CN115250912A - 一种半夏开放式培养的培养基和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半夏开放式培养的培养基和方法，所述半夏开放式培养的培养基包括：半夏愈伤组织诱导培养基：MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；半夏增殖分化培养基：MS+6‑BA1.5mg/L+TDZ0.1mg/L+NAA0.3mg/L；半夏生根培养基：1/2的MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L；其中，所述MS培养基中均添加了糖30g/L+抑菌剂0.12g/L+琼脂5g/L。该半夏开放式培养的培养基和方法简化了半夏的组培步骤，移栽存活率高达100％。
Description
技术领域
本发明涉及苗木无性繁殖技术领域，特别涉及一种半夏开放式培养的培养基和方法。
背景技术
半夏(Pinellia ternata)是天南星科多年生药用草本植物，是传统名贵中药材。有很高的药用价值，富含丰富的生物碱、氨基酸、挥发油、半夏蛋白。可以止呕化痰、抗炎、抗衰老、抗肿瘤的功效。根据国家食品药品监督管理局的研究表明，在常用的558种中药中，半夏的使用频率居第22位。
我国半夏野生和栽培资源较广泛，主要分布于四川、陕西、甘肃。但半夏对土壤、湿度、光照等环境要求严格。南方半夏生长期高温多雨，容易滋生病虫害，人工栽培产量低。且以传统茎块繁殖的方式种植，品种出现退化问题，导致品质下降。种子繁殖系数大可以防止退化问题，但是在栽植过程中，周期较大。株芽体积小，操作不方便。茎块留作母种的方式使得种源减少，病虫害使得产量严重下降，栽种水肥需求大，成本高。半夏在中医药市场用量大，是常年出口大宗产品。由于过度开采，半夏的野生资源越来越少，传统种植方面增长慢，市场方面需求日益增大。这些因素使得半夏现代化高产种植技术的研究变得刻不容缓。
在已有研究中虽然对植株的开放式组织培养已经有了大量的研究，但是不同植物对不同种类和浓度的抑菌剂的耐受程度不同，对其他植物的开放式培养基无法对半夏适用。现阶段对半夏开放式组织培养仍处于初步探索阶段，还未出现成熟的开放式组织培养技术。因此半夏的开放式组织培养技术的探究具有重要的意义，半夏的开放式培养可以简化半夏的组培步骤，大规模推广半夏的组织培养技术。半夏的组织培养是利用半夏的叶片、茎段株芽等进行快繁体系的建立，以获得大量组培苗，满足市场对种苗的需求，解决半夏品质退化问题。传统的组培方法，步骤繁琐、操作复杂、成本较高，不利于规模化地投入生产中。开放式组织培养可降低生产成本、简化生产环节。
因此，有必要开发一种适合半夏开放式培养的培养基和方法。
发明内容
本发明目的是提供一种半夏开放式培养的培养基和方法，该半夏开放式培养的培养基和方法简化了半夏的组培步骤，移栽存活率高达100％。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种半夏开放式培养的培养基，所述半夏开放式培养的培养基包括：
半夏愈伤组织诱导培养基：MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；
半夏增殖分化培养基：MS+6-BA 1.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA0.3mg/L；
半夏生根培养基：1/2的MS+NAA0.5mg/L+IBA 1.0mg/L；
其中，所述MS培养基中均添加了糖30g/L+抑菌剂0.12g/L+琼脂5g/L。
在本发明的第二方面，提供了一种半夏开放式培养的方法，所述方法采用所述的半夏开放式培养的培养基，包括：
取经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，经灭菌处理，获得外植体；
将所述外植体置于半夏愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，获得愈伤组织；
将所述愈伤组织切成块置于半夏增殖分化培养基中进行增殖分化培养，获得分化出不定芽的外植体；
将所述分化出不定芽的外植体置于半夏生根培养基中进行生根培养，获得生根苗。
进一步地，所述方法还包括：将所述生根苗进行炼苗移栽。
进一步地，所述抑菌剂包括代森锰锌、百菌清和链霉素中的至少一种。
进一步地，所述取经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，经灭菌处理，获得外植体，包括：
采集经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，于流水下冲洗，后浸泡于0.2％多菌灵溶液中并置于摇床上振荡，后用清水冲洗以洗去多菌灵溶液，获得已处理的外植体；
