CN107810856A

CN107810856A - 一种野生蕉开放式组织培养方法

Info

Publication number: CN107810856A
Application number: CN201711350234.9A
Authority: CN
Inventors: 刘炜婳; 林争春; 赖钟雄; 倪珊珊
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-03-20

Abstract

本发明提供了一种野生蕉开放式组织培养方法，属于植物组织培养领域。利用三明野生蕉为材料，利用培养基MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6‑BA+蔗糖30g/L+琼脂6g/L +NaClO 0.01% 用于开放式组织培养。在开放、自然的条件下操作，不需要超净工作台等无菌设备。培养基不需要高压，减少了因培养基高压而造成的激素和营养元素的损耗与流失。简化操作环节，在设备、场地、人力、物力等方面成本降低。总之，将开放式组织培养方式应用于野生蕉组织培养，这种操作简便、成本低、高效的方式将有广阔的前景。

Description

一种野生蕉开放式组织培养方法

技术领域

本发明提供野生蕉开放式组织培养方法，属于植物组织培养离体增殖领域。

背景技术

野生蕉相对于栽培蕉具有大量的抗逆基因，研究发现三明野生蕉具有抗寒、抗病等重要的抗逆基因，是进行基础研究的宝贵种质资源，是香蕉生物工程研究中重要的研究材料。传统意义上的香蕉离体繁殖技术，一般是在无菌条件下操作，对无菌设备要求很高。例如需要配备高压锅、超净工作台、无菌操作室等无菌设备，成本较高。本发明将开放式组织培养方式应用于野生蕉离体培养，降低了对无菌环境的要求，也相应的大大降低了因基础设施、实验设备、水电消耗、无菌环境维护、人力消耗等造成的生产成本。且培养基和接种器具无需高压，不但简化了组培环节，节省了人力、物力，也避免了因培养基高压而造成的激素和营养元素的损耗与流失。选用次氯酸钠为抑菌剂，优化其使用浓度，使用筛选出的培养基：MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6-BA+NaClO 0.01%，可使三明野生蕉在开放式离体培养过程中效果最好。每升培养基添加次氯酸钠的价格成本为0.06元，成本较低。故这种开放式组织培养的方式相对于传统的组织培养方式操作简便，成本大大降低。目前这种开放式组织培养方式在野生蕉的离体培养上还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种野生蕉开放式组织培养方法，能高效、简便、低成本的进行三明野生蕉离体培养。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种野生蕉开放式组织培养方法，将野生蕉的组培苗在开放、自然条件下相对干净的桌面上切去叶片、假茎，留有生长点的吸芽，接种到添加次氯酸钠的培养基上；每瓶培养基接种4个吸芽；然后放进培养室进行培养，培养期间培养温度为25℃，光照强度为2000 lx，光照时间为12 h/d。30天后进行统计其污染率及增殖系数。

所述培养基为MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基中添加终浓度为0.01wt.%NaClO。

本发明的优点在于：

本发明运用三明野生蕉作为试验材料，次氯酸钠作为抑菌剂，进行野生蕉开放式组织培养体系的建立。开放式组织培养方式虽然在栽培香蕉中有应用，但在野生蕉组织培养过程中还未见报道。开放式组织培养的应用，可使野生蕉离体培养体系过程中的成本大大降低，操作简化。因此，开放式组织培养体系在野生蕉上的应用是非常有前景的，并有望做为野生蕉离体培养的一种重要的方式。筛选出用于野生蕉开放式组织培养的有效培养基：MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6-BA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+ NaClO 0.01%。在考虑成本的前体下，这种培养基在三明野生蕉开放式组织培养应用过程中，三明野生蕉离体培养效果最好。这种开放式组织培养的方式在野生蕉组织培养过程中操作简便，成本大大降低，可作为野生蕉离体培养过程中的一种简便有效的方式。

附图说明

图1 是本专利中三明野生蕉在添加不同浓度的抑菌剂的培养基中发生褐化及污染的生长状况示意图。其中，图a和b是接种在L5、L6培养基中的三明野生蕉发生褐化的示意图；图c、d、e、f是接种在L1、L3、L4培养基中的三明野生蕉在不同生长阶段发生污染的示意图。其中，图c为三明野生蕉接种在L1培养基1-2天后发生污染的示意图，图d、e是三明野生蕉接种L4培养基后8天左右发生污染的示意图，图f是三明野生蕉接种L3培养基后15天左右发生污染的示意图。

图2 是本专利中接种到添加抑菌剂培养基中的三明野生蕉生长状态良好及发生增殖现象的示意图。其中，图a为三明野生蕉接种到添加抑菌剂的培养基后前期，三明野生蕉长势良好；图b、c为三明野生蕉接种到L3培养基后发生少量增殖现象；图d为接种到L4培养基中后三明野生蕉长势良好但未发生增殖现象；图f、i为接种到L2培养基后三明野生蕉长势良好且发生大量增殖现象的示意图；图e、g、h为接种到对照培养基后三明野生蕉长势良好并发生增殖现象的示意图。

具体实施方式

实施例1

1. 接种前准备工作。

开放式组织培养试验：在相对干净的室内，用75%酒精将桌面擦拭干净。将接种用到的接种刀、镊子、滤纸、接种盘、废液缸等接种工具用75%酒精擦拭后，无需高压灭菌，放进操作台上。

