CN103583371B - 山杨良种银×山1333的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
山杨良种银×山1333的组织培养方法，它涉及一种植物的培养方法。本发明要解决现有山杨良种银×山1333植株组织培养困难、繁殖系数低、组培生根苗不健壮及移栽成活率低的问题。本发明是按以下步骤完成：一、外植体的采集和前处理；二、外植体的分化培养；三、不定芽的继代增殖培养；四、不定芽的生根培养；五、再生组培苗的炼苗；六、山杨良种银×山1333组培苗出瓶定植后得到容器苗，即得到高度为40cm～50cm的山杨良种银×山1333组培苗的容器苗。本发明应用在植物组织培养领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养方法。
背景技术
杨树是我国北方普遍公认的用材林、防护林和园林绿化的优质速生树种，但是在近半个世纪引选的1000多个品种中，没有适于林区山地用材林造林的品种。而我国是以山地著称于世的国家，山区占国土面积的三分之二以上，因此开展山地杨树新品种推广转化十分必要。东北地区乡土树种中的山杨（Populus davidiana Dode）分布广泛、适应性强、材质优良，适于林区山地用材林的营造。但是其生长速度缓慢，年平均胸径生长仅4mm左右；扦插生根十分困难，繁殖率低；造林难成活，保存率低；心腐严重，20年生山杨心腐率高达70%，因此过去利用山杨造林很少。
黑龙江省林业科学研究所从“六五”到“九五”，主持了《新选杨树用材和绿化品系研究》黑龙江省科技重点项目和《山杨良种选育》国家科技攻关专题，历经二十年，从不同种源，不同杂交组合的1800多个无性系中，选育出了银×山1333（P.alba×P.davidian CL.‘1333’），2010年该品种通过了黑龙江省森工林区林木品种审定委员会组织的良种审定。该良种是适于林区山地营造速生丰产用材林的优质山杨杂交新品种，其干形通直，雄株，不飞絮，干皮白色，抗性强，生长快，材质好，17年生胸径达17.99cm～19.00cm，树高达15.37m～16.60m，单株材积0.87835m3～1.0866m3，是山地杨树用材林、工业原料林、纸浆原料林等速生丰产林和城市园林绿化基地建设不可多得的良种资源。良种与乡土山杨相比较：1、抗逆性高：种源提高10.1%，家系提高14%，无性系提高17%；2、材积生长量实际增益高：种源提高23.46%，家提高系47.2%，无性系提高61.47%；3、木材基本密度高：种源提高5.18%，家系提高6.12%，无性系提高6.61%。山杨良种银×山1333填补了我国北方缺乏山地造林阔叶树速生树种的空白。山杨良种银×山1333均为25年左右的成年树木，许多研究表明，树木性状的表现力在一定生长阶段通常与年龄成正相关，而营养繁殖能力却与年龄成负相关。树木个体一旦达到充分表现其优良性状的年龄时，往往失去了旺盛的营养繁殖能力，这为组织培养提供了依据。山杨良种银×山1333根分蘖能力强，但扦插生根极为困难，这影响了山杨良种银×山1333的规模化繁殖与推广。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有山杨良种银×山1333植株组织培养困难、繁殖系数低、组培生根苗不健壮及移栽成活率低的问题，而提供山杨良种银×山1333的组织培养方法。
本发明山杨良种银×山1333的组织培养方法，是按以下步骤完成：
一、外植体的采集和前处理：将山杨良种银×山1333植株的外植体在流水下冲洗1h～2h后，用质量浓度为70%～75%乙醇溶液对表面进行消毒10s～20s，然后用无菌水冲洗2～3遍，再用0.1%氯化汞消毒2.0min～4.0min后，用无菌水冲洗3～5遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，并对外植体进行处理，得到已消毒的外植体；
二、外植体的分化培养：将步骤一中得到的已消毒的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d，光强2500Lx～3500Lx和湿度70%～80%的条件下培养30d～45d，得到山杨良种银×山1333的不定芽；
三、继代增殖培养：将步骤二中得到的山杨良种银×山1333不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间10h/d～12h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70%～80%的条件下培养得到1.5cm～2.0cm高的山杨良种银×山1333不定芽；
四、不定芽的生根培养：将步骤三得到1.5cm～2.0cm苗高的山杨良种银×山1333不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70%～80%的条件下培养至苗高为4cm～5cm且具有3～5片叶片，即得山杨良种银×山1333再生组培苗；
五、再生组培苗的炼苗：在温室内，将步骤四中得到山杨良种银×山1333再生组培苗置于温室苗床上，在环境温度20℃～25℃，湿度80%～95%，光照强度3500Lx～4500Lx的条件下进行再生组培苗的炼苗，得到山杨良种银×山1333植株；
其中，所述的再生组培苗的炼苗，是按照下述步骤实现的：首先将培养瓶瓶口的覆盖物松开炼苗1d～2d，然后在培养瓶瓶口面积的1/4～1/3没有覆盖物的条件下炼苗1d～2d，最后将培养瓶瓶口的覆盖物全部去除炼苗2d～3d；
