CN103053480B - 一种柑橘全爪螨若螨的rna干扰方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，按照如下步骤完成：(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养；(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理；(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况，对RNA干扰效果进行评价。该方法设计新颖、合理，建立的RNA干扰导致柑橘全爪螨无法完成正常蜕皮而死亡，从而达到防治柑橘全爪螨的目的，有利于减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的应用前景。

Description

一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法

技术领域

本发明涉及一种柑橘领域，具体地说，特别涉及一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法。

背景技术

柑橘全爪螨是一种世界性柑橘害螨，对柑橘产量和品质影响较大。目前化学防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施，化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗性药，害螨抗药性直接制约了农药的使用年限、范围及防治效果。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种非常具有前途的控制害虫的新方法，可为生产上更好地防治影响粮食及经济作物产量的害虫提供新的途径，该技术是传统病虫害防治技术的新突破，具有广阔的应用前景，目前许多重要害虫特异的RNA干扰技术已经构建，但用于柑橘全爪螨特别是其若螨的RNA干扰技术还没建立。因此，有必要针对柑橘全爪螨建立相应的RNA干扰技术，进而为其防治提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，基于柑橘全爪螨几丁质基因，合成特异的dsRNA，从而将柑橘全爪螨几丁质酶基因沉默，使柑橘全爪螨无法完成正常的生长发育，最终实现柑橘全爪螨的控制。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，其特征在于：按照如下步骤完成：

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养：

在培养皿内制成梯级滤纸隔离台，取洗净的柑橘叶片，将叶面向下置于滤纸隔离台上，用湿脱脂棉条压住叶沿，在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨，将雌成螨产的卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为25±1℃，相对湿度为70％-80％，光周期为L∶D=(14∶10)h连续培养5-7天，得到柑橘全爪螨若螨；

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理：

将孵化的若螨挑在新的叶片上，在处理好的叶片上滴一滴dsRNA溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出，将浸过液的若螨置于恒温光照培养箱中控制温度为25±1℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培养；其中步骤(2)所用dsRNA溶液为shRNA1溶液，其中shRNA1的碱基序列为：shRNA1：5′-GATCGTCTGTTATTTCACC-3′    SEQ NO 1shRNA1溶液浓度为2.0-6.0μg/ml；

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。

采用上述技术方案，本发明通过处理柑橘全爪螨若螨，将柑橘全爪螨若螨与dsRNA接触后，观察RNAi对柑橘全爪螨若螨的蜕皮情况，从而评价RNA干扰对柑橘全爪螨的作用效果。该方法为柑橘全爪螨的控制提供了新的策略，同时也为减少化学农药使用提供了新的措施，因而具有极其广阔的应用前景。

在上述技术方案中，为了更好的培育柑橘全爪螨，所述步骤(1)中，梯级滤纸隔离台通过取直径为9cm的培养皿铺上0.7cm厚的海绵，海绵上铺直径略小于海绵的滤纸，加水至滤纸边缘，制成梯级水隔离台。

在上述技术方案中，为了柑橘全爪螨提供够足够的食物，所述步骤(1)中，柑橘叶片为刚采摘完整、生长旺盛的柑橘叶片。

在上述技术方案中，为了RNA干扰效果更好，所述步骤(2)中，dsRNA是通过几丁质酶和绿色荧光蛋白的cDNA序列，设计合成双链dsRNA。

有益效果：该方法设计新颖、合理，本方法将柑橘全爪螨的生长发育相关基因沉默，使该螨无法完成正常的生长发育，达到防治的效果，进而对柑橘全爪螨的控制发挥重要作用，同时减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨，所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h，连续培养5天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将若螨挑在新的叶片上，通过在柑橘全爪螨转录组数据中发现几丁质酶基因上存在SNP(single nucleotide polymorphism)位点，SNP即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)是由于单个核苷酸的改变而导致的核酸序列多态性，经真实性检测发现确实存在，为检测几丁质酶基因与抗性之间的关系，以几丁质酶为靶标基因进行RNA干扰检测该基因沉默后对柑橘全爪螨生命活动的影响，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列，设计合成dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为2.0μg/ml的dsRNAshRNA1溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。将处理好的若螨置于恒温光照培养箱中，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h，培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片上放置100头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培养，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部发育完全为止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为35％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出现致死性表型。

实施例2

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨，所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为26℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h连续培养7天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将若螨挑在新的叶片上，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列，设计合成dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为6.0μg/ml的dsRNAshRNA1溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。将处理好的若螨置于恒温光照培养箱中，控制温度为26℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片上放置100头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培养，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部发育完全为止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为25％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出现致死性表型。

实施例3

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨，所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为24℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h连续培养6天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将孵化的若螨挑在新的叶片上，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列，设计合成dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为4.0μg/ml的dsRNAshRNA1溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。将处理好的若螨置于恒温光照培养箱中，控制温度为24℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片上放置100头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培养，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部发育完全为止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为30％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出现致死性表型。

序列表

<120>一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法

<160> 2

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223> shRNA1

<400>GATCGTCTGTTATTTCACC

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223> shRNA2

<400>GTTTCTTGAAACGTGTCGC

Claims (4)

1.一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，其特征在于：按照如下步骤完成： 

（1）、柑橘全爪螨若螨的饲养 

在培养皿内制成梯级滤纸隔离台，取洗净的柑橘叶片，将叶面向下置于滤纸隔离台上，用湿脱脂棉条压住叶沿，在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨，所述雌成螨产的卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为25±1℃，相对湿度为70%-80%，光周期为L：D=（14：10）h连续培养5-7天，得到柑橘全爪螨若螨； 

（2）、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理 

将孵化的若螨挑在新的叶片上，在处理好的叶片上滴一滴dsRNA溶液，用0号毛笔将幼螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出，将浸过液的若螨置于恒温光照培养箱中控制温度为25±1℃，相对湿度为70%-80%，光周期L：D=（14：10）h培养24h。所用dsRNA溶液为shRNA1溶液，其中shRNA1的碱基序列为： 

shRNA1：5′-GATCGTCTGTTATTTCACC-3′    SEQ NO1 

shRNA1溶液浓度为2.0-6.0μg/ml； 

（3）、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况 

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA干扰效果。 

2.根据权利要求1所述的一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，其 特征在于：所述步骤(1)中，梯级滤纸隔离台通过取直径为9cm的培养皿铺上0.7cm厚的海绵,海绵上铺直径略小于海绵的滤纸，加水至滤纸边缘，制成梯级水隔离台。 

3.根据权利要求1所述的一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，其特征在于：所述步骤(1)中，柑橘叶片为刚采摘完整、生长旺盛的柑橘叶片。 

4.根据权利要求1所述的一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，其特征在于：所述步骤(2)中，dsRNA是通过几丁质酶和绿色荧光蛋白的cDNA序列，设计合成的双链RNA。