CN102805035A - 结球甘蓝组织培养方法 - Google Patents

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申志彬
申志恒
王僧虎
石晓云
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Abstract

本发明属于组织培养,特别是指一种结球甘蓝组织培养方法。包括无菌苗的培养、诱导培养、增殖培养、生根培养、再生苗的移植等工艺步骤,本发明解决了现有技术存在的不利于结球甘蓝组培苗的继代培养、长期保存及生根移栽利用等问题,具有采用本方法在结球甘蓝诱导培养基上子叶可长出愈伤组织,胚轴可直接分化不定芽;组培苗增殖倍数3.8-4.6;组培苗生长势强,玻璃化苗数少,增殖率高;组培苗生根率可达100%等优点。

Description

结球甘蓝组织培养方法
技术领域
本发明属于组织培养,特别是指一种结球甘蓝组织培养方法。
背景技术
结球甘蓝种子昂贵,又具有较长的苗龄期,为提高土地利用率,实践中多采用先育苗然后移栽定植的方法。由于结球甘蓝的幼苗为直根系,须根较少,不利于根部对营养物质和水分的吸收,移栽定植后生长缓慢,不耐水涝及根部病害,产量也不高。近年来,随着农业机械化的快速发展,精量播种、穴盘育苗、移栽机定植已引入结球甘蓝栽培,如何消除其上述的栽培缺陷、提高结球甘蓝产量,成为人们亟待解决的技术难题。
目前,结球甘蓝的组织培养技术在甘蓝雄性不育系无性快繁、优异稀有种质资源离体繁殖与保存、游离小孢子培养、细胞及原生质体培养中发挥重要的作用,尤其在结球甘蓝组培苗快速繁殖过程中应用居多。但利用目前结球甘蓝组织培养常用技术及在现有的结球甘蓝组织培养基上长期培养组培苗,容易造成组培苗逐渐衰退、丧失形态发生能力,表现为植株弱小、生长不良、增殖率下降。甚至部分组培苗出现玻璃化现象,嫩茎叶柄叶片出现半透明状和水渍状,使试管苗生长缓慢,且因其嫩茎不易诱导生根,使繁殖系数大为降低,玻璃化组培苗茎叶表面无蜡质,体内的极性化合物水平较高,细胞持水力差,植株蒸腾作用强,无法进行正常移栽。长期以往不利于结球甘蓝组培苗的继代培养、长期保存及生根移栽利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结球甘蓝组织培养方法,以达到提高组培苗增殖率和生根率的目的。
本发明的整体技术构思是:
结球甘蓝组织培养方法,包括如下工艺步骤:
A、无菌苗的培养:将去杂后选出的优质结球甘蓝种子消毒,将消毒后的种子接种于MS培养基中进行暗培养后制成无菌苗,按照48ml-52ml培养基接种8-10颗种子的接种量接种,培养温度22℃-26℃,培养湿度70%-80%,培养周期9-12天;
B、诱导培养:将暗培养后的无菌苗子叶切成4mm×4mm的块,将胚轴切成3.6-4.2 mm,接种在诱导分化培养基上进行诱导培养,观察外植体在诱导培养过程中的变化和不定芽的诱导情况;诱导分化培养基的组成为:
MS+6-BA 2.0-3.0mg/L,NAA 0.1-0.2mg/L,蔗糖 25-30g/L,琼脂 6.5-7g/L,pH值=5.8;
诱导培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%,培养周期25-35天;
C、增殖培养:将诱导的不定芽接种按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为 48ml-52ml增殖培养基上进行增殖培养制成不定苗,25天继代1次,连续继代3次;
增殖培养培养基的组成为:
MS+6-BA 1.0-2.0mg/L,NAA 0.1-0.2mg/L,蔗糖25-30g/L,琼脂 6.5-7g/L ,pH值=5.8;
增殖培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%;
D、生根培养:将不定苗分切后按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为48ml-52ml生根培养基上进行生根培养,14天后观察生根情况;生根培养培养基的组成为:
1/2MS+NAA 0.1-0.2mg/L或1/2MS+IBA 0.2-0.3mg/L,蔗糖15-20g/L,琼脂5.5-6g/L,pH值=5.8;
