7:
Tabla 7: Secuencias de EST ensambladas para dianas de WCR
Secuencia ensamblada
SEQ ID NO
Dv9 de longitud completa (también conocido como Apple); ortólogo potencial de CG2331
813
Dv10 de longitud completa (Rp19); ortólogo potencial de CG6141
814
Dv11 de longitud completa (Rp119); ortólogo potencial de CG2746
815
Dv13 de longitud completa (Rps4); ortólogo potencial de CG11276
816
Dv35 de longitud completa v-ATPasa A; ortólogo de CG3762
817
Dv49 de longitud completa ortólogo de CG8055
818
Dv248 de longitud completa ortólogo potencial de CG6699
819
Ejemplo 8
Resultados de creación y eficacia para secuencias de Dv49 y Dv248
5 Se seleccionaron partes de las secuencias de EST ensambladas y adyacentes de Dv49 (SEQ ID NO: 818) y Dv248 (SEQ ID NO: 819) para ensayos de bioactividad adicionales basándose en criterios que incluían la función predicha, el fenotipo de mutantes de desactivación de regiones codificantes correspondientes en otros organismos, longitud de segmentos, contenido de GC, similitud con secuencias conocidas y estructura secundaria predicha (por ejemplo, Elbashir y col., 2001b). Las secuencias de Dv49 y Dv248 respectivas se sintetizaron in vitro basándose en su 10 actividad predicha frente a WCR individualmente, así como agrupadas como se muestran en las FIG. 3-4, y la Tabla 8, y se aplicaron a larvas de WCR.
Tabla 8: Fragmentos de Dv49 y Dv248 evaluados con respecto a eficacia contra WCR
Fragmento
SEQ ID NO
F1
822
F2
823
F3
824
F4
825
F5
826
F6
827
F7
828
F8
829
F9
830
F10
831
F11
832
F12
833
F13
834
Los fragmentos F1 – F3 corresponden a partes del transcrito de Dv49 de longitud completa. Los fragmentos F4 – F6 15 corresponden a partes del transcrito de Dv248 o región flanqueante. Los fragmentos F7 – F13 son concatémeros de dos o más de los fragmentos F1 – F6, como se muestra en la FIG. 4. El fragmento F13 (SEQ ID NO: 834) representa el concatémero C38 (Dv49-Dv248).
Se muestran datos de respuesta a dosis para F1 – F13 en las FIG. 5-7. Como se muestra en la FIG. 5, la actividad
(% de mortalidad larvaria) de los fragmentos F4-F6, que comprenden secuencias derivadas de Dv248 (FIG. 4), fue significativamente mejor que el control cuando se suministraron a larvas de WCR a 0,1 ppm. El fragmento F6 presentó actividad significativa cuando se suministró a 0,02 ppm también. La actividad de fragmento F5 a la dosis menor es probablemente un artefacto, ya que las larvas supervivientes no presentaron atrofia.
5 Como se muestra en la FIG. 6, cada uno de los fragmentos F7-F10 presenta actividad estadísticamente significativa cuando se suministra a larvas de WCR a 0,1 ppm. Los fragmentos F9 y F10 también presentaron actividad estadísticamente significativa cuando se suministraron a larvas de WCR a 0,02 ppm, y el fragmento F10 presentó actividad estadísticamente significativa cuando se suministró a larvas de WCR a 0,01 ppm también. La actividad de F8 a 0,01 ppm puede ser un artefacto.
10 Como se muestra en la FIG. 7, los fragmentos F11-F13 presentan actividad estadísticamente significativa cuando se
alimentan a larvas de WCR a 0,02 ppm o más. Adicionalmente, los fragmentos mayores (F12 y F13) muestran
actividad a 0,005 ppm y más.
Ejemplo 9
Secuencias de concatémeros activos adicionales derivados del concatémero C6
15 Como se muestra en la Tabla 9, se identificaron partes del concatémero activo C6 (SEQ ID NO: 806), derivado de pMON98386, en bioensayos de superposición de dieta (realizados como se describe por ejemplo en el Ejemplo 2) como inhibidores del crecimiento y/o la supervivencia de crisomélido del maíz (WCR). El concatémero de longitud completa C6 contiene 7 subfragmentos diana de 70 pb cada uno, como se observa en la Tabla 6 y la Tabla 9
Tabla 9: Eficacia del concatémero C6 de longitud completa y subpartes seleccionadas en bioensayo de dieta 20 de crisomélido (SEQ ID NO: 806, 847-873).
Concatémero
Segmentos % de Mortalidad a 1 ppm SEQ ID NO
C6_longitud completa
Dv26-Dv49-Dv23-Dv20-Dv13-Dv22-Dv18 100 806
C6.1
Dv26-Dv49 35,3 847
C6.2
Dv26-Dv49-Dv23 57,1 848
C6.3
Dv26-Dv49-Dv23-Dv20 84,7 849
C6.4
Dv26-Dv49-Dv23-Dv20-Dv13 51 850
C6.5
Dv26-Dv49-Dv23-Dv20-Dv13-Dv22 41,3 851
C6.6
Dv49-Dv23 94,6 852
C6.7
Dv49-Dv23-Dv20 75,6 853
C6.8
Dv49-Dv23-Dv20-Dv13 50 854
C6.9
Dv49-Dv23-Dv20-Dv13-Dv22 56,4 855
C6.10
Dv49-Dv23-Dv20-Dv13-Dv22-Dv 18 52,5 856
C6.11
Dv23-Dv20 74,6 857
C6.12
Dv23-Dv20-Dv13 63.4 858 63,4 858
C6.13
Dv23-Dv20-Dv13-Dv22 58,5 859
C6.14
Dv23-Dv20-Dv13-Dv22-Dv18 60,8 860
C6.15
Dv20-Dv13 57,5 861
C6.16
Dv20-Dv13-Dv22 20 862
C6.17
Dv20-Dv13-Dv22-Dv18 44,8 863
(continuación)
Concatémero
Segmentos % de Mortalidad a 1 ppm SEQ ID NO
C6.18
Dv13-Dv22 71,1 864
C6.19
Dv13-Dv22-Dv18 52,5 865
C6.20
Dv22-Dv18 44,6 866
C6.28
Dv26 58,9 867
C6.29
Dv49 72,3 868
C6.30
Dv23 71,9 869
C6.31
Dv20 62,6 870
C6.32
Dv13 54,2 871
C6.33
Dv22 56,7 872
C6.34
Dv18 44,6 873
El concatémero C7 de longitud completa contiene 8 sub-fragmentos diana de 70 pb cada uno, como se observa en la Tabla 6. De forma similar, el concatémero C12 de longitud completa contiene 7 sub-fragmentos diana de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20 que varían de longitud entre 53-80 pb, como se observa en la Tabla 6 y la Tabla
10.

Tabla 10: Composición de concatémero C12 de longitud completa y subpartes seleccionadas (SEQ ID NO: 811, 887-892)
Concatémero
Segmentos Secuencia (SEQ ID NO 5) incluida en dirección 5’-3’
C12_longitud completa
Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20 811
C12.1
Dv23-Dv13 887
C12.2
Dv23-Dv13-Dv26 888
C12.3
Dv23-Dv13-Dv26-Dv18 889
C12.4
Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49 890
C12.5
Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22 891
C12.6
Dv13-Dv26 892
C12.7
Dv13-Dv26-Dv18 893
C12.8
Dv13-Dv26-Dv18-Dv49 894
C12.9
Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22 895
C12.10
Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20 896
CC12.11
Dv26-Dv18 897
C12.12
Dv26-Dv18-Dv49 898
C12.13
Dv26-Dv18-Dv49-Dv22 899
(continuación)
Concatémero
Segmentos Secuencia (SEQ ID NO 5) incluida en dirección 5’-3’
C12.14
Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20 900
C12.15
Dv18-Dv49 901
C12.16
Dv18-Dv49-Dv22 902
C12.17
Dv18-Dv49-Dv22-Dv20 903
C12.18
Dv49-Dv22 904
C12.19
Dv49-Dv22-Dv20 905
C12.20
Dv22-Dv20 906
La Tabla 11 enumera secuencias adicionales para su uso en la dirección a otras plagas de coleópteros, incluyendo Diabrotica sp. y otras Coccinellidae y Chrysomelidae.

