CN103947548A

CN103947548A - 一种百子莲高频再生体系建立的方法

Info

Publication number: CN103947548A
Application number: CN201410144190.4A
Authority: CN
Inventors: 王志龙; 何月秋; 张椿芳; 林立
Original assignee: Ningbo City College of Vocational Technology
Current assignee: Ningbo City College of Vocational Technology
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明提供了一种百子莲高频再生体系建立的方法，将百子莲幼小花蕾清洗分装，用75%浓度乙醇溶液浸泡30s，0.1%浓度升汞水溶液中振荡灭菌10min，水冲洗，滤纸吸干花蕾表面水分；花蕾对半切割开接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS为诱导培养基中30d形成不定芽；不定芽以每丛3-4个单芽的方式接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的丛生芽；丛生芽切割后成单芽接种至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培养基中，30d后形成根；将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。本发明的有益效果是百子莲的种苗产量高。

Description

一种百子莲高频再生体系建立的方法

技术领域

本发明属于组织培养领域，涉及一种百子莲高频再生体系建立的方法。

背景技术

百子莲（Agapanthus praecox ssp.）是原产于南非的多年生根茎类花卉，又名非洲百合、百子兰、蓝花君子兰、紫穗兰等，素有“爱情之花”的美誉，目前研究者对其分类地位还不统一，曾被归为百合科(Liliaceae)、葱科(Alliaceae)或石蒜科(Amaryllidaceae)的亚科(Agapanthoideae),近期还有学者将其单独归为一科--非洲百合科(Agapanthceae)。百子莲植株秀丽，叶色浓绿，花茎挺立，花型优雅，花色淡雅，不但是非常理想的地被和花境植物材料，而且也是很好的鲜切花材料，同时也可用作药用成分的提取，目前已成功应用在上海世博绿化景观，这必将在上海及周边城市绿化景观上起到示范效应，市场对百子莲需求将逐步加大，开发前景广阔。我国于2000年对百子莲进行引种栽培，栽培研究发现，百子莲多数不结果或种子不能萌芽或分化严重，而且播种繁殖需要3-6年的精心养护才能正常开花；分株繁殖，则繁殖速度缓慢、繁殖系数低，且小苗生长不快；而组织培养的方法则可大大加快百子莲的繁殖速度，缩短繁殖的周期。百子莲属植物引入我国时间不长，对其组培技术的报道比较少见，仅见康玲以百子莲的根茎部和叶片为外植体进行组培研究，但未获得生根。而且用现有的方法生产百子莲种苗产量不足，难以满足市场需求的现状。

发明内容

本发明的目的在提供一种百子莲高频再生体系建立的方法，解决了现有的方法生产百子莲种苗产量不足，难以满足市场需求的现状的问题。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

（1）将百子莲幼小花蕾采集后带回实验室，洗洁精清洗4min，用清水冲净，将清洗干净的花蕾每个培养瓶分装，用75%浓度乙醇溶液浸泡30s，0.1%浓度升汞水溶液中振荡灭菌10min，水冲洗，滤纸吸干花蕾表面水分；

（2）将经过步骤（1）处理的花蕾对半切割开接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸和奈乙酸的MS为诱导培养基中30d形成不定芽；

（3）将不定芽以每丛3-4个单芽的方式接种至添加有6-苄氨基腺嘌呤、奈乙酸和赤霉素的MS增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的丛生芽；

（4）将平均叶长为2.0cm左右的丛生芽切割后成单芽接种至含有萘乙酸和吲哚丁酸的1/2MS的生根培养基中，30d后形成根；

（5）将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。

本发明的特点还在于步骤（1）中百子莲幼小花蕾采集的时间是6月份，花蕾在形成1周之内，所述步骤（2）中诱导培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L^-1、奈乙酸0.1mg.L^-1、吲哚丁酸0.3mg.L^-1，蔗糖3%。在步骤（3）中增殖培养基为MS且添加有6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L^-1、奈乙酸0.25mg.L^-1、赤霉素0.05mg.L^-1、蔗糖3%；或MS且添加6-苄氨基腺嘌呤3.5mg.L^-1、奈乙酸0.25mg.L^-1、赤霉素0.10mg.L^-1、蔗糖3%的两种培养基中交替培养，可获得6.02的增殖倍数和生长粗壮的不定芽丛。在步骤（4）中生根培养基为1/2MS且培养基中添加吲哚丁酸0.5mg.L^-1、奈乙酸0.5mg.L^-1，蔗糖1.5%。步骤（5）中移栽基质泥炭与珍珠岩的比例为3:1。

