CN108849530A - 一种黄州萝卜开放式组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄州萝卜开放式组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明黄州萝卜开放式组织培养方法包括以下步骤：将培养基配制好后分装到经过消毒的培养容器中，冷却凝固后接种黄州萝卜试管苗在开放环境下进行培养；所用到的培养基，按1L培养基体积计，在MS培养基的基础上再加入蔗糖25g、琼脂粉7g、6‑BA 2mg、NAA 0.02mg、次氯酸钠500‑2000mg，该培养基的配制无需高温高压灭菌。本发明与需要高温高压灭菌的传统组织培养技术相比，两者试管苗生长速度和平均污染率无显著差异。本发明无需严格的无菌环境，可以较大幅度降低黄州萝卜组织培养的成本，有利于推动大别山区地理标志产品黄州萝卜产业的发展。

Description

一种黄州萝卜开放式组织培养方法
技术领域
本发明涉及组织培养农林生物技术领域中的植物组织培养技术，具体涉及一种无需高温高压灭菌的黄州萝卜开放式组织培养方法。
背景技术
黄州萝卜是湖北省黄冈市大别山区的地方特色蔬菜品种，自东汉以来就有历史记载，栽培历史悠久。2008年9月19日，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局第103号公告批准黄州萝卜为地理标志产品。黄州萝卜生食甜脆可口，熟食味佳回锅而不烂，肉质根可溶性糖≥4.0％，维生素C≥30mg/100g，粗纤维素≤12g/kg，赖氨酸含量为一般白萝卜的0.25倍。然而，黄州萝卜在育种和栽培过程中很容易受到其它萝卜品种甚至其它十字花科植物花粉影响，因非人为控制杂交而导致种性退化，产量和品质大幅下降。为解决种性退化问题，自1985年开始至今，研究人员致力于黄州萝卜品种的改良和提纯复壮等育种工作。
申请人在黄州萝卜育种以及育苗过程中，为了快速扩大繁殖优良品种、保持品种优良特性，采用了组织培养技术。但传统的组织培养在无菌环境下进行，其缺点为培养基污染难以彻底解决、成本过高、规模化技术不成熟和技术繁琐。开放式组织培养技术无需高温高压灭菌，可以脱离严格无菌的操作环境，所以能克服传统组织培养技术的上述缺点，简化组培环节，降低组培成本。
发明内容
为了简化黄州萝卜组培环节、降低组培成本，本发明的目的在于提供一种用于黄州萝卜的开放组织培养基，以及一种低成本、易操作的黄州萝卜开放式组织培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于黄州萝卜的开放组织培养基，按1L培养基体积计，在MS培养基的基础上再加入蔗糖25g、琼脂粉7g、6-BA 2mg、NAA 0.02mg、次氯酸钠500-2000mg(即次氯酸钠浓度为0.005-0.02％)。即每1L所述开放组织培养基中含有蔗糖25g、琼脂粉7g、KNO3 1900mg、NH4NO3 1650mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 170mg、CaCl2·2H2O 440mg、MnSO4·4H2O22.3mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、H3BO3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、甘氨酸2.0mg、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg、盐酸硫铵素VB1 0.1mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、6-BA 2mg、NAA0.02mg、次氯酸钠500-2000mg，pH 5.9。进一步优选的，每1L所述开放组织培养基中含有次氯酸钠1000mg。
所述的用于黄州萝卜的开放组织培养基的配制方法，包括以下步骤：按1L培养基含蔗糖25g、琼脂粉7g、KNO3 1900mg、NH4NO3 1650mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 170mg、CaCl2·2H2O 440mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、H3BO3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、Na2·EDTA·2H2O37.3mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、甘氨酸2.0mg、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg、盐酸硫铵素VB1 0.1mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg，配制基础培养基，加热至琼脂粉完全熔化，冷却至50-60℃，再按每1L培养基加入6-BA 2mg、NAA 0.02mg、次氯酸钠500-2000mg，加水定容，调节pH值至5.9。
一种黄州萝卜开放式组织培养方法，包括以下步骤：按照上述配制方法配制培养基后，分装到经过消毒的培养容器中，冷却凝固后接种黄州萝卜试管苗在开放环境下进行培养。所述的培养的条件优选为：温度25℃，湿度70％，光照强度3000-4000Lx，光照时间16h。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明培养基的配制以及后续植物的培养无需高温高压灭菌，与需要高温高压灭菌的传统组织培养技术相比，两者试管苗生长速度和平均污染率均无显著差异。本发明简化了黄州萝卜组织培养流程，无需严格的无菌环境，可以节约成本(包括试剂耗材、水电、人工、高压灭菌锅和超净工作台折旧)50％以上，有利于推动大别山区地理标志产品黄州萝卜产业的发展。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
