CN102870683A

CN102870683A - 马来沉香的微体扩繁方法

Info

Publication number: CN102870683A
Application number: CN2012104250609A
Authority: CN
Inventors: 张卫华; 潘文; 朱报著; 许丽萍; 张弘
Original assignee: Guangdong Academy of Forestry
Current assignee: Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明公开了一种马来沉香的微体扩繁方法，包括外植体预处理、芽的诱导、芽的增殖与壮苗、生根培养、炼苗与移栽的步骤，本发明建立了马来沉香无性系扩繁技术体系，为马来沉香珍贵药用植物提供了无性繁殖方法，也为大规模推广无性系苗木提供了一条新的途径。

Description

马来沉香的微体扩繁方法

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，特别是涉及马来沉香的微体扩繁方法。

背景技术

沉香属(Aquilaria)植物共15种，属于瑞香科(Thymelaeaaceae)，具有珍贵的药用用途，其形态为乔木或小乔木，落叶或不落叶，分布于缅甸、泰国、越南、老挝、柬埔寨、印度东北部及不丹、马来半岛、苏门答腊、加里曼丹等热带、亚热带地区。我国有土沉香(Aquilaria sinensis)1种，产于福建、广东、海南、广西，越南、泰国。沉香树以生产名贵药用沉香为主，用土沉香生产的沉香是国产沉香，国产沉香只含0.8％挥发油，油中主要成分为沉香螺醇、白木香醇和白木香醛，以及树脂。马来沉香含挥发油1％，油中主要成份为螺旋萜醇和沉香萜醇。

马来沉香(Aquilaria malaccensis)，又称容水沉香树，属瑞香科沉香属常绿乔木，在热带、亚热带的雨林和荒山野岭中生长。高可达40m，胸径1.5-2.5m，开白色小花，马来沉香和同一科内其他几种可以产生具有很高的药用价值、芬芳的浸满树脂的心材，通常被称为琼脂木、沉香木。它还具有广泛适应性，可以在沙地、石灰质、水分缺乏的坡地和山脊以及沼泽地，在平均气温为20～22℃的海拔1000m的地域也有分布。马来沉香用途广泛，以生产名贵药用沉香为主，心材具有芳香味，是一种珍贵木材，可制成各种高级工艺品，供观赏；利用木材创伤后或人工接种结香进行结香，结出的沉香是名贵药材，可治呃逆、功能性消化不良、尿道综合征、肺心病急性发作期、肠易激综合征、痛经、前列腺痛、胃痛等症。用沉香制成的中成药有100多种组方，沉香煎剂对人型结核杆菌有完全抑制作用；对伤寒和福氏痢疾杆菌，亦有强烈抗菌作用；沉香挥发油成份有麻醉、止痛、肌松作用；沉香有镇静、止喘作用；沉香对中枢神经系统有抑制作用；沉香有降压作用；沉香有抗心律失常和抗心肌缺血作用；最新研究发现：沉香还有明显的抗癌作用。沉香在科学发达的今日仍无法人工合成复制香味，更增添其稀有珍贵。

当前绝大部分地区在推广这一树种时，仍主要采用传统的种子育苗方式，在保持优良品种特性、提供性状表现一致的种植材料以及提高繁殖速度等方面均存在一定困难和明显的局限性，而研究应用组织培养快繁技术培育优良苗木、繁殖和推广优良无性品系的工作目前仍是空白。从完善有性与无性繁殖技术手段，达到“有性繁育、无性利用”的目的，以利于促进大规模推广优良无性系的必要性分析，开展该树种组织培养技术研究势在必行。

植物组织培养被认为是一项很有潜力的高新技术，在推动林业现代化方面已有了巨大的经济效益、社会效益和生态效益。木本植物的组织培养可以为建立和繁殖优良树种无性系提供最直接的技术方法，可以为大规模推广优良无性系苗木提供一条新的途径，这一技术的应用将可加快林业产业化和林业生态建设的进程。

