CN109496861A - 一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法 - Google Patents

一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，涉及植物技术领域。本发明方法包括：预处理：将接穗浸入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于组织培养室进行水培处理；将水培处理后的接穗切取茎段，去除叶柄，乙醇消毒，转入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于摇床振荡过夜预培养；接种：将预培养后的接穗茎段用乙醇消毒、升汞液消毒及无菌水冲洗，切除接穗茎段两端后进行接种培养。本发明方法具有以下优点：桑树组织培养抗菌率达95％，桑树组培苗新增芽数、新增叶数、株高和生根率均提高50％以上，桑树组培苗玻璃苗发生率降低60％。

Description

一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法
技术领域
本发明涉及植物技术领域，尤其涉及一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法。
背景技术
桑树(Morus L.)属多年生木本植物。由于桑叶是家蚕的天然饲料，桑树便成为重要的经济作物，它是蚕丝业可持续发展的重要物质基础。但桑为多年生木本植物，其生长周期长，育种周期长，虽然桑树可以通过扦插来扩大栽培面积，但不能保证桑树免受病毒感染和优良种质的延续。并且随着植物基因工程的迅猛发展，通过基因工程来改良桑树品种也已经成为现代桑树育种的一个必然趋势。植物组织培养技术的发展为桑树优良品种快速繁殖、桑树无毒苗繁殖以及桑树遗传工程品种改良等提供了解决方法和技术基础。
桑树组织培养研究起步较晚，但桑树的组织培养也有了一定的发展。经过多年的研究，目前，已建立和完善了快速的叶片和桑芽，包括茎尖、腋芽和花药、花穗、成熟胚和未成熟胚以及原生质体再生体系。尽管桑树组织培养再生植株的研究比较深入，但桑树组织培养过程中内生菌污染问题一直没有得到有效解决。植物组织中普遍存在内生菌,当植物组织进行离体培养时,这些内生菌就会产生污染。内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败,增殖效率的降低,培养物生长减缓,玻璃苗增加等。在后期导致试管苗移栽困难和死亡,有时污染也会引起培养物的遗传变异内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败,增殖效率的降低,培养物生长减缓,玻璃苗增加等。在后期导致试管苗移栽困难和死亡,有时污染也会引起培养物的遗传变异。由于桑树属于多年生木本植物，在桑树组织培养中,由于材料内部(细胞内或细胞间)的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除,随着材料带入培养过程,引起污染无法建立桑树组织培养高频再生体系，进而影响桑树优良品种快速繁殖、桑树无毒苗繁殖以及桑树遗传工程品种改良等的科研进程。
因此，亟需寻找一种可抑制桑树组织培养内生菌污染的技术。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，所述方法包括：
预处理：将接穗浸入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于组织培养室进行水培处理；将水培处理后的接穗切取茎段，去除叶柄，乙醇消毒，转入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于摇床振荡过夜预培养；
接种：将预培养后的接穗茎段用乙醇消毒、升汞液消毒及无菌水冲洗，切除接穗茎段两端后进行接种培养。
作为优选，所述接穗为含有饱满芽或腋芽的桑树枝条；所述水培处理采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述水培的时间为48h。
作为优选，所述预培养采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述摇床振荡的时间为12h。
作为优选，所述接种过程中所述乙醇的体积浓度为70％-75％，乙醇消毒10-20s；所述升汞液的质量浓度为0.1％，升汞液消毒的时间为6-10min。
另一方面，本发明实施例还提供了一种桑树组织培养方法，所述方法包括接穗预处理过程、配制培养基过程和桑树组织培养再生体系培养过程；其中，所述桑树组织培养再生体系培养过程包括桑树冬芽或腋芽启动培养过程、桑树再生体系的继代培养过程和桑树再生体系的生根培养过程；其中，所述预处理过程为上述预处理过程。
作为优选，所述配制培养基过程具体为：以MS和WPM为基本培养基，附加蔗糖40g/L，琼脂7.5g/L，pH为5.8；培养条件为温度23-27℃，光照强度2000lx，光照时间10h/d，附加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2.0g/L；
桑树芽启动和分化最佳培养基：MS+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树腋芽启动和分化最佳培养基：WPM+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树叶片诱导愈伤组织最佳培养基：MS+6-BA 1.00mg/L+2,4-D 0.80mg/L；
桑树叶片愈伤组织不定芽分化的培养基：MS+6-BA3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
继代培养基：M S+6-BA 3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
生根培养基：1/2MS+NAA 0.20mg/L。
作为优选，所述桑树冬芽或腋芽启动培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用超净工作台紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min后，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行外植体的消毒和接种；