六、山杨良种银×山1333组培苗出瓶定植后得到容器苗：将步骤五中得到的山杨良种银×山1333植株从培养瓶中取出，放入清水中洗净根部附着的培养基，将山杨良种银×山1333植株的根系保留1.0cm～1.5cm，用质量浓度为1.00g/L～1.25g/L多菌灵浸泡15min～20min，再用无菌水冲洗3～5遍后移栽到已消毒的育苗基质中在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和遮光率60%～70%的条件下培养3d-5d，然后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和遮光率30%～40%的条件下培养5d～10d；最后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和无遮光的条件下培养，待小苗成活且高度为40cm～50cm后，即得到山杨良种银×山1333组培苗的容器苗。
本发明的有益效果：
本发明利用组织培养技术解决山杨良种银×山1333常规繁殖存在的问题，不仅可以获得性状高度一致的群体，而且大大加快了良种推广的进程，并为遗传改良提供了新的途径。
本发明提供了山杨良种银×山1333的组织培养方法，解决了山杨良种银×山1333植株的组织问题，通过本发明山杨良种银×山1333植株分化培养基进行外植体不定芽分化分化率可达75%～88%，分化系数3.50～4.50；山杨良种银×山1333的继代增殖培养基进行培养可使继代增殖系数为1.5～4.7；山杨良种银×山1333的不定芽生根培养基培养可使生根率达到76.5%以上，生根5～14条，且生长的根多健壮，完整的山杨良种银×山1333再生苗的移栽成活率高达90.5%。
本发明山杨良种银×山1333的组织培养方法，应用山杨良种银×山1333的培养基，培养得到的山杨良种银×山1333再生组织的不定芽分化率、增殖系数高和生根率高，通过培养基获得的山杨良种银×山1333再生组织的试管苗移栽成活率高、组培苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根和新叶萌发快等优点，能够满足商品化、工厂化大规模快速生产山杨良种银×山1333无菌容器苗的需要，具有良好的应用前景。
本发明克服了山杨良种银×山1333母株年龄效应、扦插生根困难、繁殖系数低、组培生根苗根系不健壮，移栽成活率低等问题，能够为商品化、工厂化大规模快速生产山杨良种银×山1333无菌容器苗提供技术支撑，具有十分重要的社会和经济效益。
附图说明
图1为具体实施方式一步骤二中叶片诱导的不定芽的图片；
图2为具体实施方式一步骤二中休眠芽诱导的不定芽的图片；
图3为具体实施方式一步骤三中不定芽的继代增殖培养第30天的山杨良种银×山1333苗的图片；
图4为具体实施方式一步骤四中得到的山杨良种银×山1333再生组培苗的图片；
图5为具体实施方式一步骤四中得到的山杨良种银×山1333再生苗的健壮根系的图片；
图6为具体实施方式一步骤六中移栽到已消毒的基质中第5天的山杨良种银×山1333再生苗的图片；
图7为具体实施方式一步骤六中得到的长至40cm～50cm高度的完整的山杨良种银×山1333容器苗的图片。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式山杨良种银×山1333的组织培养方法，是按以下步骤完成：
一、外植体的采集和前处理：将山杨良种银×山1333植株的外植体在流水下冲洗1h～2h后，用质量浓度为70%～75%乙醇溶液对表面进行消毒10s～20s，然后用无菌水冲洗2～3遍，再用0.1%氯化汞消毒2.0min～4.0min后，用无菌水冲洗3～5遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，并对外植体进行处理，得到已消毒的外植体；
二、外植体的分化培养：将步骤一中得到的已消毒的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d，光强2500Lx～3500Lx和湿度70%～80%的条件下培养30d～45d，得到山杨良种银×山1333的不定芽；
三、继代增殖培养：将步骤二中得到的山杨良种银×山1333不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间10h/d～12h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70%～80%的条件下培养得到1.5cm～2.0cm高的山杨良种银×山1333不定芽；
四、不定芽的生根培养：将步骤三得到1.5cm～2.0cm苗高的山杨良种银×山1333不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70%～80%的条件下培养至苗高为4cm～5cm且具有3～5片叶片，即得山杨良种银×山1333再生组培苗；
五、再生组培苗的炼苗：在温室内，将步骤四中得到山杨良种银×山1333再生组培苗置于温室苗床上，在环境温度20℃～25℃，湿度80%～95%，光照强度3500Lx～4500Lx的条件下进行再生组培苗的炼苗，得到山杨良种银×山1333植株；
其中，所述的再生组培苗的炼苗，是按照下述步骤实现的：首先将培养瓶瓶口的覆盖物松开炼苗1d～2d，然后在培养瓶瓶口面积的1/4～1/3没有覆盖物的条件下炼苗1d～2d，最后将培养瓶瓶口的覆盖物全部去除炼苗2d～3d；
