CN103229722B - 一种杉木愈伤组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杉木愈伤组织培养方法，筛选出颗粒饱满，无病虫害的杉木种子作为外植体，通过无菌培养后获得无菌实生苗，剪取无菌实生小苗的叶片、茎段或根系，接种于诱导培养基中诱导愈伤组织发生，最后将诱导形成的愈伤组织转入增殖培养基中进行增殖。本发明简单易行，能够有效缩短愈伤组织诱导和增殖的时间，提高杉木愈伤组织诱导率，为杉木产业的发展提供大量颜色好、结构致密的优质愈伤组织材料，具有较好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种愈伤组织培养方法，尤其涉及一种杉木愈伤组织培养方法。
背景技术
植物愈伤组织培养是植物组织培养过程中的一个重要阶段，愈伤组织不仅可以诱导完整植株的形成，还可用于种质资源的保存，同时也是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。杉木（Cunninghamia lanceolata）为我国特有的针叶用材树种，其材质好，生长快，产量高，是我国南方的主要造林树种。杉木组织培养主要是通过腋芽诱导或愈伤组织诱导途径进行，而愈伤组织诱导是杉木组织培养过程中的一个重要环节，高诱导率和高质量的愈伤组织培养是后期愈伤组织分化的重要基础。我国杉木组织培养开始于20世纪50年代，现有技术中，采用腋芽诱导途径进行杉木组织培养快速繁殖的研究较多，而利用外植体诱导愈伤组织发生，再通过愈伤组织诱导不定芽发生进而获得杉木完整植株的研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单易行，能够缩短愈伤组织诱导和增殖的时间，提高愈伤组织诱导率的杉木愈伤组织培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种杉木愈伤组织培养方法，其特征在于：选取杉木种子作为外植体，培养出实生小苗，诱导实生苗的愈伤组织发生后进行增殖，具体操作步骤如下：
（1）无菌实生苗的获取：筛选出颗粒饱满，无病虫害的杉木种子作为外植体，通过无菌培养获得无菌实生苗；
（2）愈伤组织诱导：剪取苗龄为1～10天无菌实生苗的叶片、茎段或根系，接种于诱导培养基中诱导愈伤组织发生；
（3）愈伤组织增殖：将步骤（2）中诱导形成的愈伤组织转入增殖培养基中进行增殖。
以上所述的无菌实生苗的培养方法是将杉木种子置于三角瓶内，加入浓度为1～5%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗10～15 min后，置于流水下冲洗1～2h，然后用无菌水清洗2～3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌9～12min，无菌水清洗8～10次后，将种子接种于1/2MS～MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。
以上所述的诱导培养基主要由：1/2MS～MS + 1.0～2.0 mg/L 2,4-D + 0.5～1.5mg/L KT + 100～150 mg/L维生素C + 0.75%琼脂 + 3.0%蔗糖组成。
以上所述的愈伤组织增殖方法是取出诱导而得的愈伤组织团，切成小块后转入增殖培养基中进行增殖培养。
以上所述的增殖培养基主要由：1/2MS～MS + 1.0～2.0mg/LKT + 0.5～1.5mg/LIBA + 100～150 mg/L维生素C + 0.75%琼脂 + 3.0%蔗糖组成。
本发明的优点及积极效果有：
1、本发明通过优良种子无菌培养获取无菌实生苗，在无菌材料获取方面仅对种子进行了消毒处理，避免了直接对幼苗等幼嫩材料进行消毒处理造成的损伤。
2、本发明采用苗龄为1～10天的杉木实生幼苗为材料，其组织幼嫩，细胞分生能力强，各组织或器官均能较好地诱导愈伤组织形成。
3、本发明采用激素2,4-D 和KT结合进行愈伤组织诱导，可获得较高的诱导效率。
4、本发明采用KT和IBA作为增殖激素，其增殖速率快，愈伤组织质地紧实，较好地满足了后续愈伤组织分化的要求。
5、本发明在愈伤组织诱导和增殖培养基中加入一定量的维生素C，可大大降低愈伤组织的褐化程度。
附图说明
图1为本发明的杉木无菌实生苗效果图；
图2为本发明的杉木叶片诱导愈伤组织发生效果图；
图3为本发明的杉木愈伤组织增殖效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为1%～2%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗10 min后，置于流水下冲洗1h，然后用无菌水清洗2次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌9min，无菌水清洗8次后，将种子接种于1/2MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为1天的杉木实生苗的叶片，接种于由1/2MS+1.0 mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+100 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第2天叶片开始卷曲，第3天叶片伤口处或叶边缘长愈伤组织，愈伤组织的颜色最初为嫩黄色，随着愈伤组织增多其颜色逐渐变成棕黄色，无褐变，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2MS+1.00mg/L KT+0.5mg/L IBA+100mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，质地紧实，少数愈伤组织底部轻微褐变，月增殖倍数为5.48。
实施例2：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为1%～2%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15 min后，置于流水下冲洗1.5h，然后用无菌水清洗3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌10min，无菌水清洗8次后，将种子接种于3/4MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为5天的杉木实生苗的叶片，接种于由1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+130 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第3天叶片开始卷曲，第5天叶片伤口处或叶边缘长愈伤组织，愈伤组织的颜色最初为嫩黄色，随着愈伤组织增多其颜色逐渐变成棕黄色，无褐变，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2MS+2.0mg/L KT+0.5mg/L IBA+130 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，质地紧实，无褐变，月增殖倍数为5.97。
实施例3：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为2%～3%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗12min后，置于流水下冲洗2h，然后用无菌水清洗2次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌10min，无菌水清洗9次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为8天的杉木实生苗的叶片，接种于由1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第3天叶片开始卷曲，第10天叶片伤口处或叶边缘长愈伤组织，愈伤组织的颜色最初为嫩黄色，随着愈伤组织增多其颜色逐渐变成棕黄色，无褐变，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2MS+2.0mg/L KT+1.0mg/L IBA+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，质地紧实，无褐变，月增殖倍数为5.73。
