CN102550311A - 应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法 - Google Patents

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马华明
梁坤南
周再知
黄桂华
林明平
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Abstract

本发明涉及一种应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其将由沉香树结香部位分离纯化得到的再育镰刀菌（Fusariumproliferatum）进行培养、发酵，然后取发酵液滴注到沉香树上的钻孔内，发酵液在沉香树内诱导形成沉香。本发明的方法简单，沉香形成的时间缩短为1年；沉香产量较现有人工结香方法提高4～5倍，1米长直径为10cm的树干能产生合格沉香200～300克。

Description

应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法。
背景技术
沉香是我国、日本、印度以及东南亚国家的传统名贵药材和世界知名名贵香料。所谓沉香，为瑞香科沉香属的部分种和拟沉香属的部分种以自然、微生物或人工方式使之发生生物化学过程形成的产品，能生产沉香的植物统称为沉香树。沉香属有18种，主要分布于印度、中国、东南亚以及马来半岛。我国有土沉香和云南沉香两个种。
现有人工结香方法有五种。第一、砍伤法：树干用刀造成3～4cm伤口，几年后在伤口处形成沉香。第二、打钉法：铁钉打入树干任其生锈，尔后产香。第三、凿洞法：树干用凿孔机开孔洞，尔后产香。第四、化学刺激法：在树干上开一小孔，在小孔中滴入乙烯利、甲酸、冰醋酸等化学物质，刺激沉香的形成。第五、接菌法：树干用凿孔机开孔洞接种真菌，真菌寄生在沉香树上促使木材薄膜细胞贮存物质产生生理变化，最后在组织中形成香脂。前三种方法被称为传统方法，这三种方法费时费工、时间长、产量低且质量不稳定，但其要求的技术门槛低，仍有不少香农延用此技术；化学刺激法所产生沉香由于安全问题不宜入药。国内外近年来的研究认为，接菌法促进沉香形成具有安全有效、时间短的优点，形成沉香大约只需要2年的时间。但由于接菌的成功与否受环境条件影响较大，且形成沉香的范围仅局限在接菌四周，为提高产量，需要在树干打很多菌孔。综上所述，现有人工结香方法仍存在缺陷，不利于工业产业上广泛应用推广。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，利用该方法生产沉香时间短、产量高，有利于工业化生产。
本申请的发明人经研究发现，人工接菌后真菌的代谢产物是诱导沉香树形成沉香的关键因素，同时，本申请的发明人还发现，再育镰刀菌(Fusariumproliferatum)为沉香树结香部位的十余种真菌之一，其代谢产物能大大促进沉香树结香。因此，本发明的技术方案是：直接滴注再育镰刀菌的发酵液诱导沉香树形成沉香。这种技术手段既简便又能避免接菌过程受环境影响的缺陷。同时，发酵液在植物的蒸腾作用的带动下，能快速地遍布树体，既促进沉香的快速形成又提高沉香的产量。
本发明的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法包括以下步骤：
1)再育镰刀真菌的培养
将由沉香树结香部位分离得到的镰刀真菌自低温保藏的斜面试管转接于盛有PDA培养基的培养皿中，于26～28℃下培养3～5天后，待菌丝长满培养基后再转接于盛有PDA液体培养基的三角瓶中，再置于摇床上震荡培养1周；
2)发酵液的获取
从摇床上取下三角瓶，用纱布滤去菌丝体，滤液即为发酵液；
3)滴注发酵液
将发酵液分装于输液器具中，在沉香树干上钻孔，将输液器具中的发酵液注射经钻孔滴注式输入树体。
优选地，由沉香树结香部位分离再育镰刀真菌的步骤包括：
a)取样：在沉香树结香部位取样；
b)样品消毒：在0.1％的升汞溶液中浸泡1min，无菌水清洗后，75％乙醇中浸泡1min，无菌水清洗；
c)菌种的分离纯化：在超净工作台上用无菌剪刀挑取样品中心部分，置于PDA培养基中，26～28℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取平板中单一菌落的菌丝转接至新的平板，继续26～28℃恒温培养；
d)将步骤c)获得的菌种进行鉴定，选取其中的再育镰刀菌(Fusariumproliferatum)转接试管斜面进行低温保藏。再育镰刀菌在PDA培养基上28℃培养3天，菌落呈圆形，菌丝体白色毛絮状，后期中央菌丝体由白色转为紫色。大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，无色透明，具2～5个隔膜；小型分生孢子呈卵形、梨形或肾形，无色透明。
优选地，滴注发酵液的沉香树干为树龄5年以上的土沉香、奇楠沉香或马来沉香。
优选地，在春夏季天气晴朗的时候滴注发酵液。
优选地，钻孔在沉香树干的同一高度的东西两侧进行。
优选地，自首次滴注发酵液2个月后再滴注一次发酵液。
优选地，所述输液器具包括输液袋、输液软管和针头；输液软管固定在输液袋下方，呈倒“Y”字形，上方为主液管，下方为两个分支输液管，主液管上设流速控制器，分支输液管末端连接针头。
优选地，钻孔的孔径与针头的孔径匹配。
与现有技术相比，本发明产生的显著效果是：
1.结香周期短：沉香形成的时间缩短为1年；
2.沉香产量高：形成沉香的范围大，由树干至分枝及根部均可形成沉香，沉香总产量较现有人工结香方法提高4～5倍；
3.生产工艺简单；
4.运用生物技术，所产沉香为无公害产品，宜作药用。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明作进一步详细说明。
实施例1应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法
1)由沉香树结香部位分离再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)
a)取样：在沉香树结香部位取样；
b)样品消毒：在0.1％的升汞溶液中浸泡1min，无菌水清洗后，75％乙醇中浸泡1min，无菌水清洗；
c)菌种的分离纯化：在超净工作台上用无菌剪刀挑取样品中心部分，置于PDA培养基中，26～28℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取平板中单一菌落的菌丝转接至新的平板，继续26～28℃恒温培养；
d)将步骤c)获得的菌种转接试管斜面进行低温保藏。
2)再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)的培养
将由沉香树结香部位分离得到的再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)自低温保藏的斜面试管转接于盛有PDA培养基的培养皿中，于26～28℃下培养3～5天后，待菌丝长满培养基后再转接于盛有PDA液体培养基的三角瓶中，再置于摇床上震荡培养1周。
3)发酵液的获取
从摇床上取下三角瓶，用纱布滤去菌丝体，滤液即为发酵液。
4)滴注发酵液
在天气晴朗的时候，将发酵液分装于输液器具中，在树龄为5年以上的沉香树干的同一高度的东西两侧分别钻孔，将输液器具中的发酵液经钻孔以滴注方式输入树干中，所述沉香树干为土沉香、奇楠沉香或马来沉香。所述输液器具包括输液袋、输液软管和针头；输液软管固定在输液袋下方，呈倒“Y”字形，上方为主液管，下方为两个分支输液管，主液管上设流速控制器，分支输液管末端连接针头，发酵液装在输液袋中，通过主液管上的流速控制器控制发酵液从输液袋流出的速度，从而控制发酵液由针头输入钻孔中的流速。为防止浪费，钻孔时控制孔径的大小与针头的孔径大小相等。
5)自首次滴注发酵液2个月后再一次滴注发酵液。
实施例2应用本发明的方法诱导沉香树产生沉香的产量的测试
选取6年生土沉香树5株，分别命名为A1-A5，5株土沉香树的平均胸径12.46cm，在离地面30cm处，直径为11～15cm的树干段上使用电钻(钻头Φ＝0.2cm)钻一小孔，孔深约3cm。取再育镰刀菌发酵液1000ml装于输液器具中，在天气晴朗的条件下，往预先钻好的小孔中对树体滴注式真菌发酵液，约2～3天后输液完成。2个月后再输液一次。1年后取下(上至离滴注口70cm下至离滴注口30cm的)1m树干段，去除非棕褐色部分，经晒干后即为沉香，测定其重量并参照2010版《中华人民共和国药典》测定其醇浸出物含量，结果如表1。
表1
Figure BDA0000126883090000051
实施例3应用本发明的方法诱导沉香树产生沉香的产量的测试
选取6年生土沉香树5株，分别命名为B1-B5，5株土沉香树的平均胸径11.21cm，选取直径约4cm的侧枝，使用电钻，钻头Φ＝0.2cm，钻一小孔，孔深约2cm。取再育镰刀菌真菌发酵液1000ml装于输液器具中，在天气晴朗的条件下，往预先钻好的小孔中对树体滴注真菌发酵液，约2～3天后输液完成。2个月后再输液一次。1年后取下(上至离滴注口70cm下至离滴注口30cm的)1m侧枝段，去除非棕褐色部分，经晒干后即为沉香，测定其重量并参照2010版《中华人民共和国药典》测定其醇浸出物含量，结果如表2。
表2
Figure BDA0000126883090000061