(2)将预处理过的桑树外植体在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将经预处理过的接穗茎段置于超净工作台上，用75％乙醇消毒15s，0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗3次，将茎段两端切去、接种，以上操作均需在酒精灯火焰旁进行；
(3)在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌镊子将桑树外植体接种在培养基中，每瓶接种3个，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种有桑树外植体的培养瓶置于培养室内进行培养。
作为优选，所述桑树再生体系的继代培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min后，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行继代生芽接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用灼烧过的镊子取出3簇芽苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每簇芽苗切成分别含有2个芽苗的小簇苗，然后再切去芽的尖端；
(3)用镊子将切好的芽苗插入继代培养基中，每瓶接种3个去掉芽顶端的小簇苗，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种的继代桑芽置于培养室内进行光照培养。
作为优选，所述桑树再生体系的生根培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行桑芽生根接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用镊子取出带芽的小簇苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每一个小芽分开；
(3)用镊子把每一个芽苗插入生根培养基中，每瓶接种3个芽苗，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种的桑芽苗置于培养室内进行生根培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、经本发明方法处理后桑树组织培养抗菌率达95％；
2、桑树组培苗新增芽数、新增叶数、株高和生根率均提高50％以上；
3、桑树组培苗玻璃苗发生率降低60％。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
桑树外植体(接穗)预处理：采集的无病含有饱满芽或腋芽的桑树枝条接穗经流动清水冲洗40min，浸入头孢噻肟(500mg/L)和青霉素G钠盐(400mg/L)1:1混合抗生素溶液中，于组织培养室内水培48h；将水培处理的接穗切取1cm左右茎段，去除叶柄，75％乙醇消毒15s，转入头孢噻肟(500mg/L)和青霉素G钠盐(400mg/L)1:1混合抗生素溶液中，在摇床上振荡过夜(12h)。
桑树组织培养环境条件：
MS和WPM为基本培养基；附加蔗糖40g/L；琼脂7.5g/L；pH为5.8；培养条件为温度(25士2)℃，光照强度2000lx，光照时间10h/d，附加PVP2.0g/L；
桑树芽启动和分化最佳培养基：MS+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树腋芽启动和分化最佳培养基：WPM+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树叶片诱导愈伤组织最佳培养基：MS+6-BA 1.00mg/L+2,4-D 0.80mg/L；
桑树叶片愈伤组织不定芽分化的培养基：MS+6-BA3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
继代培养基：M S+6-BA 3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
生根培养基：1/2MS+NAA 0.20mg/L。
桑树组织培养再生体系建立：
1、桑树冬芽(腋芽)启动培养
(1)接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种；
(2)将预处理过的桑树外植体在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将经水培处理和预培养过的接穗茎段，于超净工作台上用75％乙醇消毒15s，0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗3次，将茎段两端切去、接种(冬芽则小心剥去外层鳞片)；以上操作都要在酒精灯火焰旁进行；
(3)在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将桑树外植体接种在培养基中，每瓶接种3个，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称；
(4)将上述接种有桑树外植体的培养瓶置于培养室内进行培养。并整理超净工作台台面。
2、桑树再生体系的继代培养
(1)接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行继代生芽接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用灼烧过的镊子取出3簇芽苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每簇芽苗切成分别含有2个芽苗的小簇苗，然后再切去芽的尖端；
(3)用镊子将切好的芽苗插入继代培养基中，每瓶接种3个去掉芽顶端的小簇苗。封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称；
(4)将上述接种的继代桑芽置于实验室的培养室内进行光照培养，并整理超净工作台台面。
3、桑树再生体系的生根培养
(1)接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行桑芽生根接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用镊子取出带芽的小簇苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每一个小芽分开；
(3)用镊子把每一个芽苗插入生根培养基中，每瓶可以接种3个芽苗。封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称；