实施例4：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为2%～3%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗13 min后，置于流水下冲洗1h，然后用无菌水清洗2次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌12min，无菌水清洗10次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为10天的杉木实生苗的叶片，接种于由1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.5mg/L KT+100 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第4天叶片开始卷曲，第12天叶片伤口处或叶边缘长愈伤组织，愈伤组织的颜色最初为嫩黄色，随着愈伤组织增多其颜色逐渐变成棕黄色，无褐变，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2MS+2.0mg/L KT+1.5mg/L IBA+100 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，结构致密，增殖生长出的愈伤组织无褐变，月增殖倍数为6.31。
实施例5：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为3%～4%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15 min后，置于流水下冲洗2h，然后用无菌水清洗3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌12min，无菌水清洗10次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为2天的杉木实生苗的茎段，接种于由1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第4天茎段开始膨大，第10天茎段切口处长出愈伤组织，愈伤组织的颜色最初为嫩黄色，随着愈伤组织增多其颜色逐渐变成棕黄色，无褐变，20天后，愈伤组织诱导率为96.7%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2MS+2.0mg/L KT+1.0mg/L IBA+130 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，质地致密，无褐变，月增殖倍数为6.59。
实施例6：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为3～4%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15 min后，置于流水下冲洗2h，然后用无菌水清洗3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌12min，无菌水清洗10次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为3天的杉木实生苗的根系，接种于由1/2MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.5mg/L KT+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第5天根尖开始膨大，第10天根尖处长出愈伤组织，愈伤组织颜色为淡棕黄色，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由1/2M+2.0mg/L KT+1.0mg/L IBA+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由淡棕黄色转变为翠绿色，结构致密，无褐变，月增殖倍数为6.18。
实施例7：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为4%～5%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15 min后，置于流水下冲洗2h，然后用无菌水清洗3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌12min，无菌水清洗10次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为2天的杉木实生苗的叶片，接种于由MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT+120 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的的诱导培养基中进行诱导培养。第2天叶片开始卷曲膨大，第4后叶片伤口处或叶边缘长出愈伤组织，愈伤组织颜色为淡棕黄色，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由MS+1.5mg/L KT+1.0mg/L IBA+120mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，结构致密，无褐变，月增殖倍数为6.73。
实施例8：
一种杉木愈伤组织培养方法，选取颗粒饱满、无病虫害的杉木种子作为外植体置于三角瓶内，加入浓度为4%～5%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15 min后，置于流水下冲洗2h，然后用无菌水清洗3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌12min，无菌水清洗10次后，将种子接种于MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗。待种子萌发后，剪取苗龄为10天的杉木实生苗的根系，接种于由MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.5mg/L KT+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的诱导培养基中进行诱导培养。第5天根尖开始膨大，第12天根尖处长出愈伤组织，愈伤组织颜色为淡棕黄色，20天后，愈伤组织诱导率为100%。取出诱导而得的愈伤组织，切成小块，接种于由MS+2.0mg/L KT+1.5mg/L IBA+150 mg/L维生素C+0.75%琼脂+3.0%蔗糖组成的增殖培养基中，愈伤组织生长迅速，颜色由棕黄色转变为翠绿色，结构致密，无褐变，月增殖倍数为6.20。
Claims (1)
1.一种杉木愈伤组织培养方法，其特征在于：选取杉木种子作为外植体，培养出实生苗，诱导实生苗的愈伤组织发生后进行增殖，具体操作步骤如下：
（1）无菌实生苗的获取：筛选出颗粒饱满，无病虫害的杉木种子作为外植体，通过无菌培养获得无菌实生苗；所述的无菌实生苗的培养方法是将杉木种子置于三角瓶内，加入浓度为1～5%的洗洁精溶液，采用纱布封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗10～15 min后，置于流水下冲洗1～2h，然后用无菌水清洗2～3次，将种子转到超净工作台上用0.15%升汞溶液灭菌9～12min，无菌水清洗8～10次后，将种子接种于1/2MS培养基上进行培养，获取无菌实生苗；
（2）愈伤组织诱导：剪取苗龄为1～10天无菌实生苗的叶片、茎段或根系，接种于诱导培养基中诱导愈伤组织发生；所述的诱导培养基由：1/2MS + 1.0～2.0 mg/L 2,4-D + 0.5～1.5mg/L KT + 100～150 mg/L维生素C + 0.75%琼脂 + 3.0%蔗糖组成；
（3）愈伤组织增殖：取出步骤（2）中诱导形成的愈伤组织切成小块后转入增殖培养基中进行增殖；所述的增殖培养基由：1/2MS + 1.0～2.0mg/L KT + 0.5～1.5mg/L IBA + 100～150 mg/L维生素C + 0.75%琼脂 + 3.0 %蔗糖组成。
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- 2013-05-23 CN CN201310195125.XA patent/CN103229722B/zh not_active Expired - Fee Related
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