Tabla 11: Secuencias diana de coleópteros adicionales
Secuencia y fuente
SEQ ID NO
Dbar248_CG6699 (D. barberi)
875
Dbal248_CG6699 (D. balteata)
876
Du248_CG6699 (D. undecimpunctata howardi)
877
Dz248_CG6699 (D. virgifera zea)
878
Dv248_CG6699 (D. virgifera virgifera)
879
Ev248_CG6699 (Epilachna varivestis)
880
(continuación)
Secuencia y fuente
SEQ ID NO
Ld248_CG6699 (Leptinotarsa decemlineata)
881
Dbal49_CG8055_2 (D. balteata)
882
Db49_CG8055_2 (D. barberi)
883
Du49_CG8055_2 (D. undecimpunctata howardi)
884
Dz49_CG8055_2 (D. virgifera zea)
885
Dv49_CG8055_2 (D. virgifera virgifera)
886
Referencias
Patentes de Estados Unidos: 4.245.432; 4.272.417; 4.339.456; 4.372.080; 4.383.391; 4.465.017; 4.536.475; 10 4.634.587; 4.693.977; 4.735.015; 4.759.945; 4.876.197; 4.880.734; 4.886.937; 4.959.317; 5.080.925; 5.107.065; 5.107.787; 5.231.020; 5.283.184; 5.300.127; 5.302.523; 5.328.942; 5.384.253; 5.389.399; 5.464.765; 5.501.967; 5.527.695; 5.538.877; 5.538.880; 5.550.318; 5.554.445; 5.563.055; 5.580.544; 5.591.616; 5.593.874; 5.622.003; 5.633.435; 5.661.103; 5.698.425; 5.712.135; 5.759.829; 5.780.708; 5.789.214; 5.791.084; 5.804.693; 5.834.447; 5.837.848; 5.849.320; 5.876.739; 5.882.713; 5.891.246; 5.918.413; 5.939.356; 6.118.047; 6.326.193; 6.489.542 y
15 6.506.559. Solicitudes de Patente de Estados Unidos N.º de Serie: 10/205.189; 10/465.800 y 60/643.136. Publicaciones de Patente de Estados Unidos N.º: 2002/0048814; 2002/0048814; 2003/0018993; 2003/0061626;
2003/0150017; 2003/0175965 y 2004/0029283. Altschul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990. Ausubel y col., En: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, Nueva York, 1998. Babst y col., Dev. Cell, 3: 271-282, 2002. Beutler y col., N. Engl. J. Med., 324(19): 1370, 1991. Bevan y col., Nature, 304: 184-187, 1983. Botstein y col., Gene, 8(1): 17-24, 1979. Brake y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(15): 4642-4646, 1984. Brutlag y col., Computers and Chemistry, 17: 203-207, 1993. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. (Eds.), Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1989. Dalmay y col., Cell, 101:543-553, 2000. Dellaporta y col., En: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988. Dow y col., J. Exp. Biol., 200(Pt 2): 237-245, 1997. Dow, J. Bioenerg. Biomembr., 31(1): 75-83, 1999. Elbashir y col., Genes Dev., 5(2):1 88-200, 2001a. Elbashir y col., EMBO J. 20: 6877-6888, 2001b. Elbashir y col., Methods, 26: 199-213, 2002. Solicitud Europea 0 120 516 Solicitud Europea 0 122 791 Solicitud Europea 0 127.328 Hamilton y Baulcombe, Science, 286(5441): 950-952, 1999. Hannon y col., J. Mol. Neurosci., 18(1-2): 15-27, 2002. Haymes y col., En: Nucleic acid hybridization, a practical approach, IRL Press, Washington, DC, 1985. Herrera-Estrella y col., Nature, 303: 209-213, 1983. Ikatu y col., Bio/Technol., 8: 241-242, 1990. Jefferson y col., EMBO J., 6: 3901-3907, 1987a. Jefferson y col., Plant Mol. Biol, Rep., 5: 387-405, 1987b. Kaeppler y col., Plant Cell Rep., 8: 415-418, 1990. Katz y col., J. Gen. Microbiol., 129: 2703-2714, 1983. Kennerdell y Carthew, Cell, 95: 1017-1026, 1998. Kennerdell y Carthew, Nat. Biotechnol., 18: 896-898, 2000. Klee y col., Bio-Technology, 3(7): 637-642, 1985. Lovato y col., Insect Mol. Biol., 10(4): 333-340, 2001. Lu y col., Phytochemistry, 53(8): 941-946, 2000. Mourrain y col., Cell, 101: 533, 2000. Myanohara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(1): 1-5, 1983. Odell y col., Nature, 313 :810-812, 1985. Ogas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(24): 13839-13844, 1999. Omirulleh y col., Plant Mol. Biol., 21(3): 415-428, 1993. Orr-Weaver y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(14): 4417-4421, 1983. Solicitudes de PCT. WO 97/32016; WO 99/53050; WO 99/49029; WO 94/01550; WO 98/05770 Peragine y col, Genes Dev., 18(19): 2368-2379, 2004. Pleau y col., Entomol. Exp. Appl. 105: 1-11, 2002. Pontius y col., En: UniGene: A unified view of the transcriptome. NCBI handbook. National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, 2003. Potrykus y col., Mol. Gen. Genet., 199(2): 169-177, 1985. Rajagopal y col., J. Biol. Chem., 277: 46849-46851, 2002. Rine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(22): 6750-6754. 1983. Sambrook y col., En: Molecular cloning: a laboratory manual, 2ªd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Schnepf y col., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62(3): 775-806, 1998. Smith y col., Cell Dev. Biol., 33: 75-79; 1997. Stinchcomb y col., J. Mol. Biol., 158(2): 157-190, 1982. Sutcliffe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3737-3741, 1978. Tabara y col., Science, 282(5388): 430-431, 1998. Tabashnik, Appl. Environ. Microbiol., 58(10): 3343-3346, 1992. Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem., 264(33): 19475-19477, 1989. Vazquez y col, Mol. Cell, 16(1): 69-79, 2004. Yadav y col., Molec. Biochem. Parasitol., doi:10.1016/j.molbiopara.2006.03.013; en prensa, 2006. Zukowsky y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1101-1105, 1983.
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15
<160> 906
<170> PatentIn Ver. 2.1
20
<210> 1 <211> 888 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<220> <221> modified_base <222> (775) <223> n = a, c, g o t/u
30
<400> 1
<210> 2
<211> 381
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 2
<210> 3
<211> 859
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 3
<210> 4 10 <211> 873
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 15 <221> modified_base
<222> (745)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 4 20
<210> 5
<211> 1384
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 5
<210> 6
<211> 735
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 6
<210> 7
<211> 888
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 7
5
<210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 8 ccgaaaatgc cgagtcaaga attaacaac 29 <210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 9 gcatcctgat ttatatcggg caaaag 26
20
<210> 10 <211> 746 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 10
<210> 11
<211> 1123
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 11
5
<210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 12 gacgttgcgt ccgaacagag cattac 26 <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 13 gttcagaaag ttgctgggcg tagtcg 26
20
<210> 14 <211> 743 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 14
<210> 15
<211> 2325
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (107)..(185)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 15
10
<210> 16 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
15
<400> 16 tcgtcatcgt ccaaatccat agcaac 26
20
<210> 17 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 17 ggaaactcat ggtcacgtag gtgctg
26
25
<210> 18
<211> 978
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 18
<210> 19 10 <211> 637
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 19 15
<210> 20
<211> 31
20
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 20
ggaattacag taaccactaa gtcaagggta g 31
25
<210> 21
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30
<400> 21
cagatacata aagcccatct aagaatttac g 31
<210> 22
35
<211> 499
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 22
5 <210> 23
<211> 678
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 23
15
<210> 24 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 24 ctagcagcct ctgttatgcg atgtgg 26
25
<210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 25 gcttcatcct ccctcatgta gttctgc
27
30
<210> 26 <211> 554 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 26
<210> 27
<211> 927
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 27
<210> 28
<211> 25
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 28 gaacagaaag aggagcccga aaagg 25
20 <210> 29
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 29 gcatcaattc aatcaaagaa tatcaagcag g 31
<210> 30
<211> 800 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 30
<210> 31
<211> 831
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 31
15
<210> 32 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 32 gtgttttggc tgctaacctc ttgtctctc
29
20
<210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 33 gcatggatgt tggacaaatt gggag
25
30
<210> 34 <211> 733 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 34
<210> 35
<211> 3173
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 35
<210> 36
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 36 ggtttggatg ctgaattata ccgtctaggt c 31
<210> 37
<211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 37 ggtgatcctt ggtggctttg tcttg 25
<210> 38
<211> 672
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 38
<210> 39
<211> 1222
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 39
<210> 40
<211> 26
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 40 cgtctcacag actcctgtcg atttgg 26
20 <210> 41
<211> 34
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 41 caattagaag ttagagtact tggagcagac catg 34
<210> 42
<211> 684 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 42
<210> 43
<211> 864
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 10
<220>
<221> modified_base
<222> (842)
<223> n = a, c, g o t/u 15
<400> 43
20 <210> 44
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 44 caaggactat tgccagatca ttttgtcc 28
<210> 45
<211> 33 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 45
gattttttgt tctctttgag ttttcatttc ctc 33 35
<210> 46
<211> 790
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 46
<210> 47
<211> 1491
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 47
<210> 48
<211> 34
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 48 gcaaagaatg tatagaatgg gcaaaggaag agag 34
<210> 49 5 <211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 49 10 ggttctgctc caacatattg tcatacaacg 30
<210> 50
<211> 675
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 50
<210> 51
<211> 942
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 51
30 <210> 52
<211> 22
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 52 cttcgtcatc atcgggcagt gc 22
<210> 53
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
5 <400> 53 cgtcttggtc ggagatggag gtactg 26
<210> 54
<211> 605 10 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 54
<210> 55
<211> 763
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 55
25 30
<210> 56 <211> 23 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 56 cgactaggag gtggaatgcc agg 23
35
<210> 57 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
40
<400> 57 caaagcctgg actgatggtt tctgtag 27
<210> 58
<211> 564
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 58
<210> 59
<211> 1156
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 59
<210> 60
<211> 25
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 60 gtctaggcac ggacaaaagg gaacg 25
25 <210> 61
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 61 gacaatctcg ttccatctca ccgaaac 27
<210> 62
<211> 677
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 62
<210> 63 10 <211> 1156
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 63 15
<210> 64
<211> 25
20
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 64
gtctaggcac ggacaaaagg gaacg 25
25
<210> 65
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30
<400> 65
gctcttgaaa cagtaatttc gcagcat 27
<210> 66
<211> 677
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 66
10 <210> 67
<211> 919
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 67
<210> 68 20 <211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 68 25 caaacttctg ctgattggag attcagg 27
<210> 69
<211> 25
<212> ADN 30 <213> Diabrotica virgifera
<400> 69 cttggtctac cgcagaagat ggagg 25
35 <210> 70
<211> 521
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 70
<210> 71
<211> 755
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 71
<210> 72
<211> 31
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 72 gtttagatca agaattgaaa atcatcggag c 31
25 <210> 73
<211> 21
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 73 gcacctccac caccgctctt c 21
<210> 74
<211>
490 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 74
<210> 75
<211>
857 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (818)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 75
<210> 76
<211> 34
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 76 gcagacgctg atgatctatt agattatgaa gatg 34
25 <210> 77
<211> 32
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 77 cttgaacatc acgtctcatg tctaataact cc 32
<210> 78
<211> 627 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 78
<210> 79
<211> 847
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 79
<210> 80
<211> 23
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 80 gcgtccgtat ctaaccaggc agc 23
20 <210> 81
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 81 ggtggaactg aatgataaag aaatcaggtc 30
<210> 82
<211>
666 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 82
<210> 83
<211>
928 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (750)..(835)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 83
<210> 84
<211> 25
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 84 gcacatcgtc gtacacgctg atgag 25
25 <210> 85
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 85 cgtgcttctc caatttctga gccaag 26
<210> 86
<211> 686 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 86 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 10 <221> modified_base
<222> (743)..(827)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 87 15
<210> 88
<211> 32
20
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 88
gaagaaagta cgttaatatg gttccagggc tc 32
25
<210> 89
<211> 24
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30
<400> 89
gtatgttcct tgcccaggct ctgc 24
<210> 90
35
<211> 595
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 90
<210> 91
<211> 1560
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 91
15 20
<210> 92 <211> 24 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 92 cgtgggaaac acatggattt cgtc 24
25
<210> 93 <211> 24 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 93
ggaacttggg gcatgtcatc tgtc 24
<210> 94
<211> 802
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 94
<210> 95
<211> 1412
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 95
<210> 96
<211> 23
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 96 gcaggttgtt cagattcgct tcg 23
<210> 97 5 <211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 97 10 ggtggtaaaa ggctttgcta atggc 25
<210> 98
<211> 750
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 98
<210> 99
<211> 441
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 99
30 <210> 100
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 100 gattcgccga cgaagacaat agtctc 26
<210> 101