(1)培养容器消毒：将一次性透明PP带盖塑料容器在0.1％次氯酸钠溶液中浸泡16h，晾干备用。
(2)MS培养基配制：按常规MS培养基成分，即按1L培养基含蔗糖25g、琼脂粉7g、KNO3 1900mg、NH4NO3 1650mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 170mg、CaCl2·2H2O 440mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、H3BO3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg、FeSO4·7H2O27.8mg、甘氨酸2.0mg、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg、盐酸硫铵素VB1 0.1mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg，配制基础培养基，加热至琼脂粉完全熔化，并继续沸腾5min。
(3)开放式培养基配制：将上述MS培养基冷却至55℃，再按每1L培养基加入6-BA2mg、NAA 0.02mg，另加一定浓度抗菌剂(次氯酸钠、山梨酸钾或大蒜素)，加水定容，调节pH值至5.9。不经高压灭菌，直接分装到上述经次氯酸钠溶液消毒的一次性透明PP塑料带盖容器中，冷却凝固，以备接种黄州萝卜试管苗。
(4)黄州萝卜接种培养：在接种室内开放环境(免超净工作台)接种。接种室用75％酒精喷雾降尘，然后紫外灯照射30min，用75％的酒精擦拭接种台面、剪刀、镊子和操作人员手部以消毒，在酒精处理过的接种台面将黄州萝卜试管苗不定芽截取接种于上述PP塑料容器中的开放式培养基上。接种后于温度25℃、湿度70％、光照强度3000-4000Lx、光照时间16h条件下培养以快速繁殖黄州萝卜。
按照上述步骤，通过调整抗菌剂种类及其浓度、培养方式等(各处理培养基基本成分均为MS+6-BA 2mg/L+NAA0.02mg/L，pH 5.9)，比较这些因素对培养效果的影响，结果见表1。
表1
各处理4次重复，每重复100株试管苗，处理1-7培养容器为PP带盖塑料容器，处理8、9培养容器为玻璃瓶、培养基不含抗菌剂且经过高压灭菌，处理1-8均为开放培养，处理9为无菌培养，培养时间30天。由表1可见，黄州萝卜开放培养基中添加次氯酸钠，浓度为0.005-0.025％时均能有效控制污染率，效果显著优于山梨酸钾和大蒜素。培养30天后，处理4和5(次氯酸钠浓度0.010％、0.005％)的平均试管苗高度均高于处理6和7(山梨酸钾和大蒜素)。处理1(次氯酸钠浓度0.025％)的污染率最低，但平均试管苗高度仅为2.67cm，显著低于其它处理。因此黄州萝卜开放培养基中添加次氯酸钠的适宜浓度为0.005-0.020％。其中处理4(次氯酸钠浓度0.010％)的污染率<1％，能为实际生产所接受，且处理4的平均试管苗高度与处理9(无抗菌剂的传统组织培养方法)的平均试管苗高度无显著差异，在处理1-5中最高，即最适于黄州萝卜试管苗生长，因此，黄州萝卜开放式组织培养基最佳次氯酸钠浓度为0.010％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于黄州萝卜的开放组织培养基，其特征在于：按1L培养基体积计，在MS培养基的基础上再加入蔗糖25g、琼脂粉7g、6-BA 2mg、NAA 0.02mg、次氯酸钠500-2000mg。
2.根据权利要求1所述的开放组织培养基，其特征在于：每1L所述开放组织培养基中含有次氯酸钠1000mg。
3.权利要求1所述的开放组织培养基的配制方法，其特征在于：包括以下步骤：按1L培养基含蔗糖25g、琼脂粉7g、KNO3 1900mg、NH4NO3 1650mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4170mg、CaCl2·2H2O 440mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、H3BO3 6.2mg、KI0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、甘氨酸2.0mg、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg、盐酸硫铵素VB10.1mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg，配制基础培养基，加热至琼脂粉完全熔化，冷却至50-60℃，再按每1L培养基加入6-BA 2mg、NAA 0.02mg、次氯酸钠500-2000mg，加水定容，调节pH值至5.9。
4.一种黄州萝卜开放式组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：按照权利要求3所述的方法配制培养基后，分装到经过消毒的培养容器中，冷却凝固后接种黄州萝卜试管苗在开放环境下进行培养。
5.根据权利要求4所述的黄州萝卜开放式组织培养方法，其特征在于：所述的培养的条件为：温度25℃，湿度70％，光照强度3000-4000Lx，光照时间16h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102524073A (zh) * 2012-01-31 2012-07-04 北京市农林科学院 一种次氯酸钠替代高温灭菌的植物组织培养基及培养方法
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