发明内容

基于此，有必要针对应用微体快繁技术培育马来沉香的空白，提供一种马来沉香的微体扩繁方法。

一种马来沉香的微体扩繁方法，包括以下步骤：

(1)、外植体预处理：选取马来沉香实生苗嫩茎，去除叶片，洗净，剪成带芽茎段，用0.1％的HgCl₂消毒4-5min；

(2)、芽的诱导：将步骤(1)中消毒后的带芽茎段接种于诱导培养基中，得到无菌嫩芽，所述诱导培养基的配方为：1/2MS、6-BA 0.2-1.0mg/L、NAA0.05-0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂5.6-5.8g/L或MS、6-BA 0.2-1.0mg/L、NAA0.05-0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂5.6-5.8g/L；

(3)、芽的增殖与壮苗：将步骤(2)中得到的无菌嫩芽接种到增殖培养基中，30-40天后继代1次，得到不定芽，所述增殖培养基的配方为：1/2MS、6-BA0.05-0.5mg/L、蔗糖20-25g/L、琼脂5.6-5.8g/L，pH5.8±0.2；

(4)、生根培养：将步骤(3)中芽苗高大于1cm的不定芽切成大小基本一致的不定芽，接入单次生根培养基中，培养25-35天；或切取大小基本一致、生长正常、高约2cm的不定芽接入二次生根培养基中，培养2-3天后移入不加任何外源激素的1/2MS培养基中继续培养生根；所述单次生根培养基的配方为：1/2MS、IBA 0.1-2.0mg/L、NAA 0.1-2.0mg/L、根太阳1.0-2.0mg/L，琼脂5.8-6g/L；所述二次生根培养基配方为1/2MS、NAA 5.0±0.2mg/L、蔗糖20-25g/L、琼脂6±0.2g/L，pH5.8±0.2；

(5)、炼苗与移栽：当根长长于1cm时，移至大棚炼苗，8-12天后，用清水洗掉培养基，移栽至消毒过的基质中，用水淋透，盖上塑料膜和遮阳网，即得，所述基质为体积比为1∶1∶1～1∶1∶2的蛭石：珍珠岩：黄心土或体积比为1∶1～2∶1的泥炭土：黄心土。

其中，1/2MS培养基的配方为：MS培养基的大量元素和微量元素减半，其他不变。

在其中一个实施例中，当步骤(3)中得到的不定芽的芽苗高小于1cm时，将其转入壮苗培养基中进行培养，所述壮苗培养基的配方为：1/2MS、蔗糖20-30g/L、琼脂5.6-5.8g/L。

在其中一个实施例中，所述壮苗培养基的配方为：1/2MS、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L。在其中一个实施例中，所述步骤(2)中诱导培养基的配方为：1/2MS、6-BA 0.2mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的增殖培养基的配方为1/2MS、6-BA0.1mg/L、蔗糖25g/L、琼脂5.8g/L，pH为5.8。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中的单次生根培养基配方为：1/2MS、IBA0.2mg/L、NAA 0.3mg/L、根太阳1.0mg/L。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中的二次生根培养基配方为：1/2MS、NAA5.0mg/L、蔗糖20g/L、琼脂6g/L，PH为5.8。

在其中一个实施例中，所述步骤(5)中的基质为体积比为2∶1的泥炭土：黄心土。

在其中一个实施例中，所述步骤(5)中采用1％的高锰酸钾溶液消毒基质。

在其中一个实施例中，所述步骤(1)中采用0.1％的HgCl₂消毒4-5min。

上述马来沉香的微体扩繁方法提供了外植体预处理、芽的诱导、芽的增殖与壮苗、生根培养、炼苗与移栽栽全过程试验方法和方案，建立了马来沉香无性系扩繁技术体系，为马来沉香珍贵药用植物提供了无性繁殖方法，也为大规模推广无性系苗木提供了一条新的途径。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1