于超净工作台上，将所述已处理的外植体加入10％的次氯酸钠，后用酒精冲洗40-50s，再用无菌水冲洗去酒精。
进一步地，所述诱导培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为15-20d。
进一步地，所述增殖分化培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为20-30d。
进一步地，所述生根培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为15-25d。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种半夏开放式培养的培养基和方法，，该半夏开放式培养的培养基和方法简化了半夏的组培步骤，移栽存活率高，具体地，本发明人通过大量的创新性探索发现：
(1)在半夏的开放式组培中，抑菌剂的最佳浓度为0.12g/L。当抑菌剂浓度为0.1g/L 时抑菌效果不明显，出现大量细菌污染。当抑菌剂浓度提高到0.2g/L时，出现极个别污染均为外植体生长状态较弱，内生菌大量繁殖所造成，除此之外无外植体污染和培养基污染。当抑菌剂浓度为0.12g/L时，抑菌剂效果较好，既减少污染，又降低了毒害作用。
(2)对半夏愈伤组织诱导效果最好的培养基为：
MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；IAA浓度为0.2mg/L诱导效果最好，愈伤组织的生长量最大，生长状态最好。当IAA浓度降低时诱导效果不明显，当IAA浓度升高后，对愈伤组织的诱导效果减弱。
(3)半夏增殖分化培养基：MS+6-BA 1.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA0.3mg/L；
在对半夏愈伤组织分化的过程中，NAA均对其分化有促进作用，但在NAA浓度0.1mg/L 时对愈伤分化的促进作用较弱，当浓度为0.5mg/L时，由于激素浓度过高，而使其促进作用减弱，只有当浓度为0.3mg/L是愈伤组织分化出的丛生芽生长量最大，生长状态最好。分化率为96.30％，平均有效丛生芽数为9.22。
(4)半夏生根培养基：1/2的MS+NAA0.5mg/L+IBA 1.0mg/L；
在半夏生根培养的过程中，IBA的浓度过低过高都会抑制其根系的分化，只有当IBA 浓度为1.0mg/L时其根的生长状态最好，生根率为90％，平均有效生根数为30.7％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为不同抑菌剂浓度对半夏愈伤组织诱导的影响；其中，A、B、C为抑菌剂浓度为0.1mg/L时愈伤组织的生长状况；D、E、F为抑菌剂浓度为0.12mg/L时愈伤组织的生长状况；G、H、I为抑菌剂浓度为0.2mg/L时愈伤组织的生长状况；
图2为半夏愈伤诱导生长情况；其中，A：半夏第五天毒害情况；B：半夏第十天毒害情况；C：半夏第十五天毒害情况：D：半夏第五天愈伤组织诱导情况；E：半夏第十天愈伤组织诱导情况；F：半夏第十五天愈伤组织诱导情况：G：半夏第五天污染情况；H：半夏第十天污染情况；I：半夏第十五天污染情况；
图3为不同处理诱导30d后愈伤组织生长情况比较；其中，A为基础培养基 +NAA0.1mg/L；B：基础培养基+NAA0.2mg/L；C：基础培养基+NAA0.3mg/L愈伤组织生长较好，颜色呈浅绿色，质地紧密；D：2，4-D浓度为0.1mg/L；E：2，4-D浓度为0.2mg/L； F：2，4-D浓度为0.3mg/L时出现严重的抑制作用；G：基础培养基+IAA0.1mg/L处理；H：基础培养基+IAA0.2mg/L处理中(如图H)愈伤组织生长量最大，且质地紧密，开始出现芽点，生长状态最好；I：基础培养基+IAA0.3mg/L处理；J：基础培养基 (MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L)；
图4为半夏增殖分化情况；其中，A为NAA浓度为0.1mg/L时半夏分化情况；B为NAA浓度为0.3mg/L时半夏的分化情况；C为NAA浓度为0.5mg/L时半夏分化情况；D为未添加NAA时半夏的分化情况。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种半夏开放式培养的培养基进行详细说明。
1.实验材料
选取宜宾学院临港校区3楼阳台上生长状态良好的的半夏叶片和茎段。
2.实验药品
MS培养基、琼脂粉、蔗糖、次氯酸钠、75％酒精、代森锰锌、百菌清、链霉素、多菌灵、NAA(奈乙酸)、6-BA(6-苄基嘌呤)、TDZ(噻苯隆)、IAA(吲哚乙酸)、2，4-D (2，4二氯苯氧乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、无菌水。
