CN106258960A - 一种蕙兰种子萌发快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蕙兰种子萌发快繁方法，涉及植物组织培养技术领域，该方法包括先使用种子萌发培养基培养后使用原球茎分化成苗培养基培养；所述种子萌发培养基为含有0.5‑1.0mg/L的6‑苄基嘌呤的VW培养基；所述原球茎分化成苗培养基为含有质量分数为10%的香蕉汁的KC培养基。本发明的方法能够显著提高蕙兰种子萌发、繁殖速度，尤其是对于紫荆祥云以及难以萌发、培养的老染字品种，有助于缩短培养时间，培养技术简单，为其商业化生产创造条件，满足供不应求的兰花市场需求。

Description

一种蕙兰种子萌发快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体为一种蕙兰种子萌发快繁方法，通过兰花种质资源种子的离体萌发，达到快速生产幼苗的目的。

背景技术

兰花，中国的传统名花，种质资源丰富，分布广泛，并具有较高的观赏价值。其繁殖方法一般为分株繁殖，3-4年才能进行一次，繁殖速度较慢，难以满足市场需要。兰花种子虽然很小，但数量惊人，一个蒴果中有几百万粒种子。兰花种子数量很大，但由于兰花种子非常细小、呈粉状，只有在显微镜下才能看清楚它的结构。它没有胚乳，只有一个简单的胚，外面包着疏松、透明、不易透水的种皮。胚内含有很少的营养物质，绝大部分为脂类物质，自然条件下存在的兰花种子，只有被适宜的真菌感染才能成功地萌发，发芽率都很低，一般不超过5％。因此，研究兰花种子离体萌发技术一直是科研工作者研究的重点，也是利用种子快速繁殖幼苗是一条切实可行的途径。随着科研工作者研究的不断深入，发现在没有真菌共生通过提供外源营养物质的情况下，兰花种子也能萌发，但普遍存在萌发率低，成苗率低的困难，不能满足大规模商品化生产。

蕙兰(Cymbidiumfaberi)蕙兰又称九子兰、九节兰、夏兰，是中国兰花的一大种类，是栽培最久和最普及的兰花之一。因其株型飘逸，香气馥郁，花形优美，在东南亚地区被视为高档的盆栽花卉。蕙兰自然生长在山坡树林中，多数栽培品种均是由野生种驯化或自然变异筛选而来。从资源上来说，由于对野生国兰资源的大量采挖，天然资源已遭到了大量破坏，可采集的野生资源越来越少，再加上自身繁殖速度极其缓慢，我国野生蕙兰资源日趋紧缺，有些珍稀品种已濒临灭绝。只有通过有计划的培育、繁殖发展濒危、特有种类，才能避免该物种灭绝，并且满足当前国兰日益蓬勃的市场需求。通过种子播种萌发可以快速获得繁殖后代及筛选优良种性，进行物种繁衍和有效保护。种子无菌播种技术即在人工调控的环境下加速促进种子萌发及快速繁殖，尤其适合一些自然条件下萌发率极低的植物种子。目前已有适应于其它兰花离体萌发的成功案例，但是兰花对萌发条件要求苛刻，特别是蕙兰，对培养基的成分、激素种类、培养条件、培养时间尤为敏感，现有的适应于蕙兰的方案较少，专利名称为“一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法”，申请号为“200910101739.0”的专利公开了使用改良的MS培养基培育蕙兰的技术方案，但依然存在萌发率低，繁殖速度慢，不能满足规模化生产的弊端。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种蕙兰种子萌发快繁方法，通过给蕙兰种子提供适宜的营养成分和适量的激素诱导原球茎，建立原球茎快速无性繁殖体系，进一步分化成幼苗，本发明的方法能够缩短成苗时间，快速、有效提高繁殖速率，培育壮苗，实现快速的大规模商品化生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种蕙兰种子萌发及快繁方法，包括先使用种子萌发培养基培养后使用原球茎分化成苗培养基培养；所述种子萌发培养基为含有0.5-1.0mg/L的6-苄基嘌呤的VW培养基；所述原球茎分化成苗培养基为含有质量分数为10％的香蕉汁的KC培养基。

本发明还具有以下附加技术特征：

优选的，所述使用种子萌发培养基培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，每天光照8小时；待原球茎重达4-6mg之后，温度增加到28℃，光照为强度改为3000lx，每天光照12小时。

