CN105217799A

CN105217799A - 一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法

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Publication number: CN105217799A
Application number: CN201410275495.9A
Authority: CN
Inventors: 程凯; 向斯; 许珂; 吴刚; 赵以军; 李祝
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明公开了一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法，属于水体净化领域。一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法，为细黄链霉菌AN02使用如下配方的培养基在10L发酵罐中培养，玉米淀粉25g/L、蔗糖18g/L、硝酸钠1.25g/L、氯化钠0.75g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L；发酵罐中发酵的条件为：装填量70%、接种量10%，发酵温度为28.0℃，搅拌速度为150r/min，通气量为9L/min，采用聚醚类消泡剂1mL，不补料也不调节pH，发酵4天。使用本发明方法发酵使细黄链霉菌AN02溶藻活性物质的分泌量最大化，使AN02发酵液的溶藻效率明显提升。

Description

一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法

技术领域

本发明属于水体净化领域，具体涉及一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法。

背景技术

近年来我国经济的加速发展，污染物的排放总量持续增加，水体富营养化日趋严重，藻类水华的报道持续增加：武汉东湖的官桥湖2008年至今，武汉南湖2009年至今，每年夏季都出现严重的蓝藻水华；三峡水库蓄水完成后至今，其重要支流上的藻类水华不断加重；汉江中下游江段(武汉市的主要自来水源)自90年代中期以来，硅藻水华的生物量和发生范围持续增加；此外，各种养殖水体中的藻类水华更是不计其数。上述水华的发生，不但会通过破坏景观、产生异味而影响人民群众的日常生活，而且会严重干扰自来水生产、水产养殖、水利调度等多个行业的正常生产秩序。特别是随着本省经济的进一步发展，排污量继续增加，藻类水华对我国社会经济发展的影响还将加剧，因此研究控藻机理，开发控藻技术尤为必要。

水华的治理一般采取化学法、物理法和生物方法。化学除藻法(以硫酸铜为代表)能立竿见影，但化学杀藻剂不但会造成环境污染、破坏生态平衡，甚至还可能通过食物链的放大而威胁人类健康。物理法(以机械打捞为代表)能够在除藻的同时从水体中移除营养物，但这种方法费时、费钱、需要专业的操作人员和设备、通常仅作为水华成灾后的应急措施使用，不能预防藻类水华的发生。

在利用物理、化学方法治理水华甚不理想的情况下，生物方法从生态的角度治理水华，具有经济、高效、合理的优点，已受到越来越广泛的重视。微生物除藻法通过溶藻微生物专一性裂解藻细胞，对其它生物无影响，成本低，特别是由于溶藻微生物均为从天然环境中直接分离得到的土著菌株，因此具有很高的生态安全性，代表了杀藻技术的发展趋势。国内外在藻类病毒和溶藻菌的基础理论方面研究较深入，但还停留在理论阶段，尚未见相关实用产品及技术。

肖慈琼等从土壤中分离到13株具有溶藻活性的放线菌菌株，经过进一步筛选得到AN02菌株，其保外代谢产物对铜绿微囊藻具有较好的抑杀作用，通过对AN02培养条件的优化，其溶藻效果添加量可以达到100:1(肖慈琼，姜红，程凯，等.溶藻放线菌AN02的筛选及其培养条件的优化[J].微生物学杂志，2007，27(4)：11-14.)。对溶藻放线菌AN02进行了形态特征、培养特征、生理生化特性及聚类分析，结果表明溶藻放线菌AN02与细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)高度一致，确定其属于细黄链霉菌中，将其命名为细黄链霉菌AN02(StreptomycesmicroflavusAN02)(王慧玲，叶新，赵以军，等.一株高效溶藻放线菌的分子生物学鉴定[J].环境科学与技术，2009，32(6)：17-19.)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法，为使用如下配方的培养基在发酵罐中发酵：玉米淀粉25g/L、蔗糖18g/L、硝酸钠1.25g/L、氯化钠0.75g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L。

优选的，所述的溶藻链霉菌为细黄链霉菌AN02(StreptomycesmicroflavusAN02)。

在发酵罐中发酵的条件优选为：装填量70％、接种量10％，发酵温度为28.0℃，搅拌速度为150r/min，通气量为9L/min，采用聚醚类消泡剂，不补料也不调节pH，发酵4天。

更优选的，发酵罐为10L发酵罐，聚醚类消泡剂的量为1mL。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：使用本发明方法对细黄链霉菌AN02进行发酵可以使其溶藻活性物质的分泌量最大化，使AN02发酵液的溶藻效率明显提升，溶藻效果添加量由原来的100:1(肖慈琼，姜红，程凯，等.溶藻放线菌AN02的筛选及其培养条件的优化[J].微生物学杂志，2007，27(4)：11-14.)提升到500:1。

附图说明

图1是不同淀粉种类对AN02培养溶藻产物的影响结果图。

图2是DO值随发酵时间变化曲线图。

图3是pH值随发酵时间变化曲线图。

图4是不同时段发酵上清液的溶藻效果图；图中，a：初始对照藻细胞数，b：第二天对照藻细胞数，c：第三天发酵液溶藻效果添加量(铜绿微囊藻藻液与所用培养液上清液体积比)为200:1的藻细胞数，d：第三天发酵液溶藻效果添加量为500:1的藻细胞数，e：第四天发酵液溶藻效果添加量为200:1的藻细胞数，f：第四天发酵液溶藻效果添加量为500:1的藻细胞数，g：第五天发酵液溶藻效果添加量为200:1的藻细胞数，h：第五天发酵液溶藻效果添加量为500:1的藻细胞数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中材料如下：

