CN102524073A - 一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种添加次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；本发明利用在植物组织培养中用次氯酸钠替代高温灭菌，能够避免高温灭菌对植物组织培养基的不利影响，提高植物组织培养基的生产效率；因为本发明是在常规植物组织培养基中添加次氯酸钠，无需进行该培养基的高温灭菌，有利于植物生长；本发明的pH值为5.8-6.0，有利于协同次氯酸钠发挥灭菌作用，灭菌效果好，能避免组织培养植物体的污染；本发明操作方法简单，灭菌时间短，能够提高培养基的生产效率、降低培养成本，为大规模开展植物组织培养提供高效的培养方法。

Description

一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法

技术领域

本发明属于用植物组织培养领域，特别涉及一种添加次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠。       

背景技术

植物组织培养技术起源于20世纪，至今有100多年的历史。植物组织培养技术已成为目前最常用的生物技术手段之一。植物组织培养技术是众多技术的集成，其中，灭菌技术是组织培养过程中的关键技术之一。灭菌的方法包括高温灭菌、过滤除菌、乙醇灭菌等，其中，高温灭菌又包括高温蒸气灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。目前，植物组织培养的培养基灭菌方法均是采用高压蒸汽灭菌方法，灭菌温度121℃灭菌时间20 min。这种方法优点有灭菌彻底、不易污染。但是，高压蒸汽灭菌所存在着以下缺点：设备较贵；消耗能源多；灭菌时间长；在高温蒸汽灭菌过程中，培养基内会发生一些化学反应，培养基的成分会伴随着发生一些变化，如在121℃，20 min条件下，59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏；培养基的灭菌数量有限，生产成本较高等。由于上述缺点，尽管组织培养技术已有将近百年的历史，技术也相当成熟，迄今为止，主要应用于科研或小规模的生产中。

为寻找方便、快捷、可靠和低成本的灭菌方法，前人进行了较多的研究。但是，大部分是微生物培养基的灭菌方法改进的研究报道；而关于植物组织培养的培养基的灭菌方法改进的研究报道较少。崔刚等通过抑生素的应用，不用高压灭菌和超净工作台接种，在不影响组培效果的情况下，能够将污染率控制在10%以下的可接受范围内。梁霞等利用家用微波炉可代替高压蒸汽灭菌，无论固体培养基还是液体培养基，频率为2450 MHz、功率为l200 W的微波炉，在80%以上的功率，灭菌10 min，便可实现很好的灭菌效果。但是，以上的方法中均存在灭菌效果不理想、灭菌药剂影响植物正常生长等问题。

次氯酸钠溶液是一种用途极为广泛的广谱杀菌灭藻剂和漂白剂。其不仅具有很强的消杀作用，而且其易分解、无残留、对人体无毒无害的情况是一般杀菌剂所无法比拟的。广泛用于污水处理、自来水消毒杀菌、游泳池杀菌消毒、养殖业畜禽舍的消毒杀菌和酒店、饭店、医院、食品与肉类加工企业及公共设施环境的消毒等。中国专利申请“一种植物组织培养中污染防止方法”（申请号：201010142886.5，申请公布号：CN101884301.A）中，公开了一种植物组织培养中防止细菌或真菌污染的方法，该方法的培养基中加入乙蒜素、链土霉素、氨基寡糖素水机、ClO2、过氧乙酸、次氯酸钠、三氯异氰尿酸中的一种或几种。该方法虽然将次氯酸钠用于植物组织培养基的灭菌，但该植物组织培养基仍然需要经过高温灭菌处理后才可以用于植物组织培养，无法避免高温灭菌处理，尤其是高压蒸汽灭菌的缺点。

所以，目前的科研和生产中需要一种在培养基的配制过程中添加次氯酸钠来替代高压蒸汽灭菌、提高培养基的生产效率、降低培养成本、为大规模开展植物组织培养提供高效的植物组织培养方法。

发明内容

本发明提供一种添加次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；本发明利在植物组织培养中用次氯酸钠替代高温灭菌，能够避免高温灭菌对植物组织培养基的不利影响，提高植物组织培养基的生产效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；

优选地，所述的植物组织培养基中，所述的常规培养基为MS基本培养基；

优选地，所述的植物组织培养基中，所述的常规培养基为以MS基本培养基为基础，添加6-苄氨基嘌呤0.6 mg/L，萘乙酸0.2 mg/L；

优选地，所述的植物组织培养基用于培养“神马”菊花、兰州食用百合。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养方法，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；该方法包括以下步骤：