生根培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度2200-2500 Lx,光照时间10-12小时/天,培养湿度70%-80%;
E、再生苗的移植:
当甘蓝组培苗产生根系并形成完整植株后,置于温室中炼苗,培养条件为:温度20℃-25℃,3天后将三角瓶或组培瓶的瓶塞打开,7天后取出,洗去根部琼脂,将其栽植于培养介质中,湿度为80%-90%,温度20℃-23℃,14天后定植于土壤进行正常管理。培养介质选用选用无土材质,一般选用蛭石,也可选用按一定比例复配的沙子、珍珠岩等材质,因其属于现有技术,申请人再次不再赘述。
本发明的具体技术方案还有:
步骤A中所述的去杂是将甘蓝种子在流水下冲洗,去掉杂质及灰尘。
选种的方式可以采用多种技术方案,并不影响本发明的实施,其中优选的技术方案是,步骤A中所述的选出优质结球甘蓝种子的步骤为将去杂后的结球甘蓝种子浸泡于水中,沉于水底的为优质结球甘蓝种子。
步骤A中所述的消毒是将选出的优质结球甘蓝种子先用质量百分比为70%的酒精浸泡30 秒,再用质量百分比为0.1%的氯化汞消毒8分钟,然后无菌水冲洗3-4次。
为进一步增强培养的效果,优选的技术方案是,步骤A-D中所述的暗培养、诱导培养、增殖培养、生根培养过程中培养室每周在外界空气质量良好情况下进行3-4小时短时通风。上述短时通风技术手段的采用并不影响本发明的实现。
    本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于:
经实验表明,采用本发明的方法在结球甘蓝诱导培养基上子叶可长出愈伤组织,胚轴可直接分化不定芽;组培苗增殖倍数3.8-4.6;组培苗生长势强,玻璃化苗数少,增殖率高;组培苗生根率可达100%。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述,但不作为对本发明的限定,本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准,任何依据本说明书所作出的等效技术手段替换,均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
结球甘蓝组织培养方法,包括如下工艺步骤:
A、无菌苗的培养:将去杂后选出的优质结球甘蓝种子消毒,将消毒后的种子接种于MS培养基中进行暗培养后制成无菌苗,按照48ml培养基接种8颗种子的接种量接种,培养温度22℃,培养湿度70%,培养周期9-12天;
B、诱导培养:将暗培养后的无菌苗子叶切成4mm×4mm的块,将胚轴切成3.6mm,接种在诱导分化培养基上进行诱导培养,观察外植体在诱导培养过程中的变化和不定芽的诱导情况;诱导分化培养基的组成为:
MS+6-BA 2.0mg/L,NAA 0.1mg/L,蔗糖 25g/L,琼脂 6.5g/L,pH值=5.8;
诱导培养的培养条件为:温度24℃,光照强度1000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%,培养周期25-35天;
C、增殖培养:将诱导的不定芽接种按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为 48ml增殖培养基上进行增殖培养制成不定苗,25天继代1次,连续继代3次;
增殖培养培养基的组成为:
MS+6-BA 1.0mg/L,NAA 0.1mg/L,蔗糖 25g/L,琼脂 6.5g/L,pH值=5.8;
增殖培养的培养条件为:温度24℃,光照强度1000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%;
D、生根培养:将不定苗分切后按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为48ml-52ml生根培养基上进行生根培养,14天后观察生根情况;生根培养培养基的组成为:
1/2MS+NAA 0.1mg/L或1/2MS+IBA 0.2mg/L,蔗糖15g/L,琼脂5.5g/L,pH值=5.8;
生根培养的培养条件为:温度24℃,光照强度2200Lx,光照时间10小时/天,培养湿度70%;
E、再生苗的移植:
生根20天左右,当甘蓝组培苗产生根系并形成完整植株后,置于温室中炼苗,培养条件为:温度20℃,3天后将三角瓶或组培瓶的瓶塞打开,7天后取出,洗去根部琼脂,将其栽植于培养介质中,培养介质选用蛭石,湿度为80%,温度20℃,14天后定植于土壤进行正常管理。