3.实验仪器
电子天平、烧杯、移液管、移液枪，培养皿、摇床、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、超净工作台、镊子、解剖刀。
4.仪器准备
提前将倒培养基所用的培养瓶、培养皿、滤纸等用高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌20min，后将灭菌后的培养瓶放入烘箱中烘干水分。
超净工作台提前打开紫外灯灭菌。
配制75％的酒精溶液和10％的次氯酸钠溶液。
5、效果评价
愈伤组织诱导情况检测主要检测其诱导率，污染率、成苗率以及外植体的平均芽点数。
诱导率(％)＝启动分化的外殖体个数/接种外殖体个数×100％；
污染率(％)＝污染外殖体个数/接种外殖体个数×100％；
死亡率(％)＝失绿死亡的外殖体个数/接种外殖体个数×100％；
分化率(％)＝分化出丛生芽的外殖体个数/接种外殖体个数×100％；
生根率(％)＝诱导生根的外殖体个数/接种外殖体个数×100％。
利用Microsoft Excel 2016进行数据处理和分析。
实施例1、一种半夏开放式培养的培养基和方法
1、本发明实施例提供一种半夏开放式培养的培养基，所述半夏开放式培养的培养基包括：
半夏愈伤组织诱导培养基：MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；
半夏增殖分化培养基：MS+6-BA 1.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA0.3mg/L；
半夏生根培养基：1/2的MS+NAA0.5mg/L+IBA 1.0mg/L；
其中，所述MS培养基中均添加了糖30g/L+抑菌剂0.12g/L+琼脂5g/L。所述抑菌剂为代森锰锌。
2、半夏开放式培养的方法，所述方法包括：
步骤S1、取经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，经灭菌处理，获得外植体；具体地：
采集实验室经炼苗生长后的半夏植株，取适量的叶片和叶柄，将其放入锥形瓶中，并放置于流水下冲洗30min以上。配置0.2％多菌灵溶液，浸泡外植体并放置于摇床上振荡20min。再次用清水冲洗，洗去多菌灵溶液。在超净工作台上，将已处理的外植体放入广口瓶中，加入10％的次氯酸钠，摇晃6min，再用酒精冲洗45s，最后用无菌水冲洗去酒精。
打开超净工作台中的接种器具加热器，加热接种所需的镊子及刀具，使其无菌。将实验所需的用具摆放在合适的位置。接种操作时佩戴手套并用75％的酒精擦拭桌面并喷洒在周围空气中，最后喷洗双手。用冷却后的刀具及镊子将叶片切成边长为5-10mm大小的正方形，茎段切成10mm左右长短。将外植体材料转入培养瓶中。整个操作过程避免手臂从外植体上方经过，避免手碰触组培瓶盖内侧及培养皿，以防微生物污染。操作过程中应当及时更换滤纸，及时加热刀具镊子，以至所有外植体接种完成。
实验期间管理：实验温度控制在25℃左右，光照强度控制在2000～2500lx实验期间对培养瓶中的生长情况进行定期监控，及时处理污染的外殖体，以免造成更大的损失。控制实验室的温度和光照，进一步抑制细菌的繁殖生长。
步骤S2、将所述外植体置于半夏愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，获得愈伤组织；
步骤S3、将所述愈伤组织切成块置于半夏增殖分化培养基中进行增殖分化培养，获得分化出不定芽的外植体；将以诱导的愈伤组织接种到增殖分化的培养基中诱导，增殖培养 30天观察情况。
步骤S4、将所述分化出不定芽的外植体置于半夏生根培养基中进行生根培养，获得生根苗；
步骤S5、将所述生根苗进行炼苗移栽。具体地：当组织培养实验结束后，开盖进行炼苗，炼苗结束后用清水清洗根部残余培养基，并进行数据记录后将苗移栽至基质中。温度控制在20～25℃。相对湿度为70％。将清洗干净的生根苗移栽进提前配置好的基质土中，加盖5d保持土壤湿度为70％，5d后打开盖子通风炼苗15d后统计其移栽成功率为100％。
对比例1
该对比例中，抑菌剂的浓度替换为0.1mg/L，其他步骤均同实施例1。
对比例2
该对比例中，抑菌剂的浓度替换为0.2mg/L，其他步骤均同实施例1。
对比例3
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例4
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+NAA0.2mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例5