对照试验：在接种室内，将高压好的接种工具等进行高压灭菌后，放入超净工作台，进行20min 的紫外灭菌后，用于对照试验接种使用。

2. 培养基的制备

开放式组织培养试验培养基的配置：采用原液浓度为5.2%的次氯酸钠为开放式培养的抑菌剂，对抑菌剂次氯酸钠浓度的优化采用单因素六水平实验进行抑菌剂浓度筛选。MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6-BA作为基本培养基，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养基煮好后，pH调至5.8。在未凝固前，添加不同浓度的次氯酸钠：0.006%、0.01%、0.014%、0.016%、0.018%、0.02%，分别标记为L1、L2、L3、L4、L5、L6。充分搅拌混匀后，不经过高压灭菌，分装进培养瓶中，每种培养基各配制20瓶。

对照试验培养基的配置：配置没有添加抑菌剂的MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6-BA，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5.8的培养基20瓶，标记为L0，高压灭菌后，用于对照试验使用。

2. 接种。

开放式培养试验：在自然、开放的相对干净的室内操作。用镊子将三明野生蕉组培苗夹出来放到滤纸上，用接种刀将其叶片、假茎切除，留有生长点部分。然后将培养基打开，用镊子将切分好生长点部分接种到培养基中，每瓶培养基接种4个。每种培养基接种20瓶。在每瓶培养基接种过程中，接种器具在75%酒精中浸泡后在酒精灯上灼烧后使用。

对照试验：在接种室的超净工作台操作。使用高压过的接种器具操作，具体接种过程同上。

3. 培养。

将接种后的培养基放进培养室，室温25℃，光照强度为2000 lx，光照时间为12 h。培养至30 d后，进行统计。

4. 数据统计。

接种过程中观察其污染情况，统计小苗褐化、污染、增殖情况。褐化率=褐化吸芽数量/接种吸芽数量*100%；污染率=污染的小苗数量/总接种小苗数量*100%；增殖倍数=增殖后小苗总数量/接种时小苗总数量-污染数量-褐化数量。

5. 数据统计与结果分析。

三明野生蕉离体培养过程中的褐化、污染、增殖情况统计结果表1，从褐化结果可以看出L5、L6培养基中的未长出三明野生蕉小苗，且出现严重褐化（如图1-a、b），可能是由于添加的抑菌剂浓度过高造成的。这种现象在葡萄、魔芋等物种中也有类似现象。随着抑菌剂的降低，褐化现象明显减少。从污染分析结果可以看出，L1培养基中的野生蕉小苗污染率最高，达到60%，且多发生在接种初期（如图1-c）这可能是由于L1培养基中添加的抑菌剂的浓度最低，起不到抑菌的效果。其次是L4培养基中的野生蕉小苗的污染率较高，达到35%，此培养基中的污染现象多发生在接种后前中期（如图1-d、e）。L3培养基中野生蕉小苗的污染率为15%，此培养基中的污染现象多发生在接种后的中期（如图1-f）。L2培养基中的野生蕉小苗污染率最低，为10%。从增殖结果分析可知，L2培养基中三明野生蕉小苗的增殖倍数最高，其次是L3、L4、L1培养基。对照培养基L0中三明野生蕉小苗的没有发现污染、褐化现象，其增殖倍数为2.4。传统组培方式因是无菌操作，污染率等指标会相对较低。而开放式组培在开放式环境下操作，因此污染率会比传统组培方式高，但L2在开放式组培方式里褐化率、污染率都是最低，且增殖率和传统方式无显著性差异，在整体上是较为优化的方案，且综合考虑开放式组培方式培养基无需高压，电费较低；同时，还减少高压锅、超净工作台等仪器的使用，且操作简便，相对于传统组培方式成本会明显降低。

市场上原液浓度为5.2%次氯酸钠的价格约为：17元/500ml，一升培养基添加0.01%NaClO的量为1.9ml，每升培养基添加次氯酸钠的价格成本为0.06元。

综上所述，抑菌剂添加浓度过低，起不到抑菌效果，会造成野生蕉组培苗的大量污染（如L1培养基），抑菌剂添加浓度过高，则会引起野生蕉组培苗的严重褐化（如L5、L6培养基）。L2培养基的污染率最低，虽与对照相比，还会出现污染、褐化现象，但这种污染率和褐化率还在可接受的范围之内，且增殖情况与对照没有显著性差异。综合褐化、污染和增殖三个统计指标，以及结合成本费用，可知：当培养基中添加0.01%浓度原液浓度为5.2%的抑菌剂次氯酸钠，野生蕉离体培养过程效果最好。

表1 三明野生蕉不同组培方式离体培养情况统计

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种野生蕉开放式组织培养方法，其特征在于：将野生蕉的组培苗在开放、自然条件下相对干净的桌面上切去叶片、假茎，留有生长点的吸芽，接种到添加次氯酸钠的培养基上；每瓶培养基接种4个吸芽，接种20瓶；然后放进培养室进行培养，培养期间培养温度为25℃，光照强度为2000 lx，光照时间为12 h/d。

2. 根据权利要求1所述的一种野生蕉开放式组织培养方法，其特征在于：所述培养基为MS+2.0 mg/L NAA+ 4.0 mg/L6-BA+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，培养基中添加0.01wt.%NaClO。