实施结果:在结球甘蓝诱导培养基上子叶可长出愈伤组织,胚轴可直接分化不定芽;组培苗增殖倍数3.8;组培苗生长势强,玻璃化苗数少,增殖率高;组培苗生根率可达100%。
实施例2
结球甘蓝组织培养方法,包括如下工艺步骤:
A、无菌苗的培养:将去杂后选出的优质结球甘蓝种子消毒,将消毒后的种子接种于MS培养基中进行暗培养后制成无菌苗,按照52ml培养基接种10颗种子的接种量接种,培养温度26℃,培养湿度80%,培养周期9-12天;
B、诱导培养:将无菌苗的子叶切成4mm×4mm的块,将胚轴切成4.2 mm,接种在诱导分化培养基上进行诱导培养,观察外植体在诱导培养过程中的变化和不定芽的诱导情况;诱导分化培养基的组成为:
MS+6-BA  3.0mg/L,NAA  0.2mg/L ,蔗糖 30g/L,琼脂 7g/L,pH值=5.8;
诱导培养的培养条件为:温度26℃,光照强度2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度80%,培养周期25-35天;
C、增殖培养:将诱导的不定芽接种按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为52ml增殖培养基上进行增殖培养制成不定苗,25天继代1次,连续继代3次;
增殖培养培养基的组成为:
MS+6-BA 2.0mg/L,NAA 0.2mg/L ,蔗糖 30g/L,琼脂 7g/L,pH值=5.8;
增殖培养的培养条件为:温度24-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70-80%;
D、生根培养:将不定苗分切后按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为48ml-52ml生根培养基上进行生根培养,14天后观察生根情况;生根培养培养基的组成为:
1/2MS+NAA 0.2mg/L或1/2MS+IBA 0.3mg/L,蔗糖20g/L,琼脂6g/L,pH值=5.8;
生根培养的培养条件为:温度26℃,光照强度2500 Lx,光照时间12 hr/d,培养湿度80%;
E、再生苗的移植:
当甘蓝组培苗产生根系并形成完整植株后,置于温室中炼苗,培养条件为:温度25℃,3天后将三角瓶或组培瓶的瓶塞打开,7天后取出,洗去根部琼脂,将其栽植于培养介质中,培养介质选用蛭石,湿度为90%,温度23℃,14天后定植于土壤进行正常管理。
其余步骤同实施例1。
实施结果:在结球甘蓝诱导培养基上子叶可长出愈伤组织,胚轴可直接分化不定芽;组培苗增殖倍数4.6;组培苗生长势强,玻璃化苗数少,增殖率高;组培苗生根率可达100%。
实施例3
结球甘蓝组织培养方法,包括如下工艺步骤:
A、无菌苗的培养:将去杂后选出的优质结球甘蓝种子消毒,将消毒后的种子接种于MS培养基中进行暗培养后制成无菌苗,按照50ml培养基接种8-10颗种子的接种量接种,培养温度25℃,培养湿度70%-80%,培养周期9-12天;
B、诱导培养:将暗培养后的无菌苗的子叶切成4mm×4mm的块,将胚轴切成4mm,接种在诱导分化培养基上进行诱导培养,观察外植体在诱导培养过程中的变化和不定芽的诱导情况;诱导分化培养基的组成为:
MS+6-BA 2.5mg/L,NAA 0.15mg/L,蔗糖 28g/L,琼脂7g/L,pH值=5.8;
诱导培养的培养条件为:温度25℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%,培养周期30天;
C、增殖培养:将诱导的不定芽接种按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为 50ml增殖培养基上进行增殖培养制成不定苗,25天继代1次,连续继代3次;
增殖培养培养基的组成为:
MS+6-BA 1.5mg/L,NAA 0.2mg/L,蔗糖28g/L,琼脂7g/L,pH值=5.8;
增殖培养的培养条件为:温度24-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%;