六、山杨良种银×山1333组培苗出瓶定植后得到容器苗：将步骤五中得到的山杨良种银×山1333植株从培养瓶中取出，放入清水中洗净根部附着的培养基，将山杨良种银×山1333植株的根系保留1.0cm～1.5cm，用质量浓度为1.00g/L～1.25g/L多菌灵浸泡15min～20min，再用无菌水冲洗3～5遍后移栽到已消毒的育苗基质中在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和遮光率60%～70%的条件下培养3d-5d，然后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和遮光率30%～40%的条件下培养5d～10d；最后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80%～95%和无遮光的条件下培养，待小苗成活且高度为40cm～50cm后，即得到山杨良种银×山1333组培苗的容器苗。
本实施方式中步骤二中所述的愈伤组织诱导分化培养基是由一种山杨良种银×山1333植株再生基础培养基（YS培养基）和浓度为0.1mg/L～1.5mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0mg/L～0.1mg/L的激动素（KT）组成。
本实施方式步骤三中所述的不定芽继代增殖培养基由YS培养基和0.1mg/L～1.0mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0mg/L～0.05mg/L的萘乙酸（NAA）组成。
本实施方式步骤四中所述的不定芽生根培养基由YS培养基和激素A组成，所述的激素A为0.1mg/L～2.0mg/L的吲哚丁酸（IBA）、0.1mg/L～2.0mg/L的吲哚乙酸（IAA）和0.01mg/L～2.0mg/L的萘乙酸（NAA）中的一种或几种按任意比例组成。
本实施方式山杨良种银×山1333的组织培养方法中所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；
每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为330mg/L～350mg/L的KNO3、390mg/L～410mg/L NH4NO3、90mg/L～100mg/L的CaCl2·2H2O、360mg/L～380mg/L的MgSO4·7H2O、540mg/L～560mg/L的Ca（NO3）2·4H2O、580mg/L～620mg/L的K2SO4和350mg/L～380mg/L KH2PO4组成；
每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；
每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；
每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖15g/L～25g/L、4mg/L～6mg/L的盐酸硫胺素、0.3mg/L～0.6mg/L的烟酸、0.6mg/L～3mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L～110mg/L的肌醇和1mg/L～3mg/L的甘氨酸；
每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.0g/L～6.0g/L。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于，步骤一中所述山杨良种银×山1333植株的外植体为：从健壮的、没有伤口和没有病虫的25年生的山杨良种银×山1333植株上取外植体，每年1～2月份采集山杨良种银×山1333植株带休眠芽的茎段，每年5份采集山杨良种银×山1333植株的叶片，每年5月份采集山杨良种银×山1333植株的带腋芽的茎段。采取山杨良种银×山1333植株的外植体时，应在晴好的天气的中午或下午。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于，步骤一所述的对外植体进行处理是指将休眠芽从茎上剥离，并剥去外面鳞片和最外层叶片，或者将叶片带叶柄和不带叶柄部分分别切割成0.8×0.8cm2～1.2×1.2cm2的正方形，或者将带腋芽的茎段切割成0.5cm～1.5cm。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点在于，步骤一中所述的已消毒的外植体为休眠芽、腋芽、带叶柄叶片或不带叶柄叶片。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于，步骤一中所述的外植体为腋芽。其他与具体实施方式一至四之一相同。