Claims (8)

1.应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其包括以下步骤：
1）再育镰刀菌的培养
将由沉香树结香部位分离得到的再育镰刀菌自低温保藏的斜面试管转接于盛有PDA培养基的培养皿中，于26～28℃下培养3～5天后，待菌丝长满培养基后再转接于盛有PDA液体培养基的三角瓶中，再置于摇床上震荡培养1周；
2）发酵液的获取
从摇床上取下三角瓶，用纱布滤去菌丝体，得到发酵液；
3）滴注发酵液
将发酵液分装于输液器具中，在沉香树干上钻孔，将输液器具中的发酵液注射进钻孔中。
2.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：由沉香树结香部位分离再育镰刀菌的方法包括以下步骤：
a)取样：在沉香树结香部位取样；
b)样品消毒：在0.1%的升汞溶液中浸泡1min，无菌水清洗后，75%乙醇中浸泡1min，无菌水清洗；
c)菌种的分离纯化：在超净工作台上用无菌剪刀挑取样品中心部分，置于PDA培养基中，26～28℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取平板中单一菌落的菌丝转接至新的平板，继续26～28℃恒温培养；
d）将步骤c)获得的再育镰刀菌转接试管斜面进行低温保藏。
3.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：滴注发酵液的沉香树干为树龄5年以上的土沉香、奇楠沉香或马来沉香。
4.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：在春夏季天气晴朗的时候滴注发酵液。
5.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：钻孔在沉香树干的同一高度的东西两侧进行。
6.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：自首次滴注发酵液2个月后再滴注一次发酵液。
7.如权利要求1所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：所述输液器具包括输液袋、输液软管和针头；输液软管固定在输液袋下方，呈倒“Y”字形，上方为主液管，下方为两个分支输液管，主液管上设流速控制器，分支输液管末端连接针头。
8.如权利要求7所述的应用真菌发酵液诱导沉香树快速形成沉香的方法，其特征在于：钻孔的孔径与针头的孔径匹配。
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