D、生根培养:将不定苗分切后按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为50ml生根培养基上进行生根培养,14天后观察生根情况;生根培养培养基的组成为:
1/2MS+NAA 0.15 mg/L或1/2MS+IBA 0.25 mg/L,蔗糖18g/L,琼脂6g/L ,pH值=5.8;
生根培养的培养条件为:温度25℃,光照强度2200-2500 Lx,光照时间10-12小时/天,培养湿度70%-80%;
E、再生苗的移植:
当甘蓝组培苗产生根系并形成完整植株后,置于温室中炼苗,培养条件为:温度25℃,3天后将三角瓶或组培瓶的瓶塞打开,7天后取出,洗去根部琼脂,将其栽植于培养介质中,湿度为80%-90%,温度20℃-23℃,14天后定植于土壤进行正常管理。
其余内容同实施例1。
实施结果:在结球甘蓝诱导培养基上子叶可长出愈伤组织,胚轴可直接分化不定芽;组培苗增殖倍数4.2;组培苗生长势强,玻璃化苗数少,增殖率高;组培苗生根率可达100%。

Claims (5)

1.结球甘蓝组织培养方法,其特征在于,包括如下工艺步骤:
A、无菌苗的培养:将去杂后选出的优质结球甘蓝种子消毒,将消毒后的种子接种于MS培养基中进行暗培养后制成无菌苗,按照48ml-52ml培养基接种8-10颗种子的接种量接种,培养温度22℃-26℃,培养湿度70%-80%,培养周期9-12天;
B、诱导培养:将暗培养后的无菌苗子叶切成4mm×4mm的块,将胚轴切成3.6-4.2 mm,接种在诱导分化培养基上进行诱导培养,观察外植体在诱导培养过程中的变化和不定芽的诱导情况;诱导分化培养基的组成为:
MS+6-BA 2.0-3.0mg/L,NAA 0.1-0.2mg/L,蔗糖 25-30g/L,琼脂 6.5-7g/L,pH值=5.8;
诱导培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%,培养周期25-35天;
C、增殖培养:将诱导的不定芽接种按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为 48ml-52ml增殖培养基上进行增殖培养制成不定苗,25天继代1次,连续继代3次;
增殖培养培养基的组成为:
MS+6-BA 1.0-2.0mg/L,NAA 0.1-0.2mg/L,蔗糖 25-30g/L,琼脂 6.5-7g/L,pH值=5.8;
增殖培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度1000-2000Lx,光照时间12小时/天,培养湿度70%-80%;
D、生根培养:将不定苗分切后按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为48ml-52ml生根培养基上进行生根培养,14天后观察生根情况;生根培养培养基的组成为:
1/2MS+NAA 0.1-0.2mg/L或1/2MS+IBA 0.2-0.3mg/L ,蔗糖15-20g/L,琼脂5.5-6g/L,pH值=5.8;
生根培养的培养条件为:温度24℃-26℃,光照强度2200-2500Lx,光照时间10-12小时/天,培养湿度70%-80%;
E、再生苗的移植:
当甘蓝组培苗产生根系并形成完整植株后,置于温室中炼苗,炼苗条件为:温度20℃-25℃,3天后将三角瓶或组培瓶的瓶塞打开,7天后取出,洗去根部琼脂,将其栽植于培养介质中,湿度为80%-90%,温度20℃-23℃,14天后定植于土壤进行正常管理。
2.根据权利要求1所述的结球甘蓝组织培养方法,其特征在于,步骤A中所述的去杂是将甘蓝种子在流水下冲洗,去掉杂质及灰尘。
3.根据权利要求2所述的结球甘蓝组织培养方法,其特征在于,步骤A中所述的选出优质结球甘蓝种子的步骤为将去杂后的结球甘蓝种子浸泡于水中,沉于水底的为优质结球甘蓝种子。
4.根据权利要求2所述的结球甘蓝组织培养方法,其特征在于,步骤A中所述的消毒是将选出的优质结球甘蓝种子先用质量百分比为70%的酒精浸泡30 秒,再用质量百分比为0.1%的氯化汞消毒8分钟,然后无菌水冲洗3-4次。
5.根据权利要求1所述的结球甘蓝组织培养方法,其特征在于,步骤A-D中所述的暗培养、诱导培养、增殖培养、生根培养过程中培养室每周在外界空气质量良好情况下进行3-4小时短时通风。
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