<211> 32 40 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 101
ctttacccat tgtttcctgt tgtatttcaa cc 32
<210> 102
<211> 396
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 102
<210> 103
<211> 2859
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 103
<210> 104
<211> 32
5
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 104
catcttctta gagatattga cgccagaaat gc 32
10
<210> 105
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15
<400> 105
cagacccact gtgtttcttt tgacctg 27
<210> 106
<211> 736
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 106
<210> 107
<211> 2859
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 107
<210> 108
<211> 30 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 108
cgacgccact tttaagtaca ttagcaagac 30 10
<210> 109
<211> 33
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 109 5 ctaagataac tttgatgagt ttaccgtttc cag 33
<210> 110
<211> 740
<212> ADN 10 <213> Diabrotica virgifera
<400> 110
<210> 111
<211> 464
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 20
<220>
<221> modified_base
<222> (313)..(407)
<223> n = a, c, g o t/u 25
<400> 111
30 <210> 112
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 112 ctctggatga tttacgaaaa gcaattagca 30
<210> 113
<211> 27
<212> ADN 40 <213> Diabrotica virgifera
<400> 113 ggtttgtttc tgatggcatt ttacacc 27
45 <210> 114
<211> 336
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 114
<210> 115
<211> 968 10 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 15 <222> (922)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 115
<210> 116
<211> 23
<212> ADN 25 <213> Diabrotica virgifera
<400> 116 caaggcagga aggaggagat tgc 23
30 <210> 117
<211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 117 gatcatcagc agtttttgga agacagatg 29
<210> 118
<211> 690 40 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 118
5 <210> 119
<211> 542
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 119
<210> 120 15 <211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 120 20 cacaaaggaa acgaaagact ggaacttc 28
<210> 121
<211> 28
<212> ADN 25 <213> Diabrotica virgifera
<400> 121 cacaaaggaa acgaaagact ggaacttc 28
30 <210> 122
<211> 542
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 122
<210> 123
<211> 2449
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 123
<210> 124
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 124 5 gatagttgag tgggtgaggt tccaagag 28
<210> 125
<211> 28
<212> ADN 10 <213> Diabrotica virgifera
<400> 125 caagtacacg ctgtcctgta agcagagg 28
15 <210> 126
<211> 742
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
20 <400> 126
<210> 127 25 <211> 2014
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 30 <221> modified_base
<222> (1772)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 127 35
<210> 128
<211> 24
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 128 gtgaacaagg agcaccagga atgg 24
<210> 129
<211> 24
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 129 ccaggcgttc catcgtaacc tctg 24
<210> 130
<211> 838
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 130
<210> 131
<211> 771
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 131
<210> 132
<211> 22
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 132 gcattcctaa cactcgcccg tg 22
20 <210> 133
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 133 ggacacttgt tttctgggca gtgtttg 27
<210> 134
<211> 515 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 134
<210> 135
<211> 1120
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 135
<210> 136
<211> 24
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 136 gtgaccaaag caacgaggtt gtcc 24
20 <210> 137
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 137 gtaggtacaa gtactcactg gtttcggtag g 31
<210> 138
<211> 707 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 138
<210> 139
<211> 940
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 139
<210> 140
<211> 34
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 140 gtcaggttgg tcaattcagt attcagaata gtag 34
20 <210> 141
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 141 ggataaacta cgagtgggcg gaaagag 27
<210> 142
<211> 746 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 142
<210> 143
<211> 1049
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 143
<210> 144
<211> 35
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 144 gtctcagata taagattgaa aagaaagtcc gagag 35
20 <210> 145
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 145 gctttgaatg ctatagtggg agtggttttc 30
<210> 146
<211> 598 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 146
<210> 147
<211> 889
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 147
<210> 148
<211> 26
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 148 gccatacaac tcatccaggt gctaga 26
20 <210> 149
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 149 gtgataggga atagagcagg agccatataa g 31
<210> 150
<211> 792 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 150
<210> 151
<211> 685
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 151
<210> 152
<211> 23
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 152 ggatcatgcc gaagcgattc aac 23
20 <210> 153
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 153 gaatgtaaca gtcgttgatc ggaatcg 27
<210> 154
<211>
588 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 154
<210> 155
<211>
946 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (802)..(849)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 155
<210> 156
<211> 30
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 156 ctgtaagaaa tagggatttg tgggctttag 30
25 <210> 157
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 157 gttggagtga acgtagttga agtcttgc 28
<210> 158
<211> 689 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 158
<210> 159
<211> 658
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 159
<210> 160
<211> 21
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 160 gacttagcgg gctgcgggat g 21
20 <210> 161
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 161 gatacatcct ccaagaactc gttcgtca 28
<210> 162
<211>
580 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 162
<210> 163
<211>
888 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (771)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 163
<210> 164
<211> 33
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 164 gcatgatgtt gaaactgtag aagtagatga ttc 33
25 <210> 165
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 165 gtgtgggtca atatgccttc gttaatg 27
<210> 166
<211>
658 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 166
<210> 167
<211>
886 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (805)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 167
<210> 168
<211> 31
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 168 cgaccaagta caagtaagcg aaatgtcttt g 31
25 <210> 169
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 169 gttctttctt atcagacact cctggcattt g 31
<210> 170
<211> 679 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 170 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400>
171 10
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400>
175 10
<210> 179
<211> 870
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 179
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400>
180 10 gtcctgggga ggctattcaa aaactc 26
15
<210> 172 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20 25
<400> 172 cagaactttt aggaacccag aaggacg 27 <210> 173 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 173 gatccgttcg tcttctattc gctgg 25
30
<210> 174 <211> 776 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 174
15
<210> 176 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20 25
<400> 176 cgtttatcag gcagtagatg gtctcattg 29 <210> 177 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 177 gcattttcct tcagcgttac atactaatcc 30
30
<210> 178 <211> 247 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 178
<210> 181
<211> 29
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 181 caggcttcca attctttcat atcgtcatc 29
20 <210> 182
<211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 182
<210> 183 30 <211> 860
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 35 <221> modified_base
<222> (804)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 183 40
5
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10 15
<400> 184 ctctggaact ggcataatgt atcctatacc tc 32 <210> 185 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 185 ctgttggttg gtgatgtcta caaatctatc g 31
20
<210> 186 <211> 399 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 186
<210> 187
<211> 816
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 187
5
<210> 188 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 188 ccttaggcat gtaagtgtgg ctgtcg 26 <210> 189 <211> 23 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 189 ctcgtaggac aggaggcatg gct 23
20
<210> 190 <211> 717 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 190
<210> 191
<211> 826 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 35 <222> (752)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 191
5
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10
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15
<210> 193 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20 25
<400> 193 gctgtgtttg taaggtcgta ggaagtacca 30 <210> 194 <211> 679 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 194
30 <210> 195
<211> 873
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <220>
<221> modified_base
<222> (709)..(772)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 195
5 10
<210> 196 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 196 cgacgaagtc accgtgggta aattc 25
15
<210> 197 <211> 24 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 197 cgaaggaagc aagtctacgg tcgg 24
25
<210> 198 <211> 677 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 198
<210> 199
<211> 418
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 35
<400> 199
5
<210> 200 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 200 cacagttacc tgtatcgttc cgacatttg 29 <210> 201 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 201 gatcagtacc agtttctcca gtcagcaata c 31
20
<210> 202 <211> 408 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 202
<210> 203
<211> 735
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 203
<210> 204
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 204 ggtactttgg gttgtacttg ggataaaaga c 31
<210> 205 5 <211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 205 10 gctttgacta acgcttctcc cacttca 27
<210> 206
<211> 542
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 206
<210> 207
<211> 686
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 207
30 <210> 208
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 208 gtatggcacc aaaggaaaaa gatgatga 28
<210> 209
<211> 30 40 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 209 cattttggtg atttcatctt caacattttc 30
<210> 210 5 <211> 536
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 210 10
<210> 211
<211> 901 15 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 20 <222> (707)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 211
<210> 212
<211> 27
<212> ADN 30 <213> Diabrotica virgifera
<400> 212 cgtgggctaa tagcattgtg ttatcca 27
35 <210> 213
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 213 gaacattgcg aattgtctgc ttcaaatc 28
<210> 214 5 <211> 496
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 214 10
<210> 215
<211> 916 15 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 20 <222> (870)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 215
<210> 216
<211> 26
<212> ADN 30 <213> Diabrotica virgifera
<400> 216 gctatgattg aaaggcaggc gtctag 26
35 <210> 217
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 217 ggtctcattg aatacgcatt cttgtcc 27
5 <210> 218
<211> 789
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 218
<210> 219 15 <211> 2176
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400>
219 20
<210> 220
<211> 33
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 220 gctctaaact tctgtgacaa ttttgtgcta ctc 33
<210> 221
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 221 gaaatgtcca atgttaatag cccatacagc 30
<210> 222
<211> 992
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 222
<210> 223
<211> 2176
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 223
<210> 224
<211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 224 gtggttcatg gattaaaggt gctgtctac 29
<210> 225
<211> 32
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 225 caccagtgat aacaataact ctgataccag ca 32
<210> 226
<211> 1023
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 226
<210> 227
<211> 1929
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 227
<210> 228
<211> 24
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400>
228 5 gtctttgctt tccgcacgat tagc 24
<210> 229
<211> 26
<212> ADN 10 <213> Diabrotica virgifera
<400> 229 gttgatggca ccagtgtctg tgagac 26
15 <210> 230
<211> 799
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
20 <400> 230
<210> 231 25 <211> 1519
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 231 30
<210> 232
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 232 gtttagatca agaattgaaa atcatcggag c 31
<210> 233
<211> 21
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 233 gcacctccac caccgctctt c 21
<210> 234
<211> 490
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 234
<210> 235
<211> 1850
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 235
10 15
<210> 236 <211> 23 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 236 ctgtcgcaaa ggctggtgga atc 23
20
<210> 237 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 237 ctcttcatgt cactggacac atctttatcg t 31
30
<210> 238 <211> 862 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 238
5 <210> 239
<211> 1188
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 239
<210> 240 15 <211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 240 20 ggtgggtgtt gataatcctg ctgct 25
<210> 241
<211> 25
<212> ADN 25 <213> Diabrotica virgifera
<400> 241 caagagcaac accactgaaa cggag 25
30 <210> 242
<211> 884
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 242
<210> 243
<211> 1188
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 243
<210> 244
<211> 32
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 244 ctcactctga tggtgtaatc actatggaaa tc 32
25 <210> 245
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 245 gtcttctaca aatgctgatt tcaaatggtc t 31
5 <210> 246
<211> 820
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 246
<210> 247 15 <211> 815
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 247 20
<210> 248
<211> 28
25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 248
cttcaacaac agttggagtt cttggagg 28
30
<210> 249
<211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35
<400> 249