A、按照上述含量取所述的常规培养基的成分、次氯酸钠，配制植物组织培养基母液；

B、将所述的植物组织培养基母液在常压下加热至沸腾，并保持沸腾状态8-10分钟，得到加热的植物组织培养基母液；

C、待所述的加热的植物组织培养基母液冷却至50-60℃时，调节pH值为5.8-6.0，得到调节pH值的植物组织培养基母液；

D、将调节pH值的植物组织培养基母液在超净工作台中分装至培养瓶，得到所述的植物组织培养基； 

Ⅱ、植物组织培养：

将植物外植体接种于所述的植物组织培养基中，进行植物组织培养。

优选地，Ⅰ-D步骤中所述的培养瓶在分装前经过浓度为100-400mg/L的次氯酸钠水溶液浸泡处理，时间为3-8min；

优选地，Ⅱ步骤的接种处理在开放的工作台上进行，无需在超净工作台中进行。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、因为本发明是在常规植物组织培养基中添加次氯酸钠，无需进行该培养基的高温灭菌，所以本发明能够避免高温灭菌对该培养基中营养成分的不利影响，有利于植物生长。

2、因为本发明的pH值为5.8-6.0，有利于协同次氯酸钠发挥灭菌作用，所以本发明的灭菌效果好，能避免组织培养植物体的污染。

3、因为本发明操作方法简单，灭菌时间短，所以本发明能够提高培养基的生产效率、降低培养成本、为大规模开展植物组织培养提供高效的植物组织培养方法。

附图说明：

图1为实施例1中添加不同浓度的次氯酸钠对植物组织培养基灭菌效果影响的相片。

 

图2为实施例1中添加不同浓度的次氯酸钠对菊花快繁生长的影响的相片。

图3为实施例2中添加20mg/L次氯酸钠对兰州食用百合芽诱导生长的影响的相片。

 

具体实施方式：

实施例1：

本实施例为一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及其培养方法，应用于“神马”菊花的快速繁殖。

一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；

所述的植物组织培养基中，所述的常规培养基为MS基本培养基；所述的MS基本培养基含有的原料如下表所示，所述的MS基本培养基由去离子水配制而成：

 该方法包括以下步骤：

Ⅰ、制备植物组织培养基：

A、按照上述含量取所述的常规培养基的成分、次氯酸钠，配制植物组织培养基母液；

B、将所述的植物组织培养基母液在常压下加热至沸腾，并保持沸腾状态8-10分钟，得到加热的植物组织培养基母液；

C、待所述的加热的植物组织培养基母液冷却至50-60℃时，加入当量浓度为0.1 N的氢氧化钠溶液调节pH值为5.8-6.0，得到调节pH值的植物组织培养基母液；

D、将调节pH值的植物组织培养基母液分装至培养瓶，得到所述的植物组织培养基；所述的分装采用新开封的组培瓶封口膜封口；所述的培养瓶为150ml或200ml的三角瓶；

所述的培养瓶在分装前经过浓度为200mg/L的次氯酸钠水溶液浸泡处理5 min，所述的分装在开放的实验室工作台上进行，无需在超净工作台中进行；

所述的培养瓶也可以先用组培瓶封口膜封口，再经过高压蒸汽灭菌处理；所述的蒸汽灭菌处理的温度为120-130℃，优选为120℃，时间为20-30分钟，优选为20分钟，压力为102-105kPa，优选为102.9kPa，所述的分装在超净工作台中进行。

Ⅱ、植物组织培养：

将植物外植体接种于所述的植物组织培养基中，进行植物组织培养。

所述的外植体为“神马”菊花无菌苗的带腋芽的茎段；

所述的“神马”菊花为常规市售；

所述的外植体的制备方式如下：

选取田间“神马”菊花的幼嫩顶芽，在用自来水配制的重量百分比10%洗衣服溶液中浸泡5～10分钟，在自来水下冲洗干净后，在超净工作台上进行表面消毒；该表面消毒为用75%酒精浸泡振荡1分钟，接着无菌水冲洗1～2次，再用15%次氯酸钠溶液消毒10～15分钟，无菌水冲洗3～4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于诱导培养基（MS基本培养基的基础上添加6-BA 1.0mg/L、NAA0.1 mg/L）上诱导腋芽萌发成为不定芽； 

所述的不定芽长至2cm时切下转入生根培养基（MS基本培养基的基础上添加NAA 0.1mg/L），在组织培间培养，获得无菌苗，所述的生根培养基的灭菌方法为常规高压蒸汽灭菌；从该无菌苗切取0.5cm带腋芽的茎段作为所述的外植体。

