CN101720670A - 旱半夏组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种旱半夏组织培养快速繁殖方法。利用组织培养技术诱导无菌旱半夏块茎产生愈伤组织并分化产生无菌苗，然后取无菌苗的叶片、叶柄及愈伤组织块作为外植体，再经愈伤组织诱导、分化培养，增殖培养，生根培养后，大量繁殖旱半夏组培苗。本发明外植体来源丰富，体积较大，接种成活率高，操作简单快捷，繁殖系数高，速度快，适合工厂化育苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术工程领域，具体涉及一种旱半夏组织培养快速繁殖技术。
背景技术
半夏[Pinellia ternate(Thunb.)Breit.]属天南星科半夏属植物，以干燥块茎入药，是一种重要的中药材，具有降逆止吐、燥湿化痰、消痞散结等功能，多用于治疗痰喘咳、恶心呕吐、眩晕等，近年发现半夏蛋白有抗早孕和抗肿瘤作用，目前国内全年用量就达5000吨，是多年来紧缺的中药材之一。药用旱半夏几乎都来自野生，我国虽具有丰富的野生旱半夏种质资源，但由于旱半夏药用和出口需求量大，造成野生资源日益枯竭难以满足要求，价格持续上扬，居高不下。目前，虽有人工栽培种植旱半夏可以缓解市场压力，但由于旱半夏生长要求阴湿环境，在灾害性天气较多的年份，会造成收获量不足的情况，这对旱半夏的生产造成极大限制。另外，旱半夏连作种植易导致病毒侵染，种性退后，产量和品质下降。因此，考虑使用植物组培快繁技术进行旱半夏种苗生产并进行人工种植是解决旱半夏资源短缺的有效途径。
目前，现有技术中未见有完整关于旱半夏外植体选择、愈伤组织诱导、器官分化诱导、碳源浓度选择的整套组培技术方案的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种旱半夏组织培养快速繁殖方法。利用本发明的方法对旱半夏进行大规模快繁，以解决旱半夏在天然状态下繁殖困难以及旱半夏资源日益匮乏问题，实现旱半夏的大规模人工种植，提高旱半夏储量。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
旱半夏组织培养快速繁殖技术，包括以下步骤：
1)配制培养基，基本培养基和其它组培阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
基础培养基：用MS培养基，附加蔗糖15-45g/L，琼脂10g/L，pH5.8；
愈伤组织诱导培养基：MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；
分化培养基：MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；
增殖培养基：MS中添加KT 0.2-2.0mg/L和2，4-D 0.2-2.0mg/L
生根培养基：MS中添加KT 1.0-2.0mg/L和NAA 0-1.0mg/L；
2)培养无菌苗：将旱半夏块茎灭菌处理后，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L培养基上使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后接种到MS培养基上继续生长得到大量无菌苗；
3)诱导愈伤组织：将步骤2)培养出的无菌苗的叶片、叶柄和愈伤组织块，在无菌条件下切成5mm大小，接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；
4)分化培养：将步骤3)诱导形成的愈伤组织移至分化培养基上使其分化出芽；
5)增殖培养：将步骤4)诱导形成的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)移至增殖培养基上再分化出丛芽；
6)生根培养：将步骤5)增殖形成的单芽(包含基部愈伤组织块)切下，接种在生根培养基中进行生根培养；
7)移栽：当步骤6)的生根组培苗生长至3-5cm，根数在5根以上时，移栽入基质，在温室中培养至成苗。
所述步骤2)旱半夏萌发无菌苗的方法是选旱半夏块茎，用75％的乙醇浸泡45s后，用0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5次后接种到培养基上，在温度为25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养30天。
所述步骤7)中栽培基质由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成。
本发明旱半夏组织培养快速繁殖技术。可更具体地概括为：
(1)从大田直接采集旱半夏的块茎作为外植体，消毒过后在接种到培养基上获得无菌苗，然后分别以其叶片、叶柄和块茎作为外植体诱导愈伤组织。旱半夏块茎先用75％的酒精浸泡45s，再用0.1％的升汞消毒15min，使用无菌水清洗5次，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后使其在MS培养基上继续生长。在温度为25℃，光照2000Lx，12h/d的光周期条件下培养30天，即可长出旱半夏无菌苗。