优选的，所述原球茎分化成苗培养基培养条件为：光照强度3000lx，每天光照10小时。

优选的，所述温度为25℃。

优选的，所述光照强度改为3000lx后，每天光照时间为12小时。

优选的，该方法具体包括以下步骤：采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果消毒后，剖开蒴果取出种子涂抹于权利要求1所述的种子萌发培养基培养，待原球茎分化成幼苗后转移至权利要求1所述的原球茎分化成苗培养基培养，直至长出幼苗即得。

优选的，所述消毒为首先用水进行表面清洗，然后用质量分数为70％酒精消毒30秒后，再用质量分数为0.1％的氯化汞水溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分。

优选的，所述蕙兰为紫荆祥云、老染字或下山蕙兰与紫荆祥云杂交品种。

优选的，所述老染字品种在消毒前还包括将其置于冰箱5℃条件下冷处理15天的步骤。

优选的，培养老染字时，所述的VW培养基中还包括0.5g/L萘乙酸。

本发明的方法具体为：

(1)消毒：兰花通过人工授粉后4个月左右，采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果，首先用自来水或洗衣粉溶液进行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分；

(2)配置种子萌发培养基：提供的外源营养成分为Vacin和Went(VW)培养基，内含碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等，配以0.5-1.0mg/L的激素(6-苄基嘌呤)，组成种子萌发培养培养基；

(3)萌发培养：用消毒过的手术刀片将蒴果剖开，用镊子、接种针等工具轻轻取出种子，均匀涂抹在试管或培养瓶中培养基的表面，以大多数种子都能接触到培养基为宜，避免埋入培养基中，引起窒息死亡，及时密封并做好标记，将带有培养物的试管或培养瓶移入培养室或培养箱中，培养温度25℃左右，光照强度2000lx，每天光照8小时；培养约3-10个月后，种子萌发时间，因品种不同常有较大差异，待胚明显增长到谷粒大小后，重量约5mg左右，培养温度再增加到28℃，光照强度3000lx，每天光照12小时。萌发时先是胚逐渐膨大，初为淡黄色，后逐渐变为黄绿色，直至绿色，再由胚长出原球茎；

(4)分化成苗培养：原球茎分化成幼苗使用分化培养基，采用Knudson C(KC)培养基，辅以10％的香蕉汁；将种子生长出的原球茎用镊子或其他工具转移到分化培养基(KC)上，由原球茎产生幼苗。通常接种20天后，第l枚叶片从原球茎顶部中间生出，待出现第2～3片叶时，原球茎伸长，并且有第1条根生出；30天后，等到幼苗有2-3条根，5-6片叶时，将幼苗移栽在育苗基质中，生长较弱的个体可转换到分化培养基上继续培养。

本发明的方法适应于所有兰花品种，尤其可以改善最难萌发的蕙兰属的兰花，经试验证明，本发明的方法可以较快的促进蕙兰种子的萌发，明显缩短培养蕙兰的时间，能快速建立无性繁殖系，短时间内培育出大量的健壮试管苗。不同的蕙兰属的品种在萌发培养基上的萌发时间有较大差别，最少是紫荆祥云为3个月，最长时间的是较难萌发的老染字。

其中，培养基配方表1：

表1VW及KC培养基配方

本发明和现有技术相比，其优点在于：

1)通过在温室控制温度、光照及营养条件，加速授粉后种子的成熟速度，一般在授粉后4个月即可达到9成熟的种子，比现有技术提前2-3个月；

2)种子在培养基上萌发70天左右，由胚发育成原球茎，原球茎继续扩繁、增殖，建立快速无性繁殖体系，繁殖到一定数量后，再由原球茎分化成大量兰花试管苗；

3)分化培养基添加香蕉汁后，由于香蕉汁富含多种维生素及其它营养成分，分化后的幼苗生长速度快，植株健壮；

4)本发明的方法能够显著提高蕙兰种子萌发、繁殖速度，尤其是对于紫荆祥云以及难以萌发、培养的老染字品种，有助于缩短培养时间，培养技术简单，为其商业化生产创造条件，满足供不应求的兰花市场。

说明书附图

图1为将蕙兰-紫荆祥云种子均匀涂抹在培养基表面的观察图；

图2为图1中的蕙兰-紫荆祥云种子培养3个月诱导出原球茎的观察图；

图3为图2中的蕙兰-紫荆祥云种子原球茎培养30天时进一步增殖、增大的观察图；

图4为图3中的蕙兰-紫荆祥云种子原球茎分化成幼苗后20天的观察图。

具体实施方式

以下公开本发明的一些实施例，本领域技术人员可以根据本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

培养蕙兰一批次：蕙兰属的紫荆祥云

(1)消毒：紫荆祥云人工辅助自花授粉后，在温室中控制温度为20-25℃，自然光每天光照8-10小时，增施钾肥，辅以叶面肥料，授粉120天后，蒴果中的种子基本成熟，采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果，首先用自来水或洗衣粉溶液进行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分；

