CN105494107A - 一种茶树组织培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于茶树组织培养技术领域，具体涉及一种茶树组织培养的方法。本发明公开了一种茶树幼叶组织培养的方法，其方法是将消毒后的茶树幼叶外植体接种于不含琼脂的液体培养基上，所述外植体在切割时，叶缘0.5-1cm处不切断，再将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基上暗培养11-13d，通过这种方法处理过的外植体褐化率为32％，萌芽率高达68％；本发明利用液固共培养和暗培养相结合的办法，明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显著提高萌芽率和效率。

Description

一种茶树组织培养的方法
技术领域
本发明属于茶树组织培养技术领域，具体涉及一种茶树组织培养的方法。
背景技术
目前，茶树(CamelliasinensisL.Kuntze.)属山茶科，山茶属，是一种多年生的木本、常绿植物。茶树组织培养技术的研究起源于20世纪60年代末，英国剑桥大学以茶树幼茎小块为材料研究了离体咖啡碱的合成。50年来中外科学家在茶树组织和器官培养领域做出了不懈的努力，在快速繁殖、植株再生和遗传转化、次生代谢产物等许多方面获得了进展。但不容否认，茶树组织培养还有不少难题未攻克，主要有污染、褐化、玻璃苗、难以分化、再生体系不完善等等。其中，因为茶树多酚类物质含量高，褐化现象严重，阻碍了组培的后续工作。因此，研究一种降低褐化率，提高茶树组织培养效率的方法为本领域目前迫切需要解决的技术难题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是解决由于茶树多酚类物质含量高，褐化现象严重的问题。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种茶树幼叶组织培养的方法，包括如下步骤：
一种茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
(2)将所述外植体依次用酒精消毒和次氯酸钠消毒；
(3)将消毒后的外植体沿垂直于叶脉的方向横切数刀且不切断；
(4)将所述外植体接种于经过灭菌后的液体培养基，再放入培养室中进行培养；所述液体培养基的pH值为5.4-5.8，具体组成为：MS+4.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g，再转接到固体培养基暗培养。
优选的，所述步骤2中用酒精消毒和次氯酸钠消毒后，分别以无菌水进行冲洗，本发明中用70％-80％的酒精消毒5-10s，无菌水冲洗1遍，每次1-2min；用8％-12％次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗4遍，每次1-2min。
优选的，将所述消毒后的外植体沿垂直叶脉方向横切5-8刀，根据外植体大小，一般情况下沿垂直于叶脉的方向横切5-8为最佳刀数，所述外植体在切割时，叶缘0.5-1cm处不切断，切割后的外植体为一整片完整样本。
优选的，所述外植体接种于装有50ml培养基的250mL培养瓶中，每瓶接种5～6片所述外植体，优选250mL的培养瓶，太大容量的培养瓶浪费材料，变向提高成本；每个培养瓶中放置5～6片所述外植体，由于在外植体培养成功后，其培养瓶中优选放置5～6片所述外植体，若太少，培养液浪费，若太多，会因为空间狭小导致新苗放置空间不足。
优选的，所述步骤4中所述培养具体为：将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养，转接到固体培养基暗培养时，由于培养时间的变化，褐化率与萌芽率均发生变化。
所述暗培养条件：温度22-25℃；所述光培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，暗培养与光培养培养总时间25d。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：本发明公开了一种茶树幼叶组织培养的方法，其方法是将茶树幼叶外植体消毒后将茶树幼叶接种于不含琼脂的液体培养基上，每瓶接种6个沿垂直叶脉方向横切5-8刀的茶树幼叶，接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基上暗培养12d，过这种方法处理过的外植体褐化率为32％，萌芽率高达68％；本发明利用液固共培养和暗培养相结合的办法，明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显著提高萌芽率和效率。
附图说明
图1是本发明实施例茶树幼叶组织培养的方法的流程示意图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供的茶树幼叶组织培养的方法，其步骤如下；
取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
将茶树幼叶用70％的酒精消毒10s，无菌水冲洗1遍；用10％次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗4遍；
将每个茶树幼叶沿垂直叶脉方向横切5-8刀，所述外植体在切割时，叶缘0.5-1cm处不切断；
将上述叶片接种在不含琼脂的液体培养上，每个瓶子接种6片茶树幼叶，接种后放入培养室中进行培养。
以培养基为：MS+4mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g+琼脂粉7g，pH值调至5.8，配制好的50ml培养基装在250mL培养瓶中，高温灭菌25min。
外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养4d。培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，培养总时间20d。褐化率降为47.8％，萌芽率达到52.2％。
实施例2到8
根据固体培养基暗培养时间的变化，得到以下数据。
由上述实验数据得知，在暗培养条件：温度22-25℃；光培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，暗培养与光培养培养总时间25d的情况下固体培养基暗培养时间为11-13d的效果相对较好，萌芽率较高，固体培养基暗培养培养时间12d为最佳。
实施例9
本发明实施例提供的茶树幼叶组织培养的方法，其步骤如下；
取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
将茶树幼叶用70％的酒精消毒10s，无菌水冲洗1遍；用10％次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗4遍；
将每个茶树幼叶沿垂直叶脉方向横切5-8刀，所述外植体在切割时，叶缘0.5-1cm处不切断；
将上述叶片接种在不含琼脂的液体培养上，每个瓶子接种6片茶树幼叶，接种后放入培养室中进行培养。