本实施方式外植体为腋芽时，愈伤组织诱导的分化率高到56.2%，启动仅为14天，茎节长达1.2cm。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于，步骤二所述的不定芽分化培养基是由YS培养基和浓度为1.0mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0.1mg/L的激动素（KT）组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/L NH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca（NO3）2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同点在于，步骤二所述的外植体分化培养的培养条件为温度24℃～26℃，光照时间14h/d，光强3000Lx，湿度75～78%，培养时间30d。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同点在于，步骤三中所述的继代增殖培养基是指由YS培养基和0.5mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0.03mg/L的萘乙酸（NAA）组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/L NH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca（NO3）2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L。其他与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一的不同点在于，步骤三所述的继代增殖培养的培养条件为温度24℃～26℃，光照时间12h/d，光强2500Lx，其中为光源为白炽日光灯，湿度75～78%，培养时间35d。其他与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一的不同点在于，步骤四中所述的不定芽生根培养基由YS培养基和激素组成，所述的激素为1.5mg/L的吲哚丁酸（IBA）和0.01mg/L～0.02mg/L的萘乙酸组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/L NH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca（NO3）2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L。其他与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一的不同点在于，步骤四所述的不定芽生根的培养条件为温度24℃～26℃、光照时间13h/d、光强3000Lx、光源为白炽日光灯和湿度75%～78%。其他与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一的不同点在于，步骤五所述的再生组培苗的炼苗，是按照下述步骤实现的：首先将培养瓶瓶口的覆盖物松开炼苗1d～2d，然后在培养瓶瓶口面积的1/4～1/3没有覆盖物的条件下炼苗1d～2d，最后将培养瓶瓶口的覆盖物全部去除炼苗2d～3d；其中，所述的将培养瓶瓶口的覆盖物松开是指将固定培养瓶瓶口的封口膜的橡皮筋松开，培养瓶瓶口的封口膜仍在培养瓶瓶口处。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一的不同点在于，步骤六中所述的育苗基质是指全沙土、全壤土、沙土与壤土体积比1：1的混合基质、沙土与壤土体积比为2：1的混合基质、草炭土与黑土体积比1：1的混合基质、草炭土、黑土与蛭石体积比1：1：1的混合基质或蛭石与壤土体积比为1：1的混合基质，且最上层的蛭石的厚度与混合基质厚度的比为1:（10～12）；
其中，所述的已消毒的育苗基质是将育苗基质在115℃～121℃温度下进行高温消毒20min～30min后即得消毒后的育苗基质。其他与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一的不同点在于，步骤六中所述的育苗基质是蛭石与壤土体积比为1：1的混合基质，且最上层的蛭石的厚度与混合基质厚度的比为1:10；
其中，所述的已消毒的育苗基质是将育苗基质在115℃～121℃温度下进行高温消毒20min～30min后即得消毒后的育苗基质。其他与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一的不同点在于，步骤六中所述的完整的山杨良种银×山1333再生组培苗的炼苗在育苗基质培养过程中每周施用1/2MS营养液补充营养，同时每30d用MS大量元素1000倍稀释液追肥。其他与具体实施方式一至十三之一相同。
通过以下验证实验验证本发明的有益效果：
验证实验一：
本验证试验山杨良种银×山1333的组织培养方法，是按以下步骤完成：
一、外植体的采集和前处理：每年5月份采集带腋芽的茎段，外植体在流水下冲洗1.5h后，用质量浓度为75%乙醇溶液表面消毒15s，然后用无菌水冲洗3遍，再用0.1%氯化汞消毒2.5min，用无菌水冲洗5遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，并对外植体进行处理，将带有腋芽的茎段切割至0.5～1.5cm，得到的已消毒的腋芽外植体；
二、外植体的分化培养：将步骤一中得到的已消毒的腋芽外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，在温度24℃～26℃、光照时间14h/d、光强3000Lx和湿度75%～78%的条件下培养30d，得到山杨良种银×山1333的不定芽；
三、继代增殖培养：将步骤二中得到的山杨良种银×山1333不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中，在温度24℃～26℃、光照时间12h/d，光强2500Lx，光源为白炽日光灯，湿度75%～78%的条件下培养35d，得到1.5cm～2.0cm高的山杨良种银×山1333不定芽；