ctctggactt cacgatcagc acctg 25
<210> 250
<211> 722
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 250
<210> 251
<211> 1324
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 251
<210> 252
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 252 gaaaacgaag gcgaagctgt aacagaac 28
5
<210> 253 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 253 gctccacccc atttcaccat tgttacac 28
10
<210> 254 <211> 757 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
15
<400> 254
<210> 255
<211> 794
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 255
<210> 256
<211> 28
<212> ADN 30 <213> Diabrotica virgifera
<400> 256 ggaacgtatc ggaagtaatg tgtctgtg 28
35 <210> 257
<211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 257 5 cacaatgttc tgatctgcgt ggtcg 25
<210> 258
<211> 504
<212> ADN 10 <213> Diabrotica virgifera
<400> 258
<210> 259
<211> 1180
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 20
<400> 259
25 <210> 260
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 260 gagccacatc caatgtattc gcaatg 26
<210> 261
<211> 30 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 261 caacggacaa gacttgatgg tctagtatga 30
<210> 262 5 <211> 607
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 262 10
<210> 263
<211> 966
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 263
<210> 264
<211> 30
<212> ADN 25 <213> Diabrotica virgifera
<400> 264 ggtgtagttg ataatctcac aagagccatg 30
30 <210> 265
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 265 cagtttcaga atccgtcacc tttgcg 26
<210> 266
<211> 913
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 266
<210> 267
<211> 846
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 15
<400> 267
20 <210> 268
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 268 gagaagcatg aacttcagaa tcttaacgac c 31
<210> 269
<211>
29 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 269
gatttcgctg atttctactt gacgacgag 29
<210> 270
<211> 595
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 270
<210> 271
<211> 901
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 271
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 274
<210> 275
<211>
512 10 <212> ADN
20 25
<210> 272 <211> 22 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 272 ggaaatggct tgaaacgctt gc 22
30
<210> 273 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 273 ctgaagatga tccagaagcc taccagg 27
<210> 274 <211> 672
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 15 <222> (370)..(452)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 275
<210> 276
<211> 28
<212> ADN 25 <213> Diabrotica virgifera
<400> 276 caaatgaacc aaatgtttca attccaca 28
30 <210> 277
<211> 32
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 277 cgtataaatc cctaaaaagc aacatgaaac ac 32
<210> 278
<211>
470 40 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 278
<210> 279
<211>
978 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (918)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 279
<210> 280
<211> 26
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 280 gaacaggcga gaaaagacct caaagg 26
25 <210> 281
<211> 26
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 281 cacattgaag agcgagtctg gaggag 26
<210> 282
<211> 741 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 282
<210> 283
<211> 876
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 283
<210> 284
<211> 32
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 284 ggttgtgcta ctttcaaaat taactttgta gc 32
20 <210> 285
<211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 285 cgttgacata cttgctaatt tggatggag 29
<210> 286
<211> 645 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 286
<210> 287
<211> 883
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 287
<210> 288
<211> 28
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 288 gttatacggg gaactatgtg ccactcac 28
20 <210> 289
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 289 gactgacaga cacgcaaaat acgatagc 28
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 290
<210> 291
<211> 816
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 291
<210> 292
<211> 28
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 292 gatagtagtc aatcagccag ccatgtgg 28
20 <210> 293
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 293 gcagtacctt ccgctagaaa ttctgga 27
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 294
<210> 295
<211> 1215
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 295
<210> 296
<211> 30
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 296 caagagaaaa tcaaagaaga tgaagggtgg 30
20 <210> 297
<211> 34
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 297 ccaaagttgc cctttcgttt tctgttatta gaat 34
<210> 298
<211> 895
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 298
<210> 299
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 15 <222> (807)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 299
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<211> 23
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<400> 300 caagggaggc gtggacgagg aag 23
30 <210> 301
<211> 32
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 301
ctctcttctt ttcctcttat ccctgtcgtc tc 32 5
<210> 302
<211> 573
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 10
<400> 302
15 <210> 303
<211> 755
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
20 <400> 303
<210> 304 25 <211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 304 30 ggatgctgat tttgaaatgg ttgatacg 28
<210> 305
<211> 29
<212> ADN 35 <213> Diabrotica virgifera
<400> 305 cttcatattt caggcacttg ggattcttg 29
40 <210> 306
<211> 656
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 306
<210> 307
<211> 428
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 307
15 20
<210> 308 <211> 36 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 308 cgaactcaga tattgatgat aacgaaaaag taactg 36
25
<210> 309 <211> 34 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 309 catgtttgcc ttgtggtttt aacagtcata ctac 34
35
<210> 310 <211> 265 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 310
<210> 311
<211> 657
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 311
<210> 312 10 <211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 312 15 gaaagattcg gcgttgcttt gtaaaattg 29
<210> 313
<211> 31
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 313 gaatagaaac cgatagaaga aaccacctgt c 31
25 <210> 314
<211> 401
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 314
<210> 315 35 <211> 822
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 315 40
5
<210> 316 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 316 gatgccaaga ataccgacac atatcagaaa tc 32 <210> 317 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 317 cttgcgtctg gtggtgagat ccttg 25
20
<210> 318 <211> 700 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 318
<210> 319
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 319
<210> 320
<211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 320 cagttgttta agtgtcatgg cgtacttcg 29
<210> 321
<211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 321 ggaggtttcc gtgacatctg tgtgg 25
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<220>
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<400> 324 gacgaaccaa gatgtccaga aggaaagc 28
25 <210> 325
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 325
gttgggacat tccatacagg taaacaatcg 30
<210> 326
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (271)..(358)
<223> n = a, c, g o t/u
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<220>
<221> modified_base
<222> (658)..(683) 25 <223> n = a, c, g o t/u
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 5
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<210> 330
<211> 505
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 330
<210> 331
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 30
<400> 331
35 <210> 332
<211> 29
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
40 <400> 332 gcatctcaac aattaccagt aacgcaagc 29
<210> 333
<211> 32
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
5 <400> 333 gtttctatca atcttcctgt tctcaatcct gg 32
<210> 334
<211> 450 10 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 334
<210> 335
<211> 878
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 335
25 30
<210> 336 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 336 ggtgttaaga caggatgggt ttcggtc 27
35
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40
<400> 337 ggtgttccag ttgatactgc ggtaaaac 28
<210> 338
<211> 560
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 338
<210> 339 10 <211> 831
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 15 <221> modified_base
<222> (807)
<223> n = a, c, g o t/u
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25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 340
gattgttgcc gcattggtgt ttgg 24
30
<210> 341
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35
<400> 341
gacgacaaaa tcacagaatg atggtgc 27
<210> 342
40
<211> 690
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 342
<210> 343
<211> 633
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 343
15 20
<210> 344 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 344 ctaggtggtt cagaacatgg acatgga 27
25
<210> 345 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 345 caggttttaa tgatggtaca atggagcgtg 30
35
<210> 346 <211> 421 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 346
<210> 347
<211> 698 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (14)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 347
<210> 348
<211> 25
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<400> 348 gctcgtgctg gtgtcatcgg agaag 25
25 <210> 349
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 349 gcaactgtgg ctggttcctt gtgtac 26
<210> 350
<211> 641 35 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 350
<210> 351
<211> 977
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 351
<210> 352
<211> 32
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 352 caagattacc ttcagcatcc ttatagcagt tc 32
20 <210> 353
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 353 gtcactaaac tcctcaaacc tgaaggcaag 30
<210> 354
<211> 777 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 354
<210> 355
<211> 1176
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 355
<210> 356
<211> 27
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<400> 356 gcaaatgatg tagcaaaacc gtgtgag 27
20 <210> 357
<211> 27
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 357 ggtattcgtc tggacaagga acacacg 27
<210> 358
<211> 1043 30 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 358
<210> 359
<211> 649
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 359
15 20
<210> 360 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 360 ctattattca gatgtgccac aggtgaaaat tg 32
25
<210> 361 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 361 cagatgtttt tgattgtctc tttgagttcg
30
35
<210> 362 <211> 547 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 362
5 <210> 363
<211> 677
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 363 <210> 367
15
<210> 364 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 364 gttctttact cacggcacct gtcaaca 27
25
<210> 365 <211> 24 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 365 ctaactcgtc cttgtgtggc gacc
24
30
<210> 366 <211> 587 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 366
<211> 882 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (792)..(853)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 367
20
<210> 368 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 368 ggcggataaa gaaaagaagg tcaagaag
28
25
<210> 369 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 369 cacaccacac ttagatgtat ccgaattgat g 31
35
<210> 370 <211> 711 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
40
<220> <221> modified_base <222> (631)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 370
<210> 371
<211> 2918
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 371
<210> 372
<211> 26
5
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 372
ctagtcggat ctctgccagt ggtttc
26
10
<210> 373
<211> 30
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 373 ccttcttcat caacttctat tcccgatttc
30
5
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10
<400> 374
<210> 375
<211> 620
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 375
25
<210> 376 <211> 34 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 376 ctattaatct acaatatgac gccataggca aaag
34
30
<210> 377 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 377
cgaacataca acataaagaa ggagaggaga tg 32
<210> 378
<211> 429
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 378
<210> 379
<211> 846
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 379
20 25
<210> 380 <211> 35 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 380 gtgttattgt tcctcaagca gaatttttat agaag 35
30
<210> 381 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 381 cacattgaac attttgacag gcgaca 26
40
<210> 382 <211> 656 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 382
5 <210> 383
<211> 841
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 383
15
<210> 384 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 384 ggagaataca gagaatcgtt ttggcaac 28
25
<210> 385 <211> 36 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 385 ggactaactc cattaagagg ttctttacat attctg
36
30
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35
<400> 386
<210> 387
<211> 2158
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 387
<210> 388
<211> 33
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
5 10
<400> 388 gtcactctgt tgatatttat tcttgtgctt tgg <210> 389 <211> 35 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 389 ctgtcaggtt gaatggagct agtatctagt aatac 33 35
15
<210> 390 <211> 913 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 390
<210> 391
<211> 2158
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 391
<210> 392
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 392 ccgacttgta atcttcaaaa atgagcac
<210> 393
<211> 33
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 393 gctaacgcat cataatgttt aatacctttc ttc
<210> 394
<211> 1054
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (234) 28
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 394
<210> 395
<211> 910
<212> ADN 10 <213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (833)..(8938) 15 <223> n = a, c, g o t/u
<400> 395 15
20
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25
<400> 396
gagtacacgt caacgtcatc tcagtttgg
29
<210> 397
30
<211> 32
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
<400> 397 gctgatctac gaatgattct acatctctac ct 32
10
<210> 398 <211> 826 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 398
<210> 399
<211> 1057
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 20
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32
