CN103947548A - 一种百子莲高频再生体系建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种百子莲高频再生体系建立的方法，将百子莲幼小花蕾清洗分装，用75%浓度乙醇溶液浸泡30s，0.1%浓度升汞水溶液中振荡灭菌10min，水冲洗，滤纸吸干花蕾表面水分；花蕾对半切割开接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS为诱导培养基中30d形成不定芽；不定芽以每丛3-4个单芽的方式接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的丛生芽；丛生芽切割后成单芽接种至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培养基中，30d后形成根；将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。本发明的有益效果是百子莲的种苗产量高。

Description

—种百子莲高频再生体系建立的方法

技术领域

[0001] 本发明属于组织培养领域，涉及一种百子莲高频再生体系建立的方法。

背景技术

[0002] 百子莲(Agapanthus praecox ssp.)是原产于南非的多年生根莖类花丼,又名非洲百合、百子兰、蓝花君子兰、紫穗兰等，素有“爱情之花”的美誉，目前研究者对其分类地位还不统一，曾被归为百合科(Liliaceae)、葱科(Alliaceae)或石蒜科(Amaryllidaceae)的亚科(Agapanthoideae),近期还有学者将其单独归为一科一非洲百合科(Agapanthceae)。百子莲植株秀丽，叶色浓绿，花茎挺立，花型优雅，花色淡雅，不但是非常理想的地被和花境植物材料，而且也是很好的鲜切花材料，同时也可用作药用成分的提取，目前已成功应用在上海世博绿化景观，这必将在上海及周边城市绿化景观上起到示范效应，市场对百子莲需求将逐步加大，开发前景广阔。我国于2000年对百子莲进行引种栽培，栽培研究发现，百子莲多数不结果或种子不能萌芽或分化严重，而且播种繁殖需要3-6年的精心养护才能正常开花；分株繁殖，则繁殖速度缓慢、繁殖系数低，且小苗生长不快；而组织培养的方法则可大大加快百子莲的繁殖速度，缩短繁殖的周期。百子莲属植物引入我国时间不长，对其组培技术的报道比较少见，仅见康玲以百子莲的根茎部和叶片为外植体进行组培研究，但未获得生根。而且用现有的方法生产百子莲种苗产量不足，难以满足市场需求的现状。

发明内容

[0003] 本发明 的目的在提供一种百子莲高频再生体系建立的方法，解决了现有的方法生产百子莲种苗产量不足，难以满足市场需求的现状的问题。

[0004] 本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行:

[0005] (I)将百子莲幼小花蕾采集后带回实验室，洗洁精清洗4min，用清水冲净，将清洗干净的花蕾每个培养瓶分装，用75%浓度乙醇溶液浸泡30s，0.1%浓度升汞水溶液中振荡灭菌lOmin，水冲洗，滤纸吸干花蕾表面水分；

[0006] (2)将经过步骤(1)处理的花蕾对半切割开接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS为诱导培养基中30d形成不定芽；

[0007] (3)将不定芽以每丛3-4个单芽的方式接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的丛生芽；

[0008] (4)将平均叶长为2.0cm左右的丛生芽切割后成单芽接种至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培养基中，30d后形成根；

[0009] (5)将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。

[0010] 本发明的特点还在于步骤(1)中百子莲幼小花蕾采集的时间是6月份，花蕾在形成I周之内，所述步骤(2)中诱导培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L'奈乙酸0.1mg.L'吲哚丁酸0.3mg.L—1，蔗糖3%。在步骤(3)中增殖培养基为MS且添加有6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L—1、奈乙酸0.25mg.L—1、赤霉素0.05mg.L-1、蔗糖3% ^MS且添加6-苄氨基腺嘌呤3.5mg.171、奈乙酸0.25mg.L'赤霉素0.1Omg.L'鹿糖3%的两种培养基中交替培养,可获得6.02的增殖倍数和生长粗壮的不定芽丛。在步骤(4)中生根培养基为1/2MS且培养基中添加吲哚丁酸0.5mg.L'奈乙酸0.5mg.L—1，蔗糖1.5%。步骤(5)中移栽基质泥炭与珍珠岩的比例为3:1。

[0011] 本发明的有益效果是百子莲的种苗产量高。

具体实施方式

[0012] 本发明的具体实施方式如下步骤:

[0013] 步骤1:试验材料和处理方法；试验材料:选取百子莲花蕾为外植体，在6月期间，将形成一星期之内的百子莲幼小花蕾连同花梗采收。材料处理方法:先对花蕾进行表面清洗，清洗液可选用洗洁精等，后用清水冲洗4~5次。将清洗干净的花蕾按照每个培养瓶20个进行分装，然后在超净工作台用75%浓度乙醇溶液浸泡30s取出，0.1%浓度升汞水溶液中进行振荡灭菌lOmin，无菌水冲洗5~6遍，消毒滤纸吸干花蕾表面水分，进行下一步。

[0014] 步骤2:组织培养和植株再生试验方法；不定芽诱导培养基的选择和优化:将经过灭菌处理的花蕾对半切割开接种至以MS为培养基附加不同6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)、NAA(吲哚丁酸)、IBA (奈乙酸)9种诱导培养基，9种诱导培养基中，6-BA、NAA、IBA与水的浓度分别如表1中所示的Al~A9。采用L9(34)正交试验设计，每种诱导培养基每升接种25~50个花蕾。按每种每升25瓶的规格分装到培养瓶内，照常规的高压消毒方法进行灭菌，诱导培养基基中添加白糖为3%，琼脂粉6.5g.L_S pH值在灭菌后调至6.0。定期观察并记录花蕾生长情况，30d (d代表天数)后统计花蕾生长及不定芽的形成情况。培养室内控制温度25±1° C，光照为40 μ mo 1.m^2.s—1，光照时间为每天14h。

[0015] 步骤3:增殖培养基的选择和优化:将上一步在诱导培养基中形成的不定芽丛以每丛3~4个单芽的方式接种至以MS为基本培养基且添加有不同浓度的9种6-BA、NAA、GA3形成的增殖培养基中，其中6-BA、NAA、GA3浓度如表2所示中的BI~B9，采用L9 (34)正交试验设计，照常规的高压消毒方法进行灭菌，30d后统计不定芽的生长和增殖状况。添加白糖为3%，琼脂粉6.5g.L_S pH值在灭菌后调至6.0。培养室内控制温度25± 1°C，光照为40ymOl.m_2.s—1，光照时间为每天14h，生成丛生芽，其增殖倍数最高可达6.02。

[0016] 步骤4:生根培养基的选择和优化:以各元素减半的1/2MS添加有不同浓度的IBA、NAA做为生根培养基，将平均叶长为2.0cm左右、长势良好增殖形成的丛生芽用解剖刀切割后成单芽接种至其中，IBA、NAA水溶液浓度为如表3所示的SI~S9，采用L9 (34)正交试验设计，照常规的高压消毒方法进行灭菌，SI~S9每种接种40株待生根的百子莲组培苗，试验重复3次。30天后统计生根苗数、生根率、平均根条数和苗高。生根培养基中还添加白糖为1.5%，琼脂粉6.Sg^LlpH值在灭菌后调至6.0。培养室内控制温度25± 1°C，光照为40 μ mo 1.m-2.s'光照时间为每天14h。

[0017] 步骤5:将上一步中生长出根的组培苗移栽，组培苗移栽基质筛选:移栽基质为蛭石:草炭:珍珠岩=1:3:1 ;1个月后移栽成活率可达到100%。

[0018] 对本发明的方法进行实验数据的统计:所有的试验都进行3次或3次以上的重复，增殖倍数=形成不定芽总数/接入不定芽总数。采用Spss软件对数据进行单因素方差分析及Duncan法进行多重比较。[0019] 结果与分析，诱导培养基、诱导条件的选择和优化对不定芽诱导的影响:百子莲花蕾在诱导培养基中IOd后开始膨大，15d后花蕾开始展开，20d后花瓣开始枯萎，部分子房膨大转绿并直接形成少量芽点，30d后芽点逐渐长大叶子伸长。表1结果可知，百子莲花蕾子在Al~A9增殖培养基中均可以诱导形成不定芽，进一步分析可知培养基添加的NAA浓度为麵.lmg.L-1时，不定芽的诱导率显著高于其他培养基，达到显著差异。这说明恰当的NAA浓度是获得百子莲不定芽高频诱导的重要条件，同时本实验中添加适量的IBA既可以

提高诱导率也可以直接形成不定芽，较好的保持了植物材料的优良遗传特性。

[0020]

[0021] 注:采用Duncan检测方法(α =0.05)，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表