本发明的有益效果是百子莲的种苗产量高。

具体实施方式

本发明的具体实施方式如下步骤：

步骤1：试验材料和处理方法；试验材料：选取百子莲花蕾为外植体，在6月期间，将形成一星期之内的百子莲幼小花蕾连同花梗采收。材料处理方法：先对花蕾进行表面清洗，清洗液可选用洗洁精等，后用清水冲洗4～5次。将清洗干净的花蕾按照每个培养瓶20个进行分装，然后在超净工作台用75%浓度乙醇溶液浸泡30s取出，0.1%浓度升汞水溶液中进行振荡灭菌10min，无菌水冲洗5～6遍，消毒滤纸吸干花蕾表面水分，进行下一步。

步骤2：组织培养和植株再生试验方法；不定芽诱导培养基的选择和优化：将经过灭菌处理的花蕾对半切割开接种至以MS为培养基附加不同6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、NAA（吲哚丁酸）、IBA（奈乙酸）9种诱导培养基，9种诱导培养基中，6-BA、NAA、IBA与水的浓度分别如表1中所示的A1～A9。采用L₉（3⁴）正交试验设计，每种诱导培养基每升接种25～50个花蕾。按每种每升25瓶的规格分装到培养瓶内，照常规的高压消毒方法进行灭菌，诱导培养基基中添加白糖为3%，琼脂粉6.5g·L^-1，pH值在灭菌后调至6.0。定期观察并记录花蕾生长情况，30d（d代表天数）后统计花蕾生长及不定芽的形成情况。培养室内控制温度25±1℃，光照为40μmol.m^-2.s^-1，光照时间为每天14h。

步骤3：增殖培养基的选择和优化：将上一步在诱导培养基中形成的不定芽丛以每丛3～4个单芽的方式接种至以MS为基本培养基且添加有不同浓度的9种6-BA、NAA、GA₃形成的增殖培养基中，其中6-BA、NAA、GA₃浓度如表2所示中的B1～B9，采用L₉（3⁴）正交试验设计，照常规的高压消毒方法进行灭菌，30d后统计不定芽的生长和增殖状况。添加白糖为3%，琼脂粉6.5g·L^-1，pH值在灭菌后调至6.0。培养室内控制温度25±1℃，光照为40μmol.m^-2.s^-1，光照时间为每天14h，生成丛生芽，其增殖倍数最高可达6.02。

步骤4：生根培养基的选择和优化：以各元素减半的1/2MS添加有不同浓度的IBA、NAA做为生根培养基，将平均叶长为2.0cm左右、长势良好增殖形成的丛生芽用解剖刀切割后成单芽接种至其中，IBA、NAA水溶液浓度为如表3所示的S1～S9，采用L₉（3⁴）正交试验设计，照常规的高压消毒方法进行灭菌，S1～S9每种接种40株待生根的百子莲组培苗，试验重复3次。30天后统计生根苗数、生根率、平均根条数和苗高。生根培养基中还添加白糖为1.5%，琼脂粉6.5g·L^-1，pH值在灭菌后调至6.0。培养室内控制温度25±1℃，光照为40μmol.m^-2.s^-1，光照时间为每天14h。

步骤5：将上一步中生长出根的组培苗移栽，组培苗移栽基质筛选：移栽基质为蛭石：草炭∶珍珠岩=1：3：1；1个月后移栽成活率可达到100%。

对本发明的方法进行实验数据的统计：所有的试验都进行3次或3次以上的重复，增殖倍数=形成不定芽总数/接入不定芽总数。采用Spss软件对数据进行单因素方差分析及Duncan法进行多重比较。

结果与分析，诱导培养基、诱导条件的选择和优化对不定芽诱导的影响：百子莲花蕾在诱导培养基中10d后开始膨大，15d后花蕾开始展开，20d后花瓣开始枯萎，部分子房膨大转绿并直接形成少量芽点，30d后芽点逐渐长大叶子伸长。表1结果可知，百子莲花蕾子在A1～A9增殖培养基中均可以诱导形成不定芽，进一步分析可知培养基添加的NAA浓度为NAA0.1mg.L^-1时，不定芽的诱导率显著高于其他培养基，达到显著差异。这说明恰当的NAA浓度是获得百子莲不定芽高频诱导的重要条件，同时本实验中添加适量的IBA既可以提高诱导率也可以直接形成不定芽，较好的保持了植物材料的优良遗传特性。