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5
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Diabrotica virgifera 20
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Diabrotica virgifera 20
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5
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tgagtctgct cggtatggta aacaaagg
28
10
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5
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10
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26
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29
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10
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40
15
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20
<400> 418
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<213> Diabrotica virgifera
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23
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10
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15
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<400> 431
15
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<400> 432 cctttcgcca tccagtgcag aca
23
20
<210> 433 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
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<213> Diabrotica virgifera
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 435
20
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<400> 436 cacaagatgt ccgtattggg aatggtatc
29
25
<210> 437 <211> 31
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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<400> 439
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<211> 25
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 440
gctcctggcg agagacatcc ttagg
25
5
<210> 441 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 441 gcagacattg accatatcga ctcgtagg <210> 442 <211> 606 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 442 28
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<213> Diabrotica virgifera
25 <220>
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15
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20
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25
<400> 446
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 35 <222> (737)..(851)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 447
5
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10 15
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20
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25
<400> 450
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 451
5
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10 15
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20
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25
<400> 454
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 455
5
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10 15
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20
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25
<400> 458
<210> 459
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 459
5
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10 15
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20
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25
<400> 462
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<211> 660
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 463
5
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10 15
<400> 464 ctaagtaatc tgaagtggct ggacattcac g <210> 465 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 465 gcaatggcaa agagcaaacc aatgtg 26 31
20
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25
<400> 466
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<220>
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<223> n = a, c, g o t/u
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5
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10 15
<400> 468 gatgccattg aaatgaagga acaaca <210> 469 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 469 ctaaccacaa gttgttaatt ctgctgagat cc 26 32
20
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25
<400> 470
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15
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20
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Diabrotica virgifera 30
<400> 475
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<211> 851
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
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26
5
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10
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15
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<400> 478
<400> 479
30
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35
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40
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<400> 481 gaacggattt aggcacatca aacaaac
27
5
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10
<400> 482
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<400> 483
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5
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10
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30
15
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20
<400> 486
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<213> Diabrotica virgifera
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10 15
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20
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25
<400> 490
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<220>
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15
<210> 493 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 493 gttcagcaac ctctcaaaaa tatccaca 28
25
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<400> 494
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15
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26
20
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25
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15
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20 25
<400> 501 ggtggttcgt cactgccatc actac <210> 502 <211> 617 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 502 25
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<400> 503
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10 15
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20
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25
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20 25
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31
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34
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10
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15
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 519
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<211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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10
<210> 521 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
15 20
<400> 521 gcttaacaca tatcgtaggt gtccgtaagt g <210> 522 <211> 993 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 522 31
25 <210> 523
<211> 1253
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 523
5
<210> 524 <211> 22 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10 15
<400> 524 gacgctcgaa ctcgtggctg aa <210> 525 <211> 33 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 525 gctacagtat tacaaatgtc ccaacaatta aac 22 33
20
<210> 526 <211> 845 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 526
<210> 527
<211> 1205
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 527
10
<210> 528 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
15 20
<400> 528 gctgtctatt actgtagcgg agctattgag c <210> 529 <211> 36 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 529 ctatgtagaa tctgcgactt atttaatagg ttcatt 31 36
25
<210> 530 <211> 947 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 530
<210> 531
<211> 1194
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 531
15
<210> 532 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 532 agtccgtaac aacagagaaa aagtttcgt
29
20
<210> 533 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 533 gaggtgggtt aagtaacttc ccttcagg 28
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<211> 1031
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 534
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<400> 535
20
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25
<400> 536 gacaaagtat ttggtggttt cttagtcctc g 31
5
<210> 537 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 537 gttcaggaat taccaaagta agctacagac g 31
10
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15
<400> 538
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<211> 1017
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 539
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 540 caactgtgca gtgtagtaca accctcg
27
5
<210> 541 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10
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15
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<400> 542
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 543
5
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10
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15
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20
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<400> 546
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<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 30
<400> 547
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<211> 34
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<210> 551
<211> 926
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 551
<210> 552
<211> 34
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<210> 555
<211> 904
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 555
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<211> 36
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 559
<210> 560
<211> 24
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
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34
5
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10
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15
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<400> 550
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34
5
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10
<400> 553 ggtatacagc caacttccga gaactacc 28
15
<210> 554 <211> 804 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 554
20 20 20
<400> 556 catagaaact tgatgaagac ttacaagaac aacaag
36
5
<210> 557 <211> 36 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
10
<400> 557 tctcttatca tctttaatat acttgcaccc taatct 36
15
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<400> 558
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24
5
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10
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15
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5
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35
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20
<400> 566
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 568 cgattacgtc atcacgccca gatg 24
5
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10
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15
<400> 570
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<213> Diabrotica virgifera
<400> 571
30
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<400> 572 cgtttacaaa cttgtcacta ctgcgttcg
29
35
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40
<400> 573
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<400> 574
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<220>
<221> modified_base
<222> (785) 20 <223> n = a, c, g o t/u
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35
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40
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<212> ADN
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<220>
<221> modified_base
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<213> Diabrotica virgifera
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25
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30
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35
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<400> 581
cttagtggtt actttggcaa aacactcctg 30
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 582
<210> 583
<211> 802
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 583
20 25
<210> 584 <211> 33 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 584 gtggcgtttt tctatttaca gtatgtgaat gtg 33
30
<210> 585 <211> 35 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 585 gataactaac aggtgtcaaa tacttctttc cagct
35
40
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<400> 586
5 <210> 587
<211> 778
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 587
15
<210> 588 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 588 catgaaagtc agatgacgat aaccaaggag 30
25
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<400> 589 ctaacgtcaa atgagactgg ttcatgtttg
30
30
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35
<400> 590
<210> 591
<211> 765
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 591
15
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27
20
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25
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30
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<400> 594
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<211> 735
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 595
15
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<400> 596 ctcggtgtta gtatattata gcatcaatgt ttcg
34
20
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25
<400> 597 gaaatcggag gtaatagctc atatccatct c 31
30
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<400> 598
<210> 599
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
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27
25
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30
<400> 601 cgattttagt tggagacatt cttcttgaaa tc 32
35
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<400> 602
<210> 603
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 603
15
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<400> 604 ggtatacatt tgcgatatgc cccgtg
26
20
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25
<400> 605 ccaaatatgt tgcctcatcc acagaatg 28
30
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<400> 606
<210> 607
<211> 688
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 607
10 15
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20
<210> 609 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 609 ccagaagtat tattttaacg gcatcggaat ag 32