(4)将上述接种的桑芽苗置于实验室的培养室内进行生根培养，并整理超净工作台台面。
本发明的抑菌组培方法具有以下优点：
1、经本发明方法处理后桑树组织培养抗菌率达95％；
2、桑树组培苗新增芽数、新增叶数、株高和生根率均提高50％以上；
3、桑树组培苗玻璃苗发生率降低60％。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
预处理：将接穗浸入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于组织培养室进行水培处理；将水培处理后的接穗切取茎段，去除叶柄，乙醇消毒，转入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于摇床振荡过夜预培养；
接种：将预培养后的接穗茎段用乙醇消毒、升汞液消毒及无菌水冲洗，切除接穗茎段两端后进行接种培养。
2.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述接穗为含有饱满芽或腋芽的桑树枝条；所述水培处理采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述水培的时间为48h。
3.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述预培养采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述摇床振荡的时间为12h。
4.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述接种过程中所述乙醇的体积浓度为70％-75％，所述乙醇的消毒时间为10-20s；所述升汞液的质量浓度为0.1％，所述升汞液的消毒时间为6-10min。
5.一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述方法包括接穗预处理过程、配制培养基过程和桑树组织培养再生体系培养过程；所述桑树组织培养再生体系培养过程包括桑树冬芽或腋芽启动培养过程、桑树再生体系的继代培养过程和桑树再生体系的生根培养过程；其中，所述预处理过程为权利要求1-4任一项所述的预处理过程。
6.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述配制培养基过程具体为：以MS和WPM为基本培养基，附加蔗糖40g/L，琼脂7.5g/L，pH为5.8；培养条件为温度23-27℃，光照强度2000lx，光照时间10h/d，附加聚乙烯吡咯烷酮2.0g/L；
桑树芽启动和分化最佳培养基：MS+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树腋芽启动和分化最佳培养基：WPM+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；
桑树叶片诱导愈伤组织最佳培养基：MS+6-BA 1.00mg/L+2,4-D 0.80mg/L；
桑树叶片愈伤组织不定芽分化的培养基：MS+6-BA3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
继代培养基：M S+6-BA 3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；
生根培养基：1/2MS+NAA 0.20mg/L。
7.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述桑树冬芽或腋芽启动培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用超净工作台紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min后，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行外植体的消毒和接种；
(2)将预处理过的桑树外植体在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将经预处理过的接穗茎段置于超净工作台上，用75％乙醇消毒15s，0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗3次，将茎段两端切去、接种，以上操作均需在酒精灯火焰旁进行；
(3)在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌镊子将桑树外植体接种在培养基中，每瓶接种3个，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种有桑树外植体的培养瓶置于培养室内进行培养。
8.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述桑树再生体系的继代培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min后，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行继代生芽接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用灼烧过的镊子取出3簇芽苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每簇芽苗切成分别含有2个芽苗的小簇苗，然后再切去芽的尖端；
(3)用镊子将切好的芽苗插入继代培养基中，每瓶接种3个去掉芽顶端的小簇苗，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种的继代桑芽置于培养室内进行光照培养。
9.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述桑树再生体系的生根培养过程具体为：
(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行桑芽生根接种；
(2)在酒精灯火焰旁打开桑芽的组培瓶，用镊子取出带芽的小簇苗，放在灭过菌的碟子上，用解剖刀把每一个小芽分开；
(3)用镊子把每一个芽苗插入生根培养基中，每瓶接种3个芽苗，封口后熄灭酒精灯；
(4)将接种的桑芽苗置于培养室内进行生根培养。
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