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+NAA0.3mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例6
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+2,4-D0.1mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例7
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+2,4-D0.2mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例8
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+2,4-D0.3mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例9
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.1mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例10
该对比例中，半夏愈伤组织诱导培养基为 MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L+糖30g/L+抑菌剂+琼脂5g/L，其他步骤均同实施例1。
对比例11
该对比例中，半夏增殖分化培养基中NAA的浓度为0，其他步骤均同实施例1。
对比例12
该对比例中，半夏增殖分化培养基中NAA的浓度为0.1mg/ml，其他步骤均同实施例1。
对比例13
该对比例中，半夏增殖分化培养基中NAA的浓度为0.5mg/ml，其他步骤均同实施例1。
对比例14
该对比例中，半夏生根培养基中IBA的浓度为0mg/ml，其他步骤均同实施例1。
对比例15
该对比例中，半夏生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/ml，其他步骤均同实施例1。
对比例16
该对比例中，半夏生根培养基中IBA的浓度为1.5mg/ml，其他步骤均同实施例1。
实验例1、抑菌剂效果分析
统计实施例1、对比例1和对比例2中不同的抑菌浓度对对半夏愈伤组织诱导的影响，结果如图1和表1所示。
表1-不同抑菌剂浓度对半夏愈伤组织诱导的影响
注：表中数据相加不为1是因为部分外植体虽被污染但仍产生了愈伤组织
由图1和表1可知：
当抑菌剂浓度为0.1mg/L时，半夏的开放式培养出现大量污染，其污染率为50.7％，培养基中出现大量细菌污染，菌落呈乳白色或淡黄色粘液状以及浑浊的水渍状(如图1A、B 所示)，少量培养基出现真菌污染。抑菌剂对外植体的毒害作用较弱，个别外植体边缘出现泛黄干枯的现象但仍可诱导出愈伤组织(如图1A所示)几乎未出现失绿死亡的现象，死亡率仅为2％。愈伤组织生长状态良好，5-7d便开始启动形成愈伤，叶片卷曲翘起出现黄绿色凸起，茎段两端开始膨大，愈伤组织的诱导率为64％。当抑菌剂浓度为0.2mg/L时，未出现培养基污染，仅有极个别外植体污染，该污染出现的原因为抑菌剂浓度过高，对外植体产生毒害，使外植体生理状态变弱，内生菌大量繁殖(如图H所示)。半夏外植体在接种第二天开始便出现叶片失绿泛黄的现象，在接种5d后出现大量叶片失绿死亡的现象(如图1G所示)该处理的外植体死亡率高达百分之30％，其余外植体虽未失绿死亡，但生长状态弱，不能启动愈伤，未启动率高达29.2％。在接种10d后叶片中脉两端形成愈伤，茎段两端膨大形成浅绿色愈伤。由于受到毒害作用，愈伤的诱导出现明显的滞后，且生长状态弱的外植体在启动愈伤后，生长停滞，愈伤较小且不再继续膨大。诱导率仅为38.5％。当抑菌剂浓度为0.12mg/L时，外植体边缘开始失绿出现白边，生长较弱的茎段变黄，极个别外植体出现失绿死亡的现象，死亡率仅为5.3％。边缘变白的叶片在接种5d后仍可从中脉两端启动愈伤组织，愈伤组织的诱导率为55.7％。且愈伤组织呈浅绿色、致密、生长状态良好。培养基和外植体仍然出现污染，但污染率相对抑菌剂浓度为0.1mg/L的处理较少。由统计数据结果分析所示：在三组处理中抑菌剂浓度为0.12mg/L的处理生长情况最好，未出现严重污染，且毒害作用较弱，故在进一步开放式实验中抑菌剂的浓度宜采用0.12mg/L。
实验例2、生长素诱导结果分析
统计实施例1、对比例3-对比例10中诱导结果如图2-3和表2所示。
表2半夏愈伤生长情况分析
由图2和表2可知：
对半夏诱导培养的生长情况进行观察，在半夏生长5d后，叶片受到抑菌剂的毒害作用开始出现失绿白化的现象。茎段两端开始泛白，生长状态弱的茎段开始失绿泛黄，受抑菌剂的毒害严重，出现失绿死亡的现象。在半夏生长10d后，外植体的毒害情况加重，叶片边缘白化面积扩大，叶片边缘变黑焦枯。在半夏生长15d后，毒害较严重的半夏停滞生长，毒害较弱的外植体，未失绿部分仍可诱导出愈伤。