30
<210> 610 <211> 550 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 610
<210> 611
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<213> Diabrotica virgifera 40
<220>
<221> modified_base
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10
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27
15
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20
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25
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30
<220> <221> modified_base <222> (771) <223> n = a, c, g o t/u
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<210> 615
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (784) (895)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 615
20
<210> 616 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 616 gcaagagttg ttcatccact gcatg
25
25
<210> 617 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 617 gtgcggcaaa ataagactcc atttaggt 28
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 618
10 <210> 619
<211> 967
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 619
20
<210> 620 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 620 gctcagcttg atccagaaaa tctaaaacaa g 31
30
<210> 621 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 621 ctgtggctca tttcgtattt agaacagtta gt
32
<210> 622
<211> 458
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 622
<210> 623
<211> 1376
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
<400> 623
<210> 626
<211> 1148
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 626
<210> 627
<211> 1142
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
20
<210> 624 <211> 26 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 624 ggataacagt catggcgttc gtcacc 26
30
<210> 625 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 625 catgttctga caagtctcgc tccatagg
28
<400> 627
<210> 628
<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
5 10
<400> 628 ccatgctata actgccagat ttgtgaac <210> 629 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 629 gtggttgacc gtttatttca catctagaag c 28 31
15
<210> 630 <211> 593 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 630
<210> 631
<211> 1137 25 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 30 <222> (1128)
<223> n = a, c, g o t/u
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<211> 28
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 632 gtgctcctgt tagcgatccg atttttag 28
<210> 633
<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 633 gcaacttcta tgtcggtaca acttttctca g 31
<210> 634
<211> 781
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (100) (880)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 634
<210> 635
<211> 1142
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 635
10 15
<210> 636 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 636 ggaacgtaca caaaagtttg ggagggt 27
20
<210> 637 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 637 gaacagcaac cagcctgata cgacg
25
30
<210> 638 <211> 582 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 638
<210> 639
<211> 1039
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 5
<220>
<221> modified_base
<222> (748) (896)
<223> n = a, c, g o t/u 10
<400> 639 <210> 643
15
<210> 640 <211> 29 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 640 cgtccgtgat aacaaaatca atcaaagag 29
25
<210> 641 <211> 34 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30 35
<400> 641 ctactgacca gaagtatcta ctacaaagcg tagc <210> 642 <211> 798 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 642 34
<211> 1035 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (790) (857)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 643
20
<210> 644 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 644 gttgtgagat aaggggaaaa gagactggta g
31
25
<210> 645 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 645 gacaaggata agtggcttct atcttgctca
30
<210> 646
<211> 853
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 646
10 <210> 647
<211> 1017
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 647
20
<210> 648 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 648 ggtcccagaa tgtgtgattt agtttgtg 28
30
<210> 649 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 649
gaacacttca tatcttctga cagagccatg 30
<210> 650
<211> 806
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 650
<210> 651
<211> 1013
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<220>
<221> modified_base
<222> (657) 20 <223> n = a, c, g o t/u
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25
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<211> 31
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30
<400> 652
gatattgaac aaaaacaact gctagacgac c
31
5
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10
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15
<400> 654
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<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 25 <222> (929) (949)
<223> n = a, c, g o t/u
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<211> 28
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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10
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<400> 657 tgtatctctc catcacattc tgggacg
27
15
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20
<400> 658
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<210> 660
<211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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10
<210> 661 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
15 20
<400> 661 cgatttgaag tgaagtgaat aacacagttg a <210> 662 <211> 688 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 662 31
25 <210> 663
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 663
<210> 664 35 <211> 28 <212> ADN
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
<400> 664 caatcgcagt tagagtgtaa tccgaaca 28
10
<210> 665 <211> 31 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 665 gtacgttact actcctttta ataaccctgc g
31
15
<210> 666 <211> 848 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 666
<213> Diabrotica virgifera
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5
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10 15
<400> 668 acagttcctc taattggctt agctcacg <210> 669 <211> 25 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 669 cttctcgtgg ctcagcacaa caaac 28 25
20
<210> 670 <211> 949 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
25
<400> 670
<210> 671
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 5 <221> modified_base
<222> (906) (921)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 671 10 <210> 675
15
<210> 672 <211> 28 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20 25
<400> 672 cttcccagaa gattgaatgg ataaatgc <210> 673 <211> 30 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera <400> 673 gaaagtaagg ttcagtgttc atgcaaattc 28 30
30
<210> 674 <211> 733 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
35
<400> 674
<211> 990 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (825) (935)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 675
20
<210> 676 <211> 32 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 676 agaagaaccc ttagccaatg taaaatagtt ca
32
25
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30
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<211> 729
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 678
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
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<211> 25
20
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 680
ggaccatttt gagtgggagg atagc
25
25
<210> 681
<211> 33
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30
<400> 681
ctaattcttc acaaacctac ttagcttctc tcg
33
<210> 682
<211> 862
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 682
10 <210> 683
<211> 978
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <220>
<221> modified_base
<222> (876)
<223> n = a, c, g o t/u
20 <400> 683 <210> 687
25
<210> 684 <211> 27 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
30
<400> 684 agcctcctca aacaaacaga cagagtg 27
<210> 685
<211> 34 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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10
<210> 686 <211> 857 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 686
<211> 977
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (730) (938) 25 <223> n = a, c, g o t/u
<400> 687
<210> 688
<211> 23
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
<400> 688 ggagacgggt cacaggcttc atg 23
10
<210> 689 <211> 34 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 689 caaagtgtag ttagcgagtt ttacctctga tagg
34
15
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20
<400> 690
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220> 30 <221> modified_base
<222> (836) (933)
<223> n = a, c, g o t/u
<400>
691 35
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<213> Diabrotica virgifera
<400>
695 30
<212> ADN <213> Diabrotica virgifera
5
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10
<210> 693 <211> 35 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
<400> 693 gcatcacaga gatcagttta tattctgact tatca
35
15
<210> 694 <211> 697 <212> ADN <213> Diabrotica virgifera
20
<400> 694
<210> 696
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 696
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 697
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<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 698
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<211> 652
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 699
<210> 700
<211> 890
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 700
<210> 701
<211> 888
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (775) 20 <223> n = a, c, g o t/u
<400> 701 <210> 702
<211> 953 5 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base 10 <222> (840) (878)
<223> n = a, c, g o t/u
<400> 702
<210> 703
<211> 905
<212> ADN 20 <213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (849) 25 <223> n = a, c, g o t/u
<400> 703
<210> 704
<211> 426
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 704
<210> 705
<211> 473
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 705
<210> 706
<211> 677
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 706
<210> 707
<211> 250
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 707
<210> 708
<211> 250
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 708
<210> 709
<211> 250
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 709
30 <210> 710
<211> 273
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 710
<210> 711
<211> 278
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 711
<210> 712
<211> 287
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 712
<210> 713
<211> 250
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 713
30 <210> 714
<211> 250
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 714
<210> 715
<211> 250
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 715
<210> 716
<211> 372
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 716
<210> 717
<211> 372
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 20
<400> 717
25 <210> 718
<211> 490
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
30 <400> 718
<210> 719
<211> 560
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 719
5 <210> 720
<211> 372
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 720
<210> 721 15 <211> 372
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 721 20
<210> 722
<211> 1000
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 722
<210> 723
<211> 478
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 723
<210> 724
<211> 584
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 724
<210> 725
<211> 869
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 725
<210> 726
<211> 737
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 726
<210> 727
<211> 867
<212> ADN 15 <213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> modified_base
<222> (771) 20 <223> n = a, c, g o t/u
<400> 727
<210> 728
<211> 802
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 728
<210> 729
<211> 862
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 729
<210> 730
<211> 603
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 730
10 <210> 731
<211> 545
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 731
<210> 732 20 <211> 496
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 732 25
<210> 733
<211> 512
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 733
<210> 734
<211> 669
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 734
<210> 735
<211> 802
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 735
<210> 736
<211> 579
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 736
<210> 737
<211> 640
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 737
<210> 738
<211> 669
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 738
<210> 739
<211> 302
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 739
<210> 740
<211> 838
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 740
<210> 741
<211> 1301
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 741
<210> 742
<211> 824
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 742
<210> 743 10 <211> 704
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 743 15
<210> 744
<211> 971
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 744
<210> 745
<211> 1049
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 745
<210> 746
<211> 547
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 746
<210> 747
<211> 508
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 747
<210> 748
<211> 788
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 15
<400> 748
20 <210> 749
<211> 752
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 749
<210> 750
<211> 436
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 750
<210> 751
<211> 1072
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 751
<210> 752
<211> 864
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 752
<210> 753
<211> 383
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 753
<210> 754
<211> 923
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 20
<400> 754
<210> 755
<211> 1312
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 755
<210> 756
<211> 442
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 756
<210> 757
<211> 404
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 757
<210> 758
<211> 747
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 758
<210> 759
<211> 1285
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 759
<210> 760
<211> 442
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 760
<210> 761
<211> 959
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
<400> 761
20 <210> 762