马来沉香微体扩繁方法，包括以下步骤：

(1)、外植体预处理

取材选在晴天，在取材前一天停止浇水，选择健康、无病虫害的马来沉香实生苗嫩茎，去除叶片，带回试验室，在流水下冲洗，清除明显污垢，然后再用0.1％左右的洗衣液轻柔地涮洗，在流水下冲洗干净，用灭过菌的剪刀将其剪成1-2cm长的带芽茎段，选用0.1％HgCl₂将所述带芽茎段消毒4-5min，备用；

(2)、芽的诱导

利用预处理过的外植体为试验材料，以MS、1/2MS、B5为基本培养基，添加6-BA、NAA、KT 3种植物生长调节剂，其中培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂粉5.8g/L，采用正交设计方法，筛选最佳的启动培养基配方。筛选结果见表1：

表1不同诱导培养基的启动率

由表1可知，MS和1/2MS差异性不显著，1/2MS最好。6-BA的影响也较为显著，以低浓度的效果较好。NAA对沉香茎段培养启动率影响不显著。启动率最高的培养基配方是：1/2MS、6-BA 0.2mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，启动率达70.5％。

(3)、芽的增殖与壮苗

以启动培养试验所获得的无菌嫩芽为试验材料，基本培养基为1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS，附加植物生长调节剂6-BA 0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L 4种浓度，添加蔗糖30g/L，琼脂粉5.8g/L，PH值5.8。马来沉香一般40天继代1次，增殖倍数为1.9～2.7之间。增殖培养过程中，很容易产生水渍状透明的玻璃芽，严重影响了芽的增殖和质量。在外源激素6-BA添加浓度为0.1mg/L的条件下，不同无机盐浓度对马来沉香的芽增殖和玻璃芽率有不同的影响。其中，全量MS和3/4MS培养基易产生玻璃芽，严重阻碍了芽的增殖，不适合作增殖培养基；在1/2MS培养基中培养的芽生长正常、健壮，增殖率较高，且玻璃芽率较低，比较适合用于芽的增殖培养；随着无机盐浓度的继续降低，玻璃芽率有下降的趋势，即1/4MS培养基中的玻璃芽率较低，但芽的长势较差，增殖率较低，不适合作增殖培养基。增殖芽若连续在全量MS培养基中培养，玻璃芽的发生会逐渐加重；而连续在1/2MS培养基中培养，玻璃芽率则保持在较低的水平，说明1/2MS培养基适宜于马来沉香增殖芽的连续培养。

芽增殖对细胞分裂素6-BA的浓度要求较低，当6-BA浓度小于0.1mg/L时，增殖倍数随着浓度的加大而升高，当6-BA为0.1mg/L时其增殖倍数达到最大值，之后随着6-BA浓度的继续升高，增殖倍数反而下降，并且随着6-BA浓度的升高，芽玻璃化有加重的趋势。

增殖系数最高的培养基是：1/2MS、0.1mg/L 6-BA、25g/L蔗糖、5.8g/L琼脂，增殖系数达2.9。

增殖培养得到的芽苗矮小纤弱，木质化程度低，将这些小苗直接转入生根培养基，生根效果不理想，而且容易掉叶，导致生长停滞，所以，还需要进行壮苗培养，树种不一样，所要求的壮苗培养基也不一样，马来沉香的壮苗培养基只要1/2MS基本培养基，不需添加任何激素。将经过继代培养得到的马来沉香芽苗，苗高小于1cm的，切下转入壮苗培养基，即1/2MS、30g/L蔗糖、5.8g/L琼脂。30天后，苗高可达1.5-3cm。

(4)、生根培养

将步骤(3)中经过壮苗得到的不定芽切成高约2cm、大小基本一致的不定芽，接入单次生根培养基中，单次生根培养基的筛选是以1/2MS为基本培养基，设附加IBA0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L，NAA0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L，IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L，IBA 0.5mg/L+GTY 2.0mg/L，IBA 0.5mg/L+GTY 1.0mg/L IBA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+GTY1.0mg/L，IBA0.3mg/L+NAA0.1mg/L+GTY2.0mg/L等15个处理，将不定芽接入各种培养基中培养，每个处理3瓶，每瓶接种5株。培养30天后观察各处理组培苗的生根情况。如表2所示，为单次生根培养实验方案表，表3为生根培养实验结果及分析表。