在半夏生长5d后，状态良好的外植体(图2D)已经开始启动愈伤组织。其中叶片开始卷曲膨大并从中脉两段开始启动愈伤，出现黄绿色突起。茎段两端开始膨大形成愈伤。其中叶片启动愈伤最早的为处理5(2，4-D0.2mg/L)茎段启动愈伤最早的处理为处理7(IAA0.1mg/L)。在半夏生长10d后，叶片开始变形，叶片边缘开始出现浅绿色突起，形成小球状愈伤。茎段两端的膨大体积增大。在半夏生长15d后，愈伤组织的生长量增大，愈伤体积变大，生长致密。在不同生长素种类及浓度的9组处理中，NAA、2，4-D六组处理的愈伤生长情况较弱，无大量愈伤组织产生且受到的毒害与污染严重。IAA对半夏外植体愈伤组织诱导情况较好，其中处理8(即IAA0.2mg/L)的愈伤相较于其他处理生长状态最好。叶片出现大量愈伤，且颜色为浅绿色、愈伤组织质地紧密。茎段两端膨大，愈伤呈黄绿色，生长状态良好。当IAA浓度为0.3mg/L时，愈伤组织生长状态较弱，已启动的愈伤较小且为黄绿色，外植体受毒害作用严重，毒害后的外植体虽仍能启动愈伤，但相对浓度为0.2mg/L的生长状态弱，出现的愈伤松散。处理10为空白组，该处理只添加分裂素，未添加生长素，外植体启动诱导较多，但叶片启动的愈伤组织偏白，茎段两端的愈伤组织呈黄白色，半透明状。
在半夏生长5d开始出现外植体污染的情况，其中茎段污染较严重，其主要污染类型为细菌污染(图2G)，出现两个真菌污染。在半夏生长10d后开始出现大量培养基污染，其中处理5(2，4-D0.2mg/L)出现的培养基污染最多。在15d后，除已污染的外植体和培养基污染情况加重外(图2I)，无新的污染出现。
由图3可知，在外植体诱导30d后对愈伤组织的生长进行比较，在三种生长素的诱导中，NAA和2，4-D的处理中，外植体的愈伤生长量较小，除NAA0.3mg/L(如图C)的处理中，愈伤组织生长较好，颜色呈浅绿色，质地紧密，其他外植体状态较弱，呈黄绿色，质地疏松，2，4-D三组处理中，生长状态整体较弱，当浓度为0.3mg/L时出现严重的抑制作用(如图F)。IAA处理的外植体生长状态最好，其中IAA0.2mg/L处理中(如图H)愈伤组织生长量最大，且质地紧密，开始出现芽点，生长状态最好。IAA浓度降低或升高，对半夏外植体的诱导作用均会减弱，故当生长素采取IAA且浓度为0.2mg/L时外植体的诱导状态最好。
实验例3、半夏愈伤组织增殖分化结果分析
统计实施例1、对比例11-对比例13中增殖培养30天观察情况，诱导增殖分化结果如图4和表3所示。
表3不同NAA浓度对半夏愈伤组织分化的影响
注：有效芽为大于1cm的丛生芽；+：分化情况较差，丛生芽数量较少，丛生芽生长状态较弱。++丛生芽分化较多，分化量大；+++丛生芽生长量大，分化芽粗壮，叶片生长状态良好
由表3和图4可知：
将半夏愈伤进行分化培养，在培养10d后，生长状态良好的外植体表面出现芽点，形成小芽，生长状态较差的外植体丛生芽的分化出现滞后现象。在外植体生长20d后，出现大量丛生苗，在培养30d后丛生苗生长出完整的叶片。在30d对愈伤组织分化情况进行统计，当NAA浓度为0.1mg/L时，愈伤组织颜色偏黄，诱导出的有效丛生芽较少。将NAA 浓度提升为0.3mg/L时，丛生苗的生长量明显增加，且芽生长状态最好，出现大量完整的叶片(图4B)，分化率以及平均有效芽数均为最高，分别为96.30％、9.22个。当NAA的浓度升高到0.5mg/L时，丛生芽状态较NAA浓度为0.3mg/L时弱，丛生芽生长较矮且叶片发育不完全，分化率和平均有效芽数也出现下降，但相对于未添加NAA的空白组而言，仍然对丛生芽的分化具有促进作用。故NAA对半夏愈伤组织分化的最佳浓度为0.3mg/L。
实验例4、半夏生根培养结果分析
统计实施例1、对比例14-对比例16中生根情况结果如表4所示。
表4不同浓度IBA对半夏生根的影响
注：根长大于1cm的根为有效根
由表4可知：
将分化出不定芽的外植体转接到生根培养基上进行培养，并记录数据。半夏外植体在第10d开始形成白色凸起，20d后形成明显须根，在培养30d后对半夏生根情况进行统计。当IBA浓度为0.5mg/L时，半夏的呈浅绿色且根长较短，但先较与空白组，其生根率和有效生根数均降低，可以推测少量的IBA可以诱导半夏生长出粗壮的颜色呈浅绿色的须根，但对半夏生根率以及生根数有所抑制。当IBA的浓度为1.0mg/L时，半夏根系的生长量最大生根率最高为90％，平均有效生根数达到30.7根，是四组处理中生长状态最好的一组。当IBA浓度为1.5mg/L时，半夏的根系生长出现了明显抑制生根率与平均有效生根数与空白组相比均降低。由此可知IBA浓度为1.0mg/L是，半夏的根系生长情况最好。
综上可知：
