CN106434820B - 一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法 - Google Patents
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：扩大培养阶段，在28℃至30℃下灵芝菌丝体液体发酵体系，培养5至7天，每天用采用高温或低温处理所述灵芝菌丝体液体发酵体系1至3小时。本发明由于模拟灵芝野外生长环境，进行高低温发酵培养，实现了灵芝胞内三萜含量的高水平积累，能够在无需添加任何外源物质的前提下，廉价、安全、易操作，可显著提高胞内灵芝三萜含量，从而为工业化生产灵芝三萜奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法。
背景技术
灵芝三萜是在灵芝中发现的一类三萜类化合物，也就是说灵芝三萜是灵芝的主要化学和药效成分。灵芝中所含灵芝三萜具有特别显著的生理活性。在高度竞争的社会中，过度紧张的工作，生活方式的改变或因环境污染，导致对人体健康的严重损害，灵芝三萜有巨大的应用价值。
对灵芝生理生化过程的研究表明，三萜类化合物(灵芝酸)属于灵芝的二级代谢物。在灵芝生理生态和生活史研究中发现，菌丝体由一次菌丝、二次菌丝到三次菌丝后，才能纽结产生子实体。菌丝体期间只能累积足够的三萜类化合物(灵芝酸)的前结构物质，而后才能出菇(即由无性繁殖转为有性繁殖)，而产生子实体。在子实体的成熟过程中，三萜类物质才得以生物化合完善，成为具有生理活性的三萜类成分。可以说：灵芝三萜类是灵芝菌丝体一、二级代谢产物。所以，凡是灵芝菌丝体发酵制成的产品，由于没有经过子实体后期——成熟过程，三萜类化合物含量几乎没有或非常非常微小。然而子实体人工大量繁殖难度较大，因此工业上量产灵芝三萜的主要问题是如何提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量。
现有的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，主要是通过化学药物刺激。目前研究表明，茉莉酸甲酯、乙酸、苯巴比妥、咪康唑、阿司匹林、铜离子、锰离子等能够诱导灵芝酸合成。这些工作为研究灵芝酸生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是考虑到灵芝作为一种药食同源类中药，如果想要促进其在医学界广泛使用的话，必须考虑到发酵的安全性和经济性。现有的方法，存在化学残留、重金属污染等隐患，同时药剂使用成本较高。从安全性和经济性两方面考虑，需要开发新的发酵方法以提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量方法，其目的在于通过对灵芝菌丝体液体发酵各阶段进行高低温度变化培养，从而提高灵芝液菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量，由此解决现有的灵芝菌丝体液体发酵依靠药品刺激活重金属添加造成的安全性和经济性不佳的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
扩大培养阶段，在28℃至30℃下灵芝菌丝体液体发酵体系，培养5至7天，每天用采用高温或低温处理所述灵芝菌丝体液体发酵体系1至3小时。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其每天采用高温或低温处理灵芝菌丝体发酵体系2小时。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述高温在32℃至36℃之间；所述低温在0℃至8℃之间。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝菌丝体液体发酵体系扩大培养阶段培养基为CYM培养基。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其种子液培养阶段采用多级种子发酵培养。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述种子液培养阶段具体步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5至7天，获得一级种子液；
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于模拟灵芝野外生长环境，进行高低温发酵培养，实现了灵芝胞内三萜含量的高水平积累，能够在无需添加任何外源物质的前提下，廉价、安全、易操作，可显著提高胞内灵芝三萜含量，从而为工业化生产灵芝三萜奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例及对比例胞内灵芝三萜含量提高结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5至7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃灭菌25至40分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，115℃灭菌25至40分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
在28℃至30℃下灵芝菌丝体液体发酵体系，培养5至7天，优选6天，每天用采用高温或低温处理所述灵芝菌丝体液体发酵体系1至3小时，优选2小时。例如，2小时在0℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在0℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
高温或低温处理，需考虑到刺激效果和灵芝菌丝体耐受情况，以1至3小时为宜，2小时为佳。实验证实，高温处理，温度在32℃至40℃之间，优选36℃；低温处理，温度在0℃至8℃之间，优选4℃，具有明显的诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量的效果，高温处理效果较低温处理更佳。
以下为实施例：
实施例1
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃灭菌25至40分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，115℃灭菌25至40分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在0℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在0℃条件下发酵2小时后22小时在正常温度即28℃至30℃条件下继续发酵，如此循环培养144小时。
实施例2
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在4℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在4℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例3
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在8℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在8℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例4
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在32℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在32℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例5
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在36℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例6
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
1小时在36℃条件下发酵，23小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵1小时，如此循环培养120小时。
实施例7
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
3小时在36℃条件下发酵，21小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵3小时，如此循环培养168小时。
实施例8
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃灭菌25至40分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，115℃灭菌25至40分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如实施例1。
实施例9
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养6天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃灭菌25至40分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，115℃灭菌25至40分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如实施例1。
对比例1
灵芝菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃灭菌25至40分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，115℃灭菌25至40分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，115℃灭菌25至40分钟。
扩大培养阶段，采用恒温处理，28℃培养144小时。
对比例2
灵芝菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜积累的影响来诱导灵芝菌丝体提高灵芝三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在40℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在40℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例1至9以及对比例1至2的培养体系，胞内灵芝三萜含量测定结果如图1及表1所示：
表1
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
扩大培养阶段，在28℃至30℃下灵芝菌丝体液体发酵体系，培养5至7天；
每天先2h高温处理发酵，然后22h在28℃至30℃下发酵，然后再在高温条件下发酵2h，如此循环培养5-7天；或
每天先2h低温处理发酵，然后22h在28℃至30℃下发酵，然后再在低温条件下发酵2h，如此循环培养5-7天；
所述高温在32℃至36℃之间；所述低温在0℃至8℃之间。
2.如权利要求1所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝菌丝体液体发酵体系扩大培养阶段培养基为CYM培养基。
3.如权利要求1所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，种子液培养阶段采用多级种子发酵培养。
4.如权利要求3所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述种子液培养阶段具体步骤如下：
（1）采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5至7天，获得一级种子液；
（2）将步骤（1）中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
（3）将步骤（2）中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二灵芝种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
（4）将步骤（3）中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。
5.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g。
6.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖 35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
7.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
8.如权利要求2所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克。
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