四、不定芽的生根培养：将步骤三得到1.5cm～2.0cm苗高的山杨良种银×山1333不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中，在温度24℃～26℃、光照时间12h/d、光强3000Lx、光源为白炽日光灯和湿度75%～78%的条件下培养至苗高为4～5cm且具有3～5片叶片，即得完整的山杨良种银×山1333再生苗；
五、再生组培苗的炼苗：在温室内，将步骤四中得到完整的山杨良种银×山1333再生组培苗置于温室苗床上，在环境温度25℃～28℃，湿度80%～95%，光照强度4000Lx的条件下进行再生组培苗的炼苗，得到山杨良种银×山1333植株；
其中，所述的再生组培苗的炼苗，具体过程是按下述实现：首先将培养瓶瓶口的覆盖物松开炼苗1d～2d，然后在培养瓶瓶口面积的1/4～1/3没有覆盖物的条件下炼苗1d～2d，最后将培养瓶瓶口的覆盖物全部去除炼苗2d～3d；其中，所述的将培养瓶瓶口的覆盖物松开是指将固定培养瓶瓶口的封口膜的橡皮筋松开，培养瓶瓶口的封口膜仍在培养瓶瓶口处。
六、山杨良种银×山1333组培苗出瓶定植后得到容器苗：将步骤五中得到的山杨良种银×山1333植株从培养瓶中取出，放入清水中洗净根部附着的培养基，将山杨良种银×山1333植株的根系保留1.0cm～1.5cm，用质量浓度为1.25g/L的多菌灵浸泡15min～20min，再用无菌水冲洗3～5遍后移栽到已消毒的育苗基质中进行：现在昼温21℃～29℃，夜温18℃～21℃，湿度80%～95%，遮光率60%～70%的条件下培养4d，然后在昼温21℃～29℃，夜温18℃～21℃，湿度80%～95%，遮光率30%～40%的条件下培养8d；最后在昼温21℃～29℃，夜温18℃～21℃，湿度80%～95%，无遮光的条件下培养，待小苗成活且高度为40cm～50cm后，得到山杨良种银×山1333组培苗的容器苗。
本验证试验选取的外植体为山杨良种银×山1333植株的腋芽。
本验证试验一种山杨良种银×山1333植株再生培养基的愈伤组织诱导分化培养基由YS培养基和浓度为1.0mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0.1mg/L的激动素（KT）组成。
本验证试验一种山杨良种银×山1333植株再生培养基的继代增殖培养基由YS培养基和0.5mg/L的6-苄基胺基嘌呤（6-BA）和0.03mg/L的萘乙酸（NAA）组成。
本验证试验一种山杨良种银×山1333植株再生培养基的不定芽生根培养基由YS培养基和激素组成，所述的激素为1.5mg/L的吲哚丁酸和0.01mg/L的萘乙酸（NAA）组成。
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/L NH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca（NO3）2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L。
本验证试验中步骤六中所述的育苗基质为蛭石与壤土体积比为1：1的混合基质，且最上层的蛭石的厚度与混合基质厚度的比为1:10；其中所述的已消毒的育苗基质是将育苗基质在115℃～121℃温度下进行高温消毒20min～30min后即得消毒后的育苗基质。。
本验证试验步骤六中所述的完整的山杨良种银×山1333再生组培苗的炼苗在育苗基质培养过程中每周施用1/2MS营养液补充营养，同时每30d用MS大量元素1000倍稀释液追肥。
本验证试验中山杨良种银×山1333愈伤组织诱导分化培养基培养的愈伤组织分化可达88%，分化系数为4.23；山杨良种银×山1333的继代增殖基培养可使继代增殖系数为4.7；山杨良种银×山1333的不定芽生根培养基培养可使生根率达到87.5%，生根5～11条，移栽成活率高于90.5%。
本验证试验克服了山杨良种银×山1333母株年龄效应、扦插生根困难、繁殖系数低、组培生根苗根系不健壮，移栽成活率低等问题，能够为商品化、工厂化大规模快速生产山杨良种银×山1333无菌容器苗提供技术支撑，具有十分重要的社会和经济效益。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
Claims (2)
1.山杨良种银×山1333的组织培养方法，其特征在于山杨良种银×山1333的组织培养方法，是按以下步骤完成：
一、外植体的采集和前处理：将山杨良种银×山1333植株的外植体在流水下冲洗1h～2h后，用质量浓度为70％～75％乙醇溶液对表面进行消毒10s～20s，然后用无菌水冲洗2～3遍，再用0.1％氯化汞消毒2.0min～4.0min后，用无菌水冲洗3～5遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，并对外植体进行处理，得到已消毒的外植体；
二、外植体的分化培养：将步骤一中得到的已消毒的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d，光强2500Lx～3500Lx和湿度70％～80％的条件下培养30d～45d，得到山杨良种银×山1333的不定芽；
三、继代增殖培养：将步骤二中得到的山杨良种银×山1333不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间10h/d～12h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70％～80％的条件下培养得到1.5cm～2.0cm高的山杨良种银×山1333不定芽；