注：采用Duncan检测方法(α=0.05)，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著。

激素对百子莲不定芽增殖的影响：将诱导培养基中形成的不定芽接种（每种培养基接种30块带3～4个单芽的芽丛）至增殖培养基中，30d后不定芽增殖形成大量嫩绿的不定芽；表2表明，不定芽在9种培养基均能增殖。但增殖倍数、不定芽的生长状况均有明显差异。MS培养基中添加6-BA2.5mg.L^-1、NAA0.25mg.L^-1、GA₃0.05mg.L^-1（B1）号分化形成细小、叶色浓绿不定芽，但增殖倍数可达到6.02。对不同培养基配方对愈伤组织诱导效果进行显著性分析表明:B1号培养基增殖倍数与其他8种培养基增殖能力的差异显著。进一步分析表明，不定芽的生长状态与6-BA浓度关系密切：当6-BA浓度为3.5mg.L^-1时不定芽叶色浓绿、植株粗壮；然而当6-BA浓度为2.5mg.L^-1、4.5mg.L^-1时不定芽叶尖泛黄、植株细小。综合分析得知，百子莲不定芽增殖与分化过程中使用B1号培养基和B4号培养基交替培养，既可以获得较高的增殖倍数，也可以获得生长状态旺盛的不定芽。

表2生长调节物质的选择和调整对芽继代增殖的影响

注:采用Duncan检测方法(α=0.05)，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著。

激素对百子莲组培苗生根的影响：生根之前，将丛芽转移至不添加任何激素的1/2MS培养基中进行壮苗培养，待芽丛长至2cm左右，单植株切下接种至生根培养基。15d后百子莲组培苗开始生根，新生长出根吸收营养物质后会明显促进植株生长，20d后组培苗可产生1～3条根，长成粗状的根系后，植株可长到3～5.58cm高。由表3可知，百子莲组培苗的生根率总体随IBA和NAA浓度的增加而升高，同时生根数量和苗高也相应有所增加。进一步分析表明，IBA和NAA比例为1:1时有利于百子莲的生根。9种处理均可使百子莲组培苗生根，显著性分析表明处理S9与其他8种培养基生根能力的差异显著。

表3不同浓度的IBA和NAA组合对百子莲组培苗生根的影响

基质对组培苗移栽成活率的影响：百子莲组培苗在出瓶之前需要经炼一个星期的驯化期，在此期间逐渐打开瓶盖，打破瓶内无菌和高湿的环境苗。移苗时注意对苗清洗干净和分级处理，然后移栽至不同基质中，移栽后一个星期左右幼苗发出白色新根，基质以草炭∶珍珠岩=3:1的移栽成活率较高，可达到100%；而在园土中，移栽成活率仅为86.7%。

本发明以百子莲花蕾为外植体，通过直接器官发生方式获得了再生植株，并通过激素种类和浓度的调控使得无菌材料实现大量增殖。通过本发明诱导产生的丛生芽生势旺盛、遗传性状与母本一致，为实现优质材料的大规模组培生产奠定基础。

Claims

1.一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于：按照以下步骤进行：

（5）将生根的植株移栽至由泥炭和珍珠岩组成的基质中。

2.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）中百子莲幼小花蕾采集的时间是6月份，花蕾在形成1周之内，所述步骤（2）中诱导培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L^-1、奈乙酸0.1mg.L^-1、吲哚丁酸0.3mg.L^-1，蔗糖3%。

3.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于：所述在步骤（3）中增殖培养基为MS且添加有6-苄氨基腺嘌呤2.5mg.L^-1、奈乙酸0.25mg.L^-1、赤霉素0.05mg.L^-1、蔗糖3%；或MS且添加6-苄氨基腺嘌呤3.5mg.L^-1、奈乙酸0.25mg.L^-1、赤霉素0.10mg.L^-1、蔗糖3%的两种培养基中交替培养，可获得6.02的增殖倍数和生长粗壮的不定芽丛。

4.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于：所述在步骤（4）中生根培养基为1/2MS且培养基中添加吲哚丁酸0.5mg.L^-1、奈乙酸0.5mg.L^-1，蔗糖1.5%。

5.按照权利要求1所述一种百子莲高频再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（5）中移栽基质泥炭与珍珠岩的比例为3:1。