以培养基为：MS+4mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g+琼脂粉7g，pH值调至5.8，配制好的50ml培养基装在250mL培养瓶中，高温灭菌25min。
优选的，所述步骤4中所述培养具体为：将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养，转接到固体培养基暗培养12d，在其通过固体培养基暗培养12d后，转到光培养的环境下进行培养，由于培养总时间的变化，褐化率与萌芽率均发生变化。
所述暗培养条件：温度22-25℃；所述光培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，固体培养基暗培养12d，暗培养与光培养培养总时间15d，褐化率为63.8％，萌芽率达到38.2％。
实施例10到16
根据暗培养与光培养总时间的变化，得到以下数据。
由上述实验数据得知，在暗培养条件：温度22-25℃；光培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，固体培养基暗培养时间为12d，暗培养与光培养培养总时间在20-30d的情况下，效果相对较好，萌芽率较高。
实施例17
与常规方法进行比较试验，具体实验步骤如下：
1、取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
2、将茶树幼叶用70％的酒精消毒10s，无菌水冲洗1遍；用10％次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗4遍；
3、将消毒完的外植体去掉叶柄，剪下叶片，用解剖刀切成0.7mm×0.7mm小块。
将处理步骤2的外植体接种在含琼脂的固体培养基上，每个瓶子接种6个小块，接种后放入培养室中进行常规培养。
以培养基为：MS+4mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g+琼脂粉7g，pH值调至5.8，配制好的培养基分装在250mL的培养瓶中，高温灭菌25min。
将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养，培养条件为：温度22℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/d，培养总时间20d，处理步骤2褐化率达到75.4％，萌芽率仅为24.6％。
本发明通过将外植体在液体培养基中培养一定时间后，再将其转入固体培养基培养，进行液固共培养有3方面的优势：
1、液体培养基稀释了外植体内部酚类物质，使酚类物质抑制出芽和产生褐变的不利影响降至最低；
2、液体培养基与外植体上下表面充分接触、营养物质更易吸收、生长调节剂更易发挥作用；
3、液体培养基流动性强、内部营养物质能够达到一个动态平衡。
植物组织培养采用暗培养的原因：愈伤组织的培养分为两个阶段，一是脱分化培养阶段，二是再分化培养阶段。脱分化培养阶段：由于光会阻碍组织的脱分化，所以脱分化培养阶段应避光培养，在无光的条件下愈伤组织长得更快。脱分化培养阶段一般为2周，然后必须更换培养基进行培养，因为2周后培养基中的营养成分已接近耗尽。
脱分化培养阶段植物细胞在光照条件下会自发进行光合作用，同时还要完成自身修复，愈伤组织光合作用的结果是生成糖类，但光合作用过程中必然需要分流出一部分物质和能量参与进去，从而完成修复过程的物质和能量的总量减少，因而愈伤组织分化和生长变慢；愈伤组织在脱分化培养阶段，有光容易导致细胞再分化，不能达到形成大量愈伤组织及在短期时间内获得大量幼苗的目的，但形成愈伤组织后需要光是为了形成叶绿体，叶绿体进行光合作用为愈伤组织分化成芽乃至小苗提供营养。因此本方法避光培养15d，有利于愈伤组织的形成和后期芽的分化。
综上所述，本发明将茶树幼叶外植体消毒后将茶树幼叶接种于不含琼脂的液体培养基上，每瓶接种6个沿垂直叶脉方向横切5-8刀的茶树幼叶，并且在切割叶子时叶缘0.5-1cm处不切断，将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基上暗培养12d，茶树幼叶沿垂直叶脉方向横切5-8刀的外植体褐化率为32％，萌芽率高达68％；本发明利用液固共培养和暗培养相结合的办法，明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显著提高萌芽率和效率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
(2)将所述外植体依次用酒精消毒和次氯酸钠消毒；
(3)将消毒后的外植体沿垂直于叶脉的方向横切数刀且不切断；
(4)将所述外植体接种于经过灭菌后的液体培养基，再放入培养室中进行暗培养，最后转接到固体培养基进行暗培养；所述液体培养基的pH值为5.4-5.8，具体组成为：MS+4.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g。
2.根据权利要求1所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：步骤(2)中用酒精消毒和次氯酸钠消毒后，分别以无菌水进行冲洗。
3.根据权利要求2所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：将所述消毒后的外植体沿垂直叶脉方向横切5-8刀。
4.根据权利要求3所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：所述外植体接种于装有50ml培养基的250mL培养瓶中，每瓶接种5～6片所述外植体。
5.根据权利要求1或4所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：步骤(4)中所述培养具体为：将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养11-13d。
6.根据权利要求5所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：所述固体培养基为MS+4.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBA+蔗糖30g+琼脂粉7g。
7.根据权利要求5所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：暗培养后进行光培养。
8.根据权利要求7所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：所述暗培养条件：温度22-25℃。
9.根据权利要求8所述的茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于：所述光培养条件为：温度22-25℃，光照强度1500-2000Lx，光照时间12h/d，所述暗培养与光培养培养总时间20-30d。
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