四、不定芽的生根培养：将步骤三得到的1.5cm～2.0cm高的山杨良种银×山1333不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中，在温度23℃～26℃、光照时间12h/d～14h/d、光强2500Lx～3500Lx、光源为白炽日光灯和湿度70％～80％的条件下培养至苗高为4cm～5cm且具有3～5片叶片，即得山杨良种银×山1333再生组培苗；
五、再生组培苗的炼苗：在温室内，将步骤四中得到的山杨良种银×山1333再生组培苗置于温室苗床上，在环境温度20℃～25℃，湿度80％～95％，光照强度3500Lx～4500Lx的条件下进行再生组培苗的炼苗，得到山杨良种银×山1333植株；
其中，所述的再生组培苗的炼苗，是按照下述步骤实现的：首先将培养瓶瓶口的覆盖物松开炼苗1d～2d，然后在培养瓶瓶口面积的1/4～1/3没有覆盖物的条件下炼苗1d～2d，最后将培养瓶瓶口的覆盖物全部去除炼苗2d～3d；
六、山杨良种银×山1333组培苗出瓶定植后得到容器苗：将步骤五中得到的山杨良种银×山1333植株从培养瓶中取出，放入清水中洗净根部附着的培养基，将山杨良种银×山1333植株的根系保留1.0cm～1.5cm，用质量浓度为1.00g/L～1.25g/L多菌灵浸泡15min～20min，再用无菌水冲洗3～5遍后移栽到已消毒的育苗基质中，在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80％～95％和遮光率60％～70％的条件下培养3d-5d，然后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80％～95％和遮光率30％～40％的条件下培养5d～10d；最后在昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80％～95％和无遮光的条件下培养，待小苗成活且高度为40cm～50cm后，即得到山杨良种银×山1333组培苗的容器苗；
步骤二所述的不定芽分化培养基是由YS培养基和浓度为1.0mg/L的6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L的激动素组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/LNH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca(NO3)2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L；
步骤一中所述山杨良种银×山1333植株的外植体为：从健壮的、没有伤口和没有病虫的25年生的山杨良种银×山1333植株上取外植体，每年1～2月份采集山杨良种银×山1333植株带休眠芽的茎段，每年5月份采集山杨良种银×山1333植株的叶片，每年5月份采集山杨良种银×山1333植株的带腋芽的茎段；
步骤三中所述的继代增殖培养基是指由YS培养基和0.5mg/L的6-苄基胺基嘌呤和0.03mg/L的萘乙酸组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/LNH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca(NO3)2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L；
步骤四中所述的不定芽生根培养基由YS培养基和激素组成，所述的激素为1.5mg/L的吲哚丁酸(IBA)和0.01mg/L～0.02mg/L的萘乙酸组成；
其中，所述的YS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、强度为1300g/cm2的琼脂和水组成；每1L的YS培养基中所述的大量元素由浓度为340mg/L的KNO3、400mg/LNH4NO3、96mg/L的CaCl2·2H2O、370mg/L的MgSO4·7H2O、550mg/L的Ca(NO3)2·4H2O、600mg/L的K2SO4、370mg/L KH2PO4、27.8mg/L的FeSO4·7H2O和37.3mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的微量元素由浓度为0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.25mg/L的CuSO4·5H2O组成；每1L的YS培养基中所述的铁盐由浓度为25mg/L～28mg/L的FeSO4·7H2O和36mg/L～38mg/L的Na2-EDTA组成；每1L的YS培养基中所述的有机成分为蔗糖20g/L、5mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、100mg/L的肌醇和2mg/L的甘氨酸；每1L的YS培养基中强度为1300g/cm2琼脂的质量含量为5.5g/L。
2.根据权利要求1所述的山杨良种银×山1333的组织培养方法，其特征在于步骤一中所述的已消毒的外植体为休眠芽、腋芽、带叶柄叶片或不带叶柄叶片。
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