<211> 429
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 762
<210> 763
<211> 828
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 763
<210> 764
<211> 664
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 764
<210> 765
<211> 434
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 765
<210> 766
<211> 1283
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 766
<210> 767
<211> 685
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 767
<210> 768
<211> 859
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 20
<400> 768
<210> 769
<211> 586
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 769
<210> 770
<211> 563
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 770
<210> 771
<211> 1216
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 771 <212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 772 10
<210> 773
<211> 736
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 773
<210> 774
<211> 718
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 774
<210> 775
<211> 598
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 775
<210> 776
<211> 683
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 776
<210> 777
<211> 321
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 777
<210> 778
<211> 311
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 778
<210> 779
<211> 501
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 779
<210> 780
<211> 370
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 780
<210> 781
<211> 673
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 781
<210> 782
<211> 411
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 782
<210> 783
<211> 553
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 30
20 25
<400> 783
<210> 784
<211> 902
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 784
<210> 785
<211> 1026
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 785
<210> 786
<211> 469
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 786
10 <210> 787
<211> 1159
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 787
<210> 788
<211> 1261
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 788
<210> 789
<211> 905
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 789
<210> 790
<211> 873
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 790
<210> 791
<211> 877
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 791
<210> 792
<211> 375
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 792
<210> 793
<211> 547
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 793
<210> 794
<211> 334
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 794
<210> 795
<211> 630
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 795
<210> 796
<211> 1152
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 796
<210> 797
<211> 988
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 797
<210> 798
<211> 208
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 798
<210> 799
<211> 1326
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 799
<210> 800
<211> 1034
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
20 20
<400> 800
<210> 801
<211> 721
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 801
5 <210> 802
<211> 361
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
10 <400> 802
<210> 803 15 <211> 183
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 803 20
<210> 804
<211> 372 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C4_Dv49_CG8055; actividad de vehículo, de unión 30 potencial: ortólogo de CG8055
<400> 804 <210> 805
<211> 372 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético 10
<400> 805
15 <210> 806
<211> 490
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C6 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv26, Dv49, Dv23, Dv20, Dv13, Dv22, Dv18
<400> 806 25
<210> 807
<211> 560 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético 35
<400> 807 <210> 808
<211> 372 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C8; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: 10 ortólogo de CG9261º
<400> 808
<210> 809
<211> 372
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C9; ATPasa de intercambio de potasio/sodio potencial: ortólogo de CG9261
25 <400> 809
<210> 810 30 <211> 1000
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
35 <223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C10 de genes con el mismo/diferente modo de acción potencial, criterio de ~50 % GC
<400> 810 <210> 811
<211> 478 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de 10 ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20.
<400> 811
<210> 812
<211> 869
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C14 de dianas génicas activas en varios organismos diferentes, criterio de ~50 % GC
25 <400> 812 <210> 813
<211> 2694 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: xx 10
<400> 813 <210> 814
<211> 622 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: xx 10
<400> 814 <210> 815
<211> 670 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: xx 10
<400> 815
15 <210> 816
<211> 871
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: xx
<400> 816
<210> 817
<211> 2410
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: xx
<400> 817
10
15 <210> 818
<211> 988
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<221> modified_base
<222> (884)..(965)
<223> n = a, c, g o t/u
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión de ARNbc pMON98501 Dv49
<400> 818
<210> 819 10 <211> 3001
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión de ARNbc pMON98502 Dv49
<400> 819 <210> 820
<211> 2719 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión de ARNbc pMON98503 Dv49 10
<400> 820
5 <210> 821
<211> 2367
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión de ARNbc de concatémero pMON98504 Dv49
<400> 821
5
<210> 822 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 822 ccaagccctc aaaaagaaga aacgattgga aaagacccaa ctaca 45
15
<210> 823 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 823
acgacatagc caacgaaatc acaaacgcta ttagcaatcc tgtcggattc
50
5
<210> 824 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 824 tgtgtctgct gatgcagttg ctactaaacc aatcaaacca gcagct
46
15
<210> 825 <211> 113 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 825
<210> 826
<211> 153
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 826 35
<210> 827
<211> 183
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 827
<210> 828
<211> 95
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
55 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 828
<210> 829
<211> 96
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 829
<210> 830
<211> 266
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 830
<210> 831
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 831
<210> 832
<211> 141
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 832
<210> 833
<211> 449 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético 10
<400> 833
15 <210> 834
<211> 590
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético
<400> 834
<210> 835
<211> 657
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 835
<210> 836
<211> 1251
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 836
<210> 837 15 <211> 669
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 837 20
<210> 838
<211> 793
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 838
<210> 839
<211> 767
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 839
<210> 840
<211> 588
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 840
<210> 841
<211> 1098
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 841
<210> 842
<211> 718
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 20
<400> 842
<210> 843
<211> 842
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 843
<210> 844
<211> 679
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
<400> 844
20 <210> 845
<211> 725
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 845
<210> 846
<211> 864
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 846
<210> 847
<211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 847
<210> 848
<211> 210
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 25
<400> 848
<210> 849
<211> 280
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 849
<210> 850
<211> 350
<212> ADN
<213>
Diabrotica virgifera 15
<400> 850
20 <210> 851
<211> 420
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
25 <400> 851
<210> 852 30 <211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 852 35
<210> 853
<211> 210
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 853
<210> 854
<211> 280
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 854
<210> 855
<211> 350
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 855
<210> 856
<211> 420
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 25
<400> 856
30 <210> 857
<211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
35 <400> 857
<210> 858
<211> 210
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 858
<210> 859
<211> 280
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 859
<210> 860
<211> 350
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 860
<210> 861
<211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera 30
<400> 861
35 <210> 862
<211> 210
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
40 <400> 862
<210> 863
<211> 280
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 863
10 <210> 864
<211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
15 <400> 864
<210> 865 20 <211> 210
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 865 25
<210> 866
<211> 140
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 866
<210> 867
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 867
<210> 868
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 868
<210> 869
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 869
<210> 870
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 870
<210> 871
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 871
<210> 872
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 872
<210> 873
<211> 70
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 873
<210> 874
<211> 1358
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera
<400> 874
<210> 875 10 <211> 2714
<212> ADN
<213> Diabrotica barberi
<400> 875 15
<210> 876
<211> 2669
<212> ADN
<213> Diabrotica balteata
<400> 876
<210> 877
<211> 2701
<212> ADN
<213> Diabrotica undecimpunctata howardii
<400> 877
<210> 878
<211> 2714
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera zeae
<400> 878
<210> 879
<211> 2714
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera virgifera
<400> 879
<210> 880
<211> 669
<212> ADN
<213> Epilachna varivestis
<400> 880
<210> 881
<211> 1033
<212> ADN
<213> Leptinotarsa decemlineata
<400> 881
<210> 882
<211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica balteata
<400> 882
<210> 883
<211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica barberi
<400> 883
<210> 884 10 <211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica undecimpunctata howardii
<400> 884 15
<210> 885
<211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera zeae
<400> 885
<210> 886
<211> 601
<212> ADN
<213> Diabrotica virgifera virgifera
<400> 886
<210> 887
<211> 145 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de 10 ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv23-Dv13
<400> 887
<210> 888
<211> 222
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de 23-Dv13-Dv26
25 <400> 888
<210> 889 30 <211> 275
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
35 <223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18
<400> 889
<210> 890
<211> 338
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de
~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49 10
<400> 890
15 <210> 891
<211> 418
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22
<400> 891 25
<210> 892
<211> 152 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de 35 ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv13-Dv26
<400> 892
<210> 893
<211> 205
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 45
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv13-Dv26-Dv18
<400> 893
5 <210> 894
<211> 268
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv13-Dv26-Dv18-Dv49
<400> 894 15
<210> 895
<211> 348 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de 25 ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22
<400> 895
<210> 896
<211> 408
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv13-Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20
40 <400> 896 <210> 897
<211> 130
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv26-Dv18
<400> 897
<210> 898
<211> 193
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv26-Dv18-Dv49
<400> 898
<210> 899
<211> 273
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv26-Dv18-Dv49-Dv22
<400> 899
<210> 900
<211> 333
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
45 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv26-Dv18-Dv49-Dv22-Dv20
<400> 900 <210> 901
<211> 116 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de 10 ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv18-Dv49
<400> 901
<210> 902
<211> 196
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv18-Dv49-Dv22
25 <400> 902
<210> 903 30 <211> 256
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
35 <223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv18-Dv49-Dv22-Dv20
<400> 903
<210> 904
<211> 143
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv49-Dv22
<400> 904
<210> 905
<211> 203
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 10
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv49-Dv22-Dv20
15 <400> 905
<210> 906 20 <211> 140
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
25 <223> Descripción de la secuencia artificial: concatémero C12 de dianas de WCR altamente eficaces, criterio de ~50 % GC, que consiste en segmentos en orden 5’-3’ de Dv22-Dv20
<400> 906

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polinucleótido seleccionado de:
    (a)
    un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704;
    (b)
    un polinucleótido que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704 en condiciones de lavado de SSC 5X, formamida 50 % y 42 ºC durante 10 minutos;
    (c)
    un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704;
    (d)
    un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 704; y
    (e)
    un complemento de la secuencia de (a), (b), (c) o (d), en el que dicho polinucleótido está unido operativamente con un promotor heterólogo; y
    en el que la ingesta por una plaga de planta de coleópteros de una secuencia ribonucleotídica bicatenaria que comprende al menos una cadena que es complementaria de dicho polinucleótido o dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicha plaga.