(2)分别以步骤(1)的旱半夏无菌苗的叶片、叶柄或愈伤组织块为外植体，接入到MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基中，其中，MS培养基中KT的浓度为1.0-3.0mg/L，2，4-D的浓度为1.0-3.0mg/L，蔗糖的浓度为15-45mg/L，培养基的pH值为5.8，琼脂量为10g/L，在温度121℃下灭菌20min，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养，诱导出愈伤组织。
(3)将步骤(2)中产生的胚性愈伤组织接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中MS培养基中KT的浓度为1.0-3.0mg/L，2，4-D的浓度为1.0-3.0mg/L，蔗糖的浓度为15-45g/L，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，即可萌发出不定芽。
(4)将步骤(3)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中MS培养基中的浓度为KT 0.2-2.0mg/L，2，4-D的浓度为0.2-2.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，再次萌发出大量不定芽。
(5)将步骤(4)中萌发出的单芽(包含基部愈伤组织块)切出，转入MS添加KT和NAA的培养基中进行生根培养基中，其中，MS培养基中KT的浓度为1.0-2.0mg/L，NAA的浓度为0-0.5mg/L，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养10天后生根率可达90％以上。
(6)当步骤(5)中已生根的旱半夏组培苗生长至3-5cm，根数5根以上时，移栽基质培养至成苗，其中基质是由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制。
所述的步骤(2)是利用盐酸或氢氧化钾调整pH值。
本发明的优越性在于利用大规模组织培养技术快速繁殖旱半夏幼苗，通过无菌苗的培养、以不同部位的外植体诱导愈伤组织，并使其再生出植株。本发明芽和根的最高分化率都达90％以上，苗移栽成活率也达90％以上。通过大规模组培快繁旱半夏，可以扩大旱半夏种植面积，提高旱半夏的产量，推动旱半夏产业链的健康发展。
具体实施方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1(以旱半夏叶片为外植体)：
先用旱半夏块茎使其愈伤分化培养得到无菌苗，然后以其叶片为外植体诱导愈伤组织。
(1)旱半夏萌发无菌苗的方法为：将旱半夏块茎用75％的酒精浸泡45s，再用0.1％的升汞消毒15min，最后使用无菌水冲洗5次，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L培养基上使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后使其在MS培养基上继续生长。在温度为25℃，光照2000Lx，光照12h/d下培养30天之后，即可得到旱半夏无菌苗。
(2)以步骤(1)的旱半夏无菌苗叶片为外植体接入到MS添加了KT、2，4-D和蔗糖的培养基中，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，诱导出旱半夏的愈伤组织，愈伤诱导率为52.9％。
(3)将步骤(2)中叶片诱导形成的胚性愈伤接入MS添加了KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在温度25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，即可萌发出芽。芽分化率可达93％。
(4)将步骤(3)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，再次萌发出芽，芽再分化率为92.5％。
(5)将步骤(4)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)转入生根培养基中生根，生根培养基是使用MS添加KT、NAA和蔗糖的培养基，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养10-15天后，生根率达96％。
(6)当生根的旱半夏组培苗生长至3-5cm，根数5根以上时，移栽入由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成的基质中培养，定期肥水管理，旱半夏长势良好，成活率可达90％以上。
实施例2(以旱半夏叶柄为外植体)：
先用旱半夏使其愈伤分化培养得到无菌苗，然后以其叶柄为外植体诱导愈伤组织。
(1)旱半夏萌发无菌苗的方法为：将旱半夏块茎用75％的酒精浸泡45s，再用0.1％的升汞消毒15min，最后使用无菌水冲洗5次，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后使其在MS培养基上继续生长。在温度为25℃，光照2000LX下培养30天之后，即可得到旱半夏无菌苗。