本实验采用三种不同浓度的抑菌剂对半夏进行开放式组织培养，其结果表明：当抑菌剂浓度为0.1g/L时抑菌效果不明显，出现大量细菌污染。当抑菌剂浓度提高到0.2g/L时，出现极个别污染均为外植体生长状态较弱，内生菌大量繁殖所造成，除此之外无外植体污染和培养基污染。当抑菌剂浓度为0.12g/L时，抑菌剂效果较好，既减少污染，又降低了毒害作用。在使用不同的生长素诱导愈伤组织的实验中，实验结果表明：2，4-D和NAA的诱导效果较差，2，4-D浓度为0.3mg/L时出现明显的抑制效果。IAA的诱导效果最好，其中浓度为0.2mg/L的处理中，愈伤组织的生长量最大，生长状态最好。当IAA浓度降低时诱导效果不明显，当IAA浓度升高后，对愈伤组织的诱导效果减弱。在对半夏愈伤组织分化的过程中，NAA均对其分化有促进作用，但在NAA浓度0.1mg/L时对愈伤分化的促进作用较弱，当浓度为0.5mg/L时，由于激素浓度过高，而使其促进作用减弱，只有当浓度为 0.3mg/L是愈伤组织分化出的丛生芽生长量最大，生长状态最好。分化率为96.30％，平均有效丛生芽数为9.22。在半夏生根培养的过程中，IBA的浓度过低过高都会抑制其根系的分化，只有当IBA浓度为1.0mg/L时其根的生长状态最好，生根率为90％，平均有效生根数为30.7％。
综上所述：在半夏的开放式组培中，抑菌剂的最佳浓度为0.12g/L；对半夏愈伤组织诱导效果最好的培养基为MS+6-BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；对半夏愈伤组织增殖分化的最佳培养基为MS+6-BA1.5mg/L+TDZ0.1mg/L+NAA0.3mg/L；半夏生根培养中的最佳培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种半夏开放式培养的培养基，其特征在于，所述半夏开放式培养的培养基包括：
半夏愈伤组织诱导培养基：MS+6BA1.5mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.2mg/L；
半夏增殖分化培养基：MS+6-BA 1.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+NAA0.3mg/L；
半夏生根培养基：1/2的MS+NAA0.5mg/L+IBA 1.0mg/L；
其中，所述MS培养基中均添加了糖30g/L+抑菌剂0.12g/L+琼脂5g/L。
2.一种半夏开放式培养的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的半夏开放式培养的培养基，包括：
取经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，经灭菌处理，获得外植体；
将所述外植体置于半夏愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，获得愈伤组织；
将所述愈伤组织切成块置于半夏增殖分化培养基中进行增殖分化培养，获得分化出不定芽的外植体；
将所述分化出不定芽的外植体置于半夏生根培养基中进行生根培养，获得生根苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述生根苗进行炼苗移栽。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂包括代森锰锌、百菌清和链霉素中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述取经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，经灭菌处理，获得外植体，包括：
采集经炼苗生长后的半夏植株的叶片和叶柄，于流水下冲洗，后浸泡于0.2％多菌灵溶液中并置于摇床上振荡，后用清水冲洗以洗去多菌灵溶液，获得已处理的外植体；
于超净工作台上，将所述已处理的外植体加入10％的次氯酸钠，后用酒精冲洗40-50s，再用无菌水冲洗去酒精。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为15-20d。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述增殖分化培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为20-30d。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生根培养的条件为：培养温度为23-27℃，培养时间为15-25d。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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