  2. 2.
    El polinucleótido de la reivindicación 1, que se define como comprendido en un vector de transformación de plantas.
  3. 3.
    Una secuencia ribonucleotídica bicatenaria producida a partir de la expresión de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la ingesta de dicha secuencia ribonucleotídica por una plaga de plantas de coleópteros inhibe el crecimiento de dicha plaga.
  4. 4.
    La secuencia ribonucleotídica bicatenaria de la reivindicación 3,
    (i)
    definida como producida por la preparación de una secuencia polinucleotídica recombinante que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia polinucleotídica, en la que la primera secuencia polinucleotídica comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en la que la tercera secuencia polinucleotídica está ligada a la primera secuencia polinucleotídica por la segunda secuencia polinucleotídica, y en la que la tercera secuencia polinucleotídica es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia polinucleotídica, de modo que las primera y tercera secuencias polinucleotídicas hibridan cuando se transcriben a un ácido ribonucleótido para formar la molécula ribonucleotídica bicatenaria estabilizada por la segunda secuencia ribonucleotídica ligada; o
    (ii)
    en la que la ingesta de la secuencia polinucleotídica por la plaga inhibe la expresión de una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de dicha secuencia polinucleotídica.
  5. 5.
    Una célula transformada con el polinucleótido de la reivindicación 1.
  6. 6.
    La célula de la reivindicación 5, definida como
    (i)
    una célula procariota; o
    (ii)
    una célula eucariota; o
    (iii) una célula vegetal o bacteriana.
  7. 7.
    Una planta transformada con el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, o una semilla de la misma que comprende el polinucleótido.
  8. 8.
    La planta de la reivindicación 7, en la que dicho polinucleótido se expresa en una célula de la planta como una secuencia ribonucleotídica bicatenaria y la ingesta de una cantidad inhibidora de plagas de insectos de dicha secuencia ribonucleotídica bicatenaria en una dieta inhibe que la plaga se siga alimentando de dicha dieta, preferentemente
    (i)
    la plaga de insecto se selecciona de Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica virgifera zea, Diabrotica balteata, Diabrotica barberi, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa, y Diabrotica undecimpunctata; o
    (ii)
    la ingesta de la cantidad inhibidora de plaga de insectos de la secuencia ribonucleotídica bicatenaria atrofia el crecimiento de la plaga.
  9. 9.
    Un producto de consumo producido a partir de una planta de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho producto de consumo comprende una cantidad detectable de un ribonucleótido expresado a partir de polinucleótido de la reivindicación 1.
  10. 10.
    Un procedimiento para controlar la infestación por plaga de coleópteros que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros un agente que comprende una primera secuencia polinucleotídica que actúa tras la ingesta por la plaga para inhibir una función biológica dentro de dicha plaga, en el que dicha secuencia polinucleotídica muestra de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos a lo largo de al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de dicha plaga y se hibrida con una segunda secuencia polinucleotídica que es complementaria de dicha primera secuencia polinucleotídica, y en el que dicha secuencia codificante derivada de
    dicha plaga es SEQ ID NO: 70 o el complemento de la misma.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha plaga de coleóptero es una Diabrotica spp., que preferentemente se selecciona de Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica virgifera zea, Diabrotica balteata, Diabrotica barberi, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa, y Diabrotica undecimpunctata.
  12. 12.
    Un procedimiento para controlar una infestación por plaga de coleópteros que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros una célula vegetal que expresa una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras la ingesta por la plaga para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicha plaga y da como resultado alimentación reducida de dicha dieta en relación con una dieta que carece de la célula vegetal.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que
    (i)
    la plaga muestra crecimiento reducido tras la ingesta de la célula; o
    (ii)
    la célula vegetal comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un agente pesticida seleccionado de una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporus y una proteína insecticida de Bacillus sphaericus, preferentemente dicha proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona de una Cry1, una Cry3, una TIC851, una CryET70, una Cry22, una TIC901, una TIC201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria CryET33 y CryET34, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una combinación de las proteínas insecticidas ET29 y ET37 con las proteínas insecticidas TIC810 o TIC812, y una proteína insecticida binaria PS149B1; o
    (iii) la secuencia diana codifica una proteína, cuya función predicha se selecciona de formación de músculo, formación de hormona juvenil, regulación de hormona juvenil, regulación y transporte de iones, síntesis de enzimas digestivas, mantenimiento de potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación, desarrollo y diferenciación de patas, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración y apoptosis; o
    (iv)
    dicha plaga de coleópteros es una Diabrotica spp., que preferentemente se selecciona de Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica virgifera zea, Diabrotica balteata, Diabrotica barberi, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa, y Diabrotica undecimpunctata; o
    (v)
    el polinucleótido actúa tras la ingesta por la plaga para suprimir un gen que realiza una función esencial para la supervivencia del insecto, seleccionándose dicha función de alimentación por la plaga, apoptosis de células de la plaga, diferenciación y desarrollo celular, capacidad o deseo de reproducción sexual, formación muscular, fasciculación muscular, contracción muscular, formación de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, mantenimiento de potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, transición de estadio larvario, pupación, emergencia de la pupación, división celular, metabolismo energético, respiración, y formación de estructura citoesquelética.
  14. 14.
    Un procedimiento para mejorar el rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plaga de insectos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    a) introducir un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 en dicha planta de cultivo, b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de rendimiento debida a infestación por plagas.
  15. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que
    (i)
    la expresión del polinucleótido produce una molécula de ARN que suprime al menos un primer gen diana en una plaga de insectos que ha ingerido una parte de dicha planta de cultivo, en el que el gen diana realiza al menos una función esencial seleccionada de alimentación por la plaga, viabilidad de la plaga, apoptosis de células de plaga, diferenciación y desarrollo de la plaga o cualquier célula de la plaga, reproducción sexual de la plaga, formación de músculo, fasciculación muscular, contracción muscular, formación y/o reducción de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de espermatozoides, síntesis de feromonas, sensibilización de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, transición de estadio larvario, pupación, emergencia de la pupación, división celular, metabolismo energético, respiración, síntesis y mantenimiento de la estructura citoesquelética, metabolismo de nucleótidos, metabolismo de nitrógeno, uso de agua, retención de agua y
    percepción sensorial; o
    (ii)
    la plaga de insectos es una plaga de crisomélido del maíz seleccionado de Diabrotica undecimpunctata howardi (Crisomélido del Maíz Meridional (SCR)), Diabrotica virgifera virgifera (Crisomélido del Maíz Occidental (WCR)), Diabrotica barberi (Crisomélido del Maíz Septentrional (NCR)), Diabrotica virgifera zea (Crisomélido del
    5 Maíz Mejicano (MCR)), Diabrotica balteata (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)), Diabrotica viridula (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)) y Diabrotica speciosa (Crisomélido del Maíz Brasileño (BZR)).
  16. 16. Un procedimiento para mejorar la tolerancia a sequía de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infestación por plagas de insectos, comprendiendo dicho procedimientos las etapas de
    a) introducir un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 en dicha planta de cultivo,
    10 b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión del polinucleótido inhibe la alimentación por plagas de insectos y pérdida de tolerancia a la sequía debida a infestación por plagas.
  17. 17. Un procedimiento para producir un producto de consumo, alimento o pienso que comprende obtener una planta
    de acuerdo con la reivindicación 7 o una parte de la misma, y preparar un producto de consumo, alimento o pienso a 15 partir de la planta o parte de la misma.
  18. 18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el alimento o pienso se define como aceite, harina gruesa, proteína, almidón, harina o silaje.
    327 328
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