(2)配置种子萌发培养基：提供的外源营养成分为Vacin和Went(VW)培养基，内含碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等，配以0.5g/L的激素(6-苄基嘌呤)，组成种子萌发培养培养基；

(3)萌发培养：用消毒过的手术刀片将蒴果剖开，用镊子、接种针等工具轻轻取出种子，均匀涂抹在试管或培养瓶中培养基的表面，以大多数种子都能接触到培养基为宜，避免埋入培养基中，引起窒息死亡，及时密封并做好标记，将带有培养物的试管或培养瓶移入培养室或培养箱中，培养温度25℃左右，光照强度2000lx，每天光照8小时；培养70天，胚逐渐膨大，初为淡黄色，后逐渐变为黄绿色，待生长到谷粒大小，约5mg后，再增加温度到28℃，光照强度3000lx，每天12小时，种子培养90天后，原球茎慢慢变成绿色，不断增值成簇生状原球茎；

(4)分化成苗培养：原球茎分化成幼苗使用分化培养基，采用表1中辅以质量分数为10％香蕉汁的Knudson C(KC)培养基；将种子生长出的原球茎用镊子或其他工具转移到分化培养基(KC)上，由原球茎产生幼苗，接种20天后，第l枚叶片从原球茎顶部中间生出，待出现第2～3片叶时，原球茎伸长，并且有第1条根生出；等到幼苗有2-3条根，5-6片叶时，将幼苗移栽在育苗基质中，则第一批蕙兰苗育出，此时，成苗培养时间为30天，本批次的紫荆祥云从人工授粉萌到种子成熟、萌发、诱导成苗约240天。

实施例2

培养蕙兰二批次：蕙兰属的名贵品种—老染字

(1)预处理：老染字通过人工自花授粉后130天后，采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果，置于冰箱5℃条件下冷处理15天；

(2)消毒：首先用自来水或洗衣粉溶液进行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分

(3)配置种子萌发培养基：提供的外源营养成分为Vacin和Went(VW)培养基，内含碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等，配以1.0g/L的激素(6-苄基嘌呤)+0.5g/L萘乙酸，组成种子萌发培养培养基；

(4)萌发培养：用消毒过的手术刀片将蒴果剖开，用镊子、接种针等工具轻轻取出种子，均匀涂抹在试管或培养瓶中培养基的表面，以大多数种子都能接触到培养基为宜，避免埋入培养基中，引起窒息死亡，及时密封并做好标记，将带有培养物的试管或培养瓶移入培养室或培养箱中，培养温度25℃左右，光照强度2000lx，每天光照8小时；培养300天胚逐渐膨大，初为淡黄色，后逐渐变为黄绿色，待生长到谷粒大小，约5mg后，再增加到光照强度3000lx，每天光照12小时，320天后，原球茎慢慢变成绿色，不断增值成簇生状原球茎，在培养过程中应及时补充无菌水，以防培养基失水、干燥；

(5)分化成苗培养：原球茎分化成幼苗使用分化培养基，采用表1中辅以质量分数为10％香蕉汁的Knudson C(KC)培养基；将种子生长出的原球茎用镊子或其他工具转移到分化培养基(KC)上，由原球茎产生幼苗，接种20天后，第l枚叶片从原球茎顶部中间生出，待出现第2～3片叶时，原球茎伸长，并且有第1条根生出；等到幼苗有2-3条根，5-6片叶时，将幼苗移栽在育苗基质中，则第二批蕙兰苗育出，此时，培养时间为30天，本批次的老染字从从人工授粉萌到种子成熟、萌发、诱导成苗约495天，本发明在诱导分化培养基KC中添加了总质量为10％的香蕉汁，香蕉汁富含维生素及其它有机养分，给幼苗生长提供全面、充足的养分，培育出的试管苗健康、健壮，有利于下一步试管苗移栽，提高移栽成活率。

实施例3

培养蕙兰三批次：下山蕙兰为母本、紫荆祥云做父本的杂交种子

(1)消毒：以下山蕙兰为母本、紫荆祥云做父本，通过人工辅助手段将父本紫荆祥云的花粉授到下山蕙兰母本的柱头上，在温室通过提高温度、控制光照、增施有机养分等措施，授粉120天后，蒴果中的种子基本成熟，采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果，首先用自来水或洗衣粉溶液进行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分；

(2)配置种子萌发培养基：提供的外源营养成分为Vacin和Went(VW)培养基，内含碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等，配以0.5g/L的激素(6-苄基嘌呤)，组成种子萌发培养培养基；