所述的接种为超净工作台中的无菌操作；

所述的植物组织培养在组织培养间中进行，培养条件为：培养温度为25 ℃ ，光照度为1200 勒克斯（Lx），光照时间为16 小时/天，湿度为70～80％。

选取按照本实施例中方法配制的、分别添加次氯酸钠10 mg/L、20 mg/L、40mg/L的植物组织培养基作为试验组，将不添加次氯酸钠、经过常规高压蒸汽灭菌植物组织培养基作为对照组。

本实施例的检测结果如下：

1、步骤I的检测结果：添加不同浓度的次氯酸钠对植物组织培养基灭菌效果的影响。如图1所示，对照组的培养基配制后的第3天时已有脓状的菌斑出现，培养基配制后的第1周后有毛状的菌丝出现（A）；培养基配制后的第60天时，试验组的3种添加不同浓度的次氯酸钠的培养基未发现污染现象（B：10 mg/L ，C：20 mg/L ，D：40 mg/L）。  

2、步骤Ⅱ的检测结果：添加不同浓度的次氯酸钠对菊花快繁生长的影响。

接种后培养过程中，对照组和试验组的培养基未发现差异；对照组、10 mg/L和20 mg/L处理的培养基上，接种后的第7天芽点开始生长；40 mg/L处理的培养基上，接种后的第10天芽点开始生长；在30天的培养过程，对照组（A）和试验组（A：10 mg/L ，B：20 mg/L ，C：40 mg/L）的未发现污染。接种后第30天时，各组的菊花小植株生长状态如图2，生长参数见下表。

 

处理	根数	根长/cm	株高/cm	叶片数
					CK	5.8	4.8	6.2	6.3
10 mg/L	6.2	6.3	6.5	6.3
					20 mg/L	6.2	6.3	6.8	6.5
40 mg/L	5.8	5.5	5.8	6.3

本实施例中，在常规植物组织培养基中添加次氯酸钠，无需进行该培养基的高温灭菌，能够避免高温灭菌对该培养基中营养成分的不利影响，有利于植物生长。次氯酸钠会影响植物对赤霉素(GA)的反应以及幼苗生长，还可能促进体细胞胚胎发生。本实施例证实，当次氯酸钠为10-40mg/L时，菊花的生长发育不差于对照组。

本实施例中的植物组织培养基的pH值为5.8-6.0，有利于协同次氯酸钠发挥灭菌作用。由于次氯酸钠是一种不稳定的复杂化合物，不同的pH值，其溶液的组成不一样，因而pH值对灭菌效果的影响是很大的。pH值愈高，次氯酸钠的杀菌作用愈弱，pH值降低，其杀菌作用增强。但同时随着pH值的降低，次氯酸钠的稳定性下降。李慧等研究结果显示随着pH值的进一步降低，2.5%次氯酸钠溶液抑制粪肠球菌的效果逐渐增强，而且pH为6时抗菌作用最强。这可能与次氯酸钠溶液的pH值降低，增大了次氯酸钠溶液中次氯酸的浓度有关。次氯酸钠溶液中存在HclO-H++C1O-这一动态平衡反应，pH值降低，溶液中生成更多不解离的次氯酸。次氯酸的抗菌作用是次氯酸根离子的80-100倍。Fukuzaki等研究发现次氯酸钠溶液的pH值越低，新生成的次氯酸越多，pH值降为6，次氯酸钠溶液中次氯酸增加的量约为pH值7.5的2倍。次氯酸浓度增加，从而增强了次氯酸钠溶液的杀菌作用。本实施例中的培养基的pH值为5.8-6.0，符合实验的要求，即杀菌能力强，快速杀灭微生物，快速分解，减少对植物培养中的伤害。

本实施例的操作方法简单，灭菌时间短。在现有的植物组织培中常用的高压灭菌方法效果可靠，但需设备，消耗能源，且由于灭菌温度高培养基部分养分被破坏，琼脂培养基还会产生沉淀等缺点。采用适当浓度的有效氯对琼脂培养基灭菌具有很多优点，不需专用设备如灭菌锅、超净台等；节约能源，材料易得，费用低廉；操作简单；灭菌彻底和培养基养分不被破坏；特别是节约能源，意义重大。培养基传统的灭菌方法是用高压蒸汽灭菌，灭菌时间长，需要30 min，温度才能达到121℃，经过20 min的灭菌，再经过约40 min才能打开灭菌锅；整个灭菌过程历时90 min。而利用本实施例的方法，培养基的配制的灭菌，也就是利用电磁炉等将培养基加热到沸腾并保持8-10 min即可，节省了大量时间，能够提高培养基的生产效率、降低培养成本、为大规模开展植物组织培养提供高效的植物组织培养方法。