示差异显著。

[0022] 激素对百子莲不定芽增殖的影响:将诱导培养基中形成的不定芽接种(每种培养基接种30块带3~4个单芽的芽丛)至增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的不定芽；表2表明，不定芽在9种培养基均能增殖。但增殖倍数、不定芽的生长状况均有明显差异。MS 培养基中添加 6-BA2.5mg.L' NAA0.25mg.L' GA30.05mg.1/1 (BI)号分化形成细小、叶色浓绿不定芽，但增殖倍数可达到6.02。对不同培养基配方对愈伤组织诱导效果进行显著性分析表明:B1号培养基增殖倍数与其他8种培养基增殖能力的差异显著。进一步分析表明，不定芽的生长状态与6-BA浓度关系密切:当6-BA浓度为3.5mg.L-1时不定芽叶色浓绿、植株粗壮；然而当6-BA浓度为2.5mg.L'4.5mg.L-1时不定芽叶尖泛黄、植株细小。综合分析得知，百子莲不定芽增殖与分化过程中使用BI号培养基和Β4号培养基交替培养，既可以获得较高的增殖倍数，也可以获得生长状态旺盛的不定芽。

[0023] 表2生长调节物质的选择和调整对芽继代增殖的影响

[0024]

[0025] 注:采用Duncan检测方法(a =0.05)，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表

示差异显著。

[0026] 激素对百子莲组培苗生根的影响:生根之前，将丛芽转移至不添加任何激素的1/2MS培养基中进行壮苗培养，待芽丛长至2cm左右，单植株切下接种至生根培养基。15d后百子莲组培苗开始生根，新生长出根吸收营养物质后会明显促进植株生长，20d后组培苗可产生I~3条根，长成粗状的根系后，植株可长到3~5.58cm高。由表3可知，百子莲组培苗的生根率总体随IBA和NAA浓度的增加而升高，同时生根数量和苗高也相应有所增加。进一步分析表明，IBA和NAA比例为1:1时有利于百子莲的生根。9种处理均可使百子莲组培苗生根，显著性分析表明处理S9与其他8种培养基生根能力的差异显著。

[0027] 表3不同浓度的IBA和NAA组合对百子莲组培苗生根的影响

[0028]

[0029] 注:釆用Duncan检测方法(α =0.05)，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表

示差异显著。

[0030] 基质对组培苗移栽成活率的影响:百子莲组培苗在出瓶之前需要经炼一个星期的驯化期，在此期间逐渐打开瓶盖，打破瓶内无菌和高湿的环境苗。移苗时注意对苗清洗干净和分级处理，然后移栽至不同基质中，移栽后一个星期左右幼苗发出白色新根，基质以草炭:珍珠岩=3:1的移栽成活率较高，可达到100% ;而在园土中，移栽成活率仅为86.7%。

[0031] 本发明以百子莲花蕾为外植体，通过直接器官发生方式获得了再生植株，并通过激素种类和浓度的调控使得无菌材料实现大量增殖。通过本发明诱导产生的丛生芽生势旺盛、遗传性状与母本一致，为实现优质材料的大规模组培生产奠定基础。

Claims (5)

1.一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于:按照以下步骤进行: (1)将百子莲幼小花蕾采集后带回实验室，洗洁精清洗4min，用清水冲净，将清洗干净的花蕾每个培养瓶分装，用75%浓度乙醇溶液浸泡30s，0.1%浓度升汞水溶液中振荡灭菌lOmin，水冲洗，滤纸吸干花蕾表面水分； (2)将经过步骤(1)处理的花蕾对半切割开接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙 酸的MS为诱导培养基中30d形成不定芽； (3)将不定芽以每丛3-4个单芽的方式接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的丛生芽； (4)将平均叶长为2.0cm左右的丛生芽切割后成单芽接种至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培养基中，30d后形成根； (5)将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。

2.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于:所述步骤(O中百子莲幼小花蕾采集的时间是6月份，花蕾在形成I周之内，所述步骤(2)中诱导培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L—1、奈乙酸0.lmg.L—1、吲哚丁酸0.3mg.L—1，蔗糖3%。

3.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于:所述在步骤(3)中增殖培养基为MS且添加有6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L_\奈乙酸0.25mg.L'赤霉素0.05mg.L-1、蔗糖3% ;或MS且添加6-苄氨基腺嘌呤3.5mg.L'奈乙酸0.25mg.L—1、赤霉素0.1Omg.L_\蔗糖3%的两种培养基中交替培养，可获得6.02的增殖倍数和生长粗壮的不定芽丛。

4.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于:所述在步骤(4)中生根培养基为1/2MS且培养基中添加吲哚丁酸0.5mg.L'奈乙酸0.5mg.L—1，蔗糖1.5%。

5.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于:所述步骤(5)中移栽基质泥炭与珍珠岩的比例为3:1。