(2)以步骤(1)的旱半夏无菌苗的叶柄为外植体直接接入到MS添加了KT、2，4-D和蔗糖的培养基中，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养，诱导出愈伤组织。MS+KT1.0mg/L+2.4-D 1.0mg/L的愈伤诱导率为57％。
(3)将步骤(2)中叶柄诱导形成的胚性愈伤接入MS添加了KT、2，4-D的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，即可萌发出芽。MS+KT 3.0mg/L+2.4-D1.0mg/L的芽分化率为93％。
(4)将步骤(3)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000LX，光周期12h/d下培养15天，再次萌发出芽。MS+KT 1.0mg/L+2.4-D 0.3mg/L的芽再分化率为97％。
(5)将步骤(4)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)转入生根培养基中生根，生根培养基是使用MS添加KT、NAA和蔗糖的培养基，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养10-15天后，生根率可达100％。
(6)当生根的旱半夏组培苗生长至3-5cm，根数5根以上时，移栽入由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成的基质中培养，定期肥水管理，旱半夏长势良好，成活率可达90％以上。
实施例3(以旱半夏愈伤块为外植体)：
先用旱半夏使其愈伤分化培养得到无菌苗，然后以其愈伤块为外植体继续诱导成愈伤组织。
(1)旱半夏萌发无菌苗的方法为：将旱半夏块茎用75％的酒精浸泡45s，再用0.1％的升汞消毒15min，最后使用无菌水冲洗5次，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后使其在MS培养基上继续生长。在温度为25℃，光照2000Lx下培养30天之后，即可得到旱半夏无菌苗。
(2)以步骤(1)的旱半夏愈伤块为外植体直接接入到MS添加了KT、2，4-D和蔗糖的培养基中，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，，光照2000Lx，光周期12h/d下培养，诱导出旱半夏的愈伤组织。MS+KT 2.0mg/L+2.4-D 2.0mg/L的愈伤诱导率为93％。
(3)将步骤(2)中愈伤块诱导形成的胚型愈伤接入MS添加了KT、2，4-D的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，即可萌发出芽。MS+KT3.0mg/L+2.4-D 1.0mg/L的芽分化率为96％。
(4)将步骤(3)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，再次萌发出芽。MS+KT 1.0mg/L+2.4-D 0.3mg/L的芽再分化率为98％。
(5)将步骤(4)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)转入生根培养基中生根，生根培养基是使用MS添加KT、NAA和蔗糖的培养基，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养10-15天后，生根率可达100％。
(6)当生根的旱半夏组培苗生长至3-5cm，根数5根以上时，移栽入由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成的基质中培养，定期肥水管理，旱半夏长势良好，成活率可达90％以上。
实施例4(以旱半夏块茎为外植体得出碳源浓度影响的结果)：
先用旱半夏块茎愈伤分化得到无菌苗，然后以其愈伤块为外植体诱导坯性愈伤组织。
(1)旱半夏萌发无菌苗的方法为：将旱半夏块茎用75％的酒精浸泡45s，再用0.1％的升汞消毒15min，最后使用无菌水冲洗5次，将其切成5mm大小的小块，接种在MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L培养基上得到愈伤组织后，移至MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L使其分化，分化的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)后使其在MS培养基上继续生长。在温度为25℃，光照2000Lx下培养30天之后，即可得到旱半夏无菌苗。
(2)以步骤(1)的的旱半夏愈伤块为外植体直接接入到MS添加了KT 2.0mg/L、2，4-D 2.0mg/L和蔗糖的培养基中，其中蔗糖的浓度为分别为15，30，45克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在温度25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养，诱导旱半夏产生愈伤组织。结果发现，45g/L时旱半夏块茎的愈伤组织诱导率为85％，在此浓度范围内愈伤组织诱导率与蔗糖浓度成正比。