表2生根培养实验方案表

表3生根培养实验结果及分析表

由表2和表3可知，马来沉香整体生根率并不高，在1/2MS上单独使用IBA或NAA时，可以诱导生根，但是生根率较低，只有10％或30％之间，两者配合使用或再加根太阳效果要好一些。

根据单次生根法的结果，采用高浓度的NAA，诱发原基的形成，然后转入不添加激素的培养基内生长，在二次生根法均出现根萌动，根系较单次生根法粗壮，15d后，单株生根最多条数为5条，生根率为17％～83％，其中最佳二次生根培养基为1/2MS、NAA 5.0mg/L、6g/L琼脂、20g/L蔗糖，PH5.8，培养2天后移入1/2MS培养基继续培养，生根率为83％。

(5)、炼苗与移栽

瓶苗的根多数长于1cm的时候，将瓶苗移至大棚进行炼苗，三天以后，将瓶盖拧松，以后每隔1-2天将盖子拧开少许，分3-4次全部打开，10天以后，进行移栽，移栽前，要用清水将培养基洗掉，再栽至基质中，基质用水淋透，盖上塑料膜和遮阴网。基质在移栽前三天经过太阳晒，移栽时用0.1％高锰酸钾溶液消毒基质。用泥炭土∶黄心土(体积比为2∶1)作基质共移植120株，成活78株，移栽成活率65％。

实施例2

在步骤(5)中采用体积比为1∶1∶1的蛭石∶珍珠岩∶黄心土作为基质，其他步骤同实施例1，共移植125株，成活55株，移栽成活率44.32％。

实施例3

在步骤(2)中采用诱导培养基的配方为1/2MS、6-BA 0.2mg/L、NAA 0.05mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.8g/L；其他步骤同实施例1，诱导启动率为67.5％。

实施例4

在步骤(2)中采用诱导培养基的配方为MS、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖25g/L、琼脂5.8g/L；其他步骤同实施例1，诱导启动率达56.3％。

实施例5

在步骤(3)中采用增殖培养基的配方为1/2MS、6-BA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.8g/L，pH5.8，其他步骤同实施例1，增殖系数为2.7。

实施例6

在步骤(4)中采用的单次生培养基的配方为：1/2MS、IBA 0.3mg/L、NAA0.1mg/L、根太阳2.0mg/L，其他步骤同实施例1，生根率为50.9％，根长为1.18cm。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、外植体预处理：选取马来沉香实生苗嫩茎，去除叶片，洗净，剪成带芽茎段，消毒；

2.根据权利要求1所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，当步骤(3)中得到的不定芽的芽苗高小于1cm时，转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基的配方为：1/2MS、蔗糖20-30g/L、琼脂5.6-5.8g/L。

3.根据权利要求2所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述壮苗培养基的配方为：1/2MS、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L。

4.根据权利要求1所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中诱导培养基的配方为：1/2MS、6-BA0.2mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L。

5.根据权利要求1所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中的增殖培养基的配方为1/2MS、6-BA 0.1mg/L、蔗糖25g/L、琼脂5.8g/L，pH5.8。

6.根据权利要求1所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(4)中的单次生根培养基配方为：1/2MS、IBA 0.2mg/L、NAA 0.3mg/L、根太阳1.0mg/L。

7.根据权利要求1所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(4)中的二次生根培养基配方为：1/2MS、NAA 5.0mg/L、琼脂6g/L、蔗糖20g/L，pH5.8。

8.根据权利要求1-7任一所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(5)中的基质为体积比为2∶1的泥炭土：黄心土。

9.根据权利要求1-7任一所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用1％的高锰酸钾溶液消毒基质。

10.根据权利要求1-7任一所述的马来沉香的微体扩繁方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用0.1％的HgCl₂消毒4-5min。