实施例2：

本实施例为一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及其培养方法，应用于兰州食用百合的芽诱导。本实施例的培养基和培养方法参见实施例1，与实施例相同之处不再赘述。

一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和20mg的次氯酸钠；

所述的常规培养基为在MS基本培养基的基础上添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.6 mg/L，萘乙酸（NAA）0.2 mg/L； 

本实施例的植物培养方法参见实施例1，与实施例1的区别为：

步骤Ⅱ中， 所述的外植体为兰州食用百合的鳞茎的洁白细嫩、无斑点的鳞片；所述的兰州食用百合为常规市售；

步骤Ⅱ中，将所述的外植体进行消毒处理，再进行植物组织培养；所述的外植体的消毒方式如下：选取无病斑的兰州食用百合鳞茎，在自来水中流水冲洗1-2h 后，在超净工作台上进行表面消毒；该表面消毒为用75% 乙醇消毒10-20 min，用无菌水冲洗1 次，再用0. 1% HgCl₂ ( 大于外植体的体积) 消毒8~ 10 min，浸泡过程中进行振荡；倒掉HgCl₂ 后, 用无菌水冲洗6~ 7 次，得到消毒后的外植体；

将消毒后的外植体切成0. 5- 1 cm²大小的片状，凹面向下接种在所述的植物组织培养基上进行植物组织培养。

所述的接种在开放的实验室工作台上进行，无需在超净工作台中进行；

所述的植物组织培养在组织培养间中进行，培养条件为：培养温度为20-26 ℃ ，光照度为2000-3000 勒克斯（Lx），光照时间为12-16 小时/天，湿度为70～80％。

本实施例中，将不添加次氯酸钠、经过常规高压蒸汽灭菌、超净台无菌操作的植物组织培养基作为对照组，按照本实施例中方法配制的培养基作为试验组。

本实施例的检测结果如下：

百合鳞片接种于培养基后，2 d时，其鳞片颜色由白色变为紫色；10 d时又逐渐变为淡绿色；15 d时，鳞片靠近培养基处长出小黄米粒大小的白色突起，随后，突起逐渐长大，18 d时突起渐显出芽的形状；21 d时，芽长大成小鳞茎，部分小鳞茎抽出新的嫩条；23 d时，小鳞茎长得更大，伸出尖状绿色芽条，即为绿叶；如图3所示，30 d时，绿叶长长，小鳞茎基部长出白根，试验组和对照组的培养基对百合芽的诱导无差异（图3中，A：对照组，B：试验组）。

实施例1-2中，采用的乙醇、NaOH、次氯酸钠、蔗糖、琼脂、大量元素、微量元素、植物生长调节剂等化学试剂均购自北京鑫葆海商贸有限公司。

Claims (10)

1.一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠。

2.根据权利要求1所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：所述的植物组织培养基中，所述的常规培养基为MS基本培养基。

3.根据权利要求1所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：所述的常规培养基为以MS基本培养基为基础，添加6-苄氨基嘌呤0.6 mg/L，萘乙酸0.2 mg/L。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10mg的次氯酸钠。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和20mg的次氯酸钠。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和40mg的次氯酸钠。

7.根据权利要求1所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基，其特征在于：所述的植物组织培养基用于培养“神马”菊花、兰州食用百合。

8.一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养方法，其特征在于：每1000ml所述的植物组织培养基含有常规培养基的成分和10-40mg的次氯酸钠；该方法包括以下步骤：

Ⅰ、制备植物组织培养基：

A、按照上述含量取所述的常规培养基的成分、次氯酸钠，配制植物组织培养基母液；

B、将所述的植物组织培养基母液在常压下加热至沸腾，并保持沸腾状态8-10分钟，得到加热的植物组织培养基母液；

C、待所述的加热的植物组织培养基母液冷却至50-60℃时，调节pH值为5.8-6.0，得到调节pH值的植物组织培养基母液；

D、将调节pH值的植物组织培养基母液在超净工作台中分装至培养瓶，得到所述的植物组织培养基； 

Ⅱ、植物组织培养：

将植物外植体接种于所述的植物组织培养基中，进行植物组织培养。

9.根据权利要求8所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养方法，其特征在于：Ⅰ-D步骤中所述的培养瓶在分装前经过浓度为100-400mg/L的次氯酸钠水溶液浸泡处理，时间为3-8min。

10.根据权利要求8所述的次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养方法，其特征在于：Ⅱ步骤的接种在开放的工作台上进行。

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