(3)萌发培养：用消毒过的手术刀片将蒴果剖开，用镊子、接种针等工具轻轻取出种子，均匀涂抹在试管或培养瓶中培养基的表面，以大多数种子都能接触到培养基为宜，避免埋入培养基中，引起窒息死亡，及时密封并做好标记，将带有培养物的试管或培养瓶移入培养室或培养箱中，培养温度25℃左右，光照强度2000lx，每天光照8小时；培养70天，胚逐渐膨大，初为淡黄色，后逐渐变为黄绿色，待生长到谷粒大小，约5mg后，再增加温度到28℃，光照强度3000lx，每天12小时，种子培养90天后，原球茎慢慢变成绿色，不断增值成簇生状原球茎；

(4)分化成苗培养：原球茎分化成幼苗使用分化培养基，采用表1中辅以质量分数为10％香蕉汁的Knudson C(KC)培养基；将种子生长出的原球茎用镊子或其他工具转移到分化培养基(KC)上，由原球茎产生幼苗，接种20天后，第l枚叶片从原球茎顶部中间生出，待出现第2～3片叶时，原球茎伸长，并且有第1条根生出；等到幼苗有2-3条根，5-6片叶时，将幼苗移栽在育苗基质中，则第一批蕙兰苗育出，此时，成苗培养时间为30天，本批次的蕙兰杂交种从人工授粉萌到种子成熟、萌发、诱导成苗约240天。

对比例1

按照现有专利：名称为“一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法”，申请号为“200910101739.0”中的方法对紫荆祥云进行培养，统计成苗时间，从萌发培养到成苗时间为170天，多于本申请实施例1中从种子萌发到诱导出苗的120天，从授粉算起则为350天，显著多于实施例1中的240天。

对比例2

按照现有专利：名称为“一种适宜蕙兰种子无菌萌发培养基组合物及其方法”，申请号为“200910101739.0”中的方法对老染字进行培养，统计成苗时间，从萌发培养到成苗时间为390天，多于本申请实施例1中从种子萌发到诱导出苗的350天，从授粉算起则为590天，显著多于实施例1中的495天。老染字为蕙兰中的名贵品种，由于其萌发率低，萌发时间长，培养技术复杂，也是兰花种较难培养的品种，实施例2显著缩短了老染字的培养时间，培养技术简单，为其商业化生产创造条件。

对比例3

本发明在原球茎的增殖过程中，在培养温度为28℃，光照强度3000lx，每天光照12小时，原球茎增殖速度大大提高，比传统培养技术(MS培养基)每30天继代培养一次，缩短为20天继代培养一次，对建立原球茎快速无性繁殖体系，培育大量试管苗，提供技术支撑，为满足市场需求提供充足的兰花资源。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，包括先使用种子萌发培养基培养后使用原球茎分化成苗培养基培养；所述种子萌发培养基为含有0.5-1.0mg/L的6-苄基嘌呤的VW培养基；所述原球茎分化成苗培养基为含有质量分数为10%的香蕉汁的KC培养基。

2.根据权利要求1所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述使用种子萌发培养基培养条件为：温度25-28℃，光照强度2000lx，每天光照8小时；待原球茎重达4-6mg之后，光照改为3000lx，每天光照12小时。

3.根据权利要求1所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述原球茎分化成苗培养基培养条件为：光照强度3000lx，每天光照12小时。

4.根据权利要求2所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述温度为25℃。

5.根据权利要求2所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述的原球茎增殖时期，光照强度改为3000lx后，每天光照时间为12小时。

6.根据权利要求1所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：采收种子已经成熟但尚未开裂的蒴果消毒后，剖开蒴果取出种子涂抹于权利要求1所述的种子萌发培养基培养，待原球茎分化成幼苗后转移至权利要求1所述的原球茎分化成苗培养基培养，直至长出幼苗即得。

7.根据权利要求6所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述消毒为首先用水进行表面清洗，然后用质量分数为70％酒精消毒30秒后，再用质量分数为0.1%的氯化汞水溶液消毒10分钟，用无菌水洗涤3-5次，晾干或用滤纸吸干表面水分。

8.根据权利要求1-7任一项所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述蕙兰为紫荆祥云、老染字或下山蕙兰与紫荆祥云杂交品种。

9.根据权利要求8所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，所述老染字品种在消毒前还包括将其置于冰箱5℃条件下冷处理15天的步骤。

10.根据权利要求8所述的蕙兰种子萌发快繁方法，其特征在于，培养老染字时，所述的VW培养基中还包括0.5g/L萘乙酸。