(3)将步骤(2)中愈伤块诱导形成的胚型愈伤组织接入MS添加KT 3.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为分别为15，30，45克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，即可萌发出芽。蔗糖含量为40g/L时，芽的分化率最高为90％。
(4)将步骤(3)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)，接入MS添加2，4-D、KT和蔗糖的培养基上，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养15天，再次萌发出芽。在MS+KT 1.0mg/L+2.4-D 0.3mg/L的芽分化率分别为98％。
(5)将步骤(4)中萌发出的丛芽切成单芽(包含基部愈伤组织块)转入生根培养基中生根，生根培养基是使用MS添加KT和NAA的培养基，其中蔗糖的浓度为30克每升，利用盐酸和氢氧化钾溶液调整培养基pH5.8，琼脂的用量为10克每升，在温度121摄氏度下灭菌20分钟，冷却培养基，在25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L培养10-15天后，生根率可达100％。
(6)当生根的旱半夏组培苗生长至3-5cm，根数5根以上时，移栽入由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成的基质中培养，定期肥水管理，旱半夏长势良好，成活率可达90％以上。
Claims (4)
1.旱半夏组织培养快速快繁方法，包括以下步骤：
1)配制培养基，基本培养基和其它组培阶段培养基的各组分与每升所含量为：
基本培养基：用MS培养基，附加蔗糖15-45g/L，琼脂10g/L，调节pH5.8；
愈伤组织诱导培养基：MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；
分化培养基：MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；
增殖培养基：MS中添加KT 0.2-2.0mg/L和2，4-D 0.2-2.0mg/L；
生根培养基：MS中添加KT 1.0-2.0mg/L和NAA 0-1.0mg/L；
2)培养无菌苗：将旱半夏块茎进行灭菌处理后，切成5mm左右的小块，将其移至MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L的培养基上产生愈伤，其后转入MS+KT3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L的培养基上使其分化，将产生的丛芽块，再将其切成单芽块移至MS基本培养基上生长得到无菌苗；
3)诱导愈伤组织：在无菌条件下，将步骤2)培养出的无菌苗的叶片、叶柄及愈伤组织块切成5mm大小的组织，接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；
4)分化培养：将步骤3)诱导形成的愈伤组织移至分化培养基上使其分化出芽；
5)增殖培养：将步骤4)生成的丛芽切成单芽(包含基部的愈伤组织块)，接种至增殖培养基上进行增殖培养，使其再分化出芽；
6)生根培养：将步骤5)形成的丛芽块切成单芽(包含基部的愈伤组织块)，接种在生根培养基中进行生根培养；
7)移栽：当步骤6)的生根组培苗生长至3-5cm，根数在5根以上时，移栽入基质中，在温室中培养至成苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)旱半夏萌发无菌苗的方法是选旱半夏块茎，用75％的乙醇浸泡45s后，用0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5次后接种到培养基上，在温度为25℃，光照2000Lx，光周期12h/d下培养30天，得到无菌苗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤7)中栽培基质由腐殖土∶珍珠岩按体积比1∶1配制而成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基本培养基和组培各阶段培养基各组分与每升所含重量为：
1)基本培养基：MS基本培养基，蔗糖15-45g/L，琼脂10g/L，pH5.8；
2)愈伤组织诱导培养基：
以叶片为外植体时，MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L；
以叶柄为外植体时，MS+KT 1.0mg/L+2.4-D 1.0mg/L；
以块茎为外植体时，MS+KT 2.0mg/L+2.4-D 2.0mg/L；
3)分化培养基：MS+KT 3.0mg/L+2.4-D 1.0mg/L；
4)增殖培养基：MS+KT 1.0mg/L+2.4-D 0.3mg/L；
5)生根培养基：MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L。
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