菌株：细黄链霉菌AN02(肖慈琼，姜红，程凯，等.溶藻放线菌AN02的筛选及其培养条件的优化[J].微生物学杂志，2007，27(4)：11-14；王慧玲，叶新，赵以军，等.一株高效溶藻放线菌的分子生物学鉴定[J].环境科学与技术，2009，32(6)：17-19.)，铜绿微囊藻(Microcystisaeruginsa，DS)均由中科院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供。

培养基：细黄链霉菌AN02以高氏一号液体培养基为基础培养基，铜绿微囊藻用BG-11培养基培养；培养基中使用的试剂均为国产分析纯。

实施例1正交实验设计优化细黄链霉菌AN02发酵培养基各组分

以高氏一号液体培养基为基础培养基，用含有如下组分的培养基培养细黄链霉菌AN02：可溶性淀粉、蔗糖、硝酸钠、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁。经过大量研究，选取可溶性淀粉、蔗糖、NaNO₃、NaCl、K₂HPO₄5个因素，采用L16⁽⁴⁵⁾正交表进行5因素4水平的正交实验，各组培养基设计如表1所示。细黄链霉菌AN02培养条件为：28℃摇床，250mL三角瓶装液量为100mL、160rpm培养4天。之后取各组培养液10000g/m离心，分别取各组培养液上清液0.2mL加入到100mL铜绿微囊藻藻液中，初始藻细胞浓度为6.52×10⁵个/mL，即溶藻效果添加量为500:1(指铜绿微囊藻藻液与链霉菌培养液上清液体积比)。在藻正常生长条件下，4天后采用丙酮抽提法测各组的叶绿素a浓度，每组设三平行。考察培养基组分及其浓度对菌株发酵产活性代谢物的溶藻效果影响。

表1.细黄链霉菌AN02培养基优化正交实验表

正交实验结果及方差分析如表2和表3所示。

表2.正交实验结果

表3.方差分析表

正交实验结果表明可溶性淀粉浓度对溶藻效果影响最大，其浓度为25g/L时，溶藻效果普遍较好；氯化钠浓度对溶藻效果影响次之，其浓度为氯化钠0.75g/L时，溶藻效果普遍较好；蔗糖浓度对溶藻效果影响再次之，其浓度为蔗糖18g/L时，溶藻效果最好；磷酸氢二钾浓度对溶藻效果影响再次之，其浓度为0.6g/L时，溶藻效果最好；硝酸钠浓度对溶藻效果影响最小，其浓度为1.25g/L溶藻效果最好。各组分对细黄链霉菌AN02发酵液上清液的溶藻效果影响大小为：淀粉>氯化钠>蔗糖>硝酸钠>磷酸氢二钾。综合各项因素考虑确定细黄链霉菌AN02培养基配方如下：可溶性淀粉25g/L、蔗糖18g/L、硝酸钠1.25g/L、氯化钠0.75g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L；其中的镁离子和铁离子是菌体的某些酶的重要组成部分。

实施例2不同淀粉种类对细黄链霉菌AN02培养溶藻产物的影响

在工业应用生产过程中，不同淀粉的种类甚至同种淀粉不同批次都会对发酵产生较大的影响，而且实施例1发现，淀粉是对发酵具有非常显著影响的因子，因此再单独对淀粉种类进行优化。

在实施例1得到的细黄链霉菌AN02培养基的基础上，将可溶性淀粉替换为马铃薯淀粉、玉米淀粉，以可溶性淀粉为阳性对照，按照实施例1中所述条件培养细黄链霉菌AN024天，取培养液10000g/m离心得上清液。分别取上清液0.2mL，加入到初始藻细胞为6.08×10⁵个/mL的100mL铜绿微囊藻藻液中，第四天(参见实例1培养条件)测残余藻细胞浓度，每组设三平行。

结果如图1所示，使用玉米淀粉时，发酵液上清的溶藻效果最好，可溶性淀粉次之，土豆淀粉相对最差。在工业发酵中，以玉米淀粉使用最为广泛，成本也最低，所以在以后的大型发酵过程中，可以采用玉米淀粉作为碳源。

实施例3细黄链霉菌AN02在10L发酵罐的发酵

在10L的发酵罐中对细黄链霉菌AN02进行发酵培养，装填量为7L；灭菌参数设置为121℃，30min；发酵参数设置：接种量10％，搅拌速度为150r/min，通气量为9L/min，发酵温度为28.0℃，采用聚醚类消泡剂1mL，不补料也不调节pH。发酵所用的培养基配方为：玉米淀粉175g、蔗糖126g、硝酸钠8.75g、氯化钠5.25g、磷酸氢二钾4.2g、硫酸镁3.5g、硫酸亚铁0.07g、单蒸水7L。发酵120小时，分别第3天、第4天、第5天取发酵液，10000g/m离心获得上清液。分别取0.5mL、0.2mL接于100mL铜绿微囊藻藻液(溶藻效果添加量分别为200:1、500:1)中，初始藻细胞浓度为7.92×10⁵个/mL，第2天测各组藻细胞浓度，每组设三平行。

发酵过程中溶解氧(dissolvedoxygen，DO)和pH值的变化情况及发酵液上清溶藻效果如图2-4所示。

由图2可以看出，在培养的前40h左右，溶解氧一直在100％附近，在90h以后，溶氧也维持在90％附近，说明此时发酵液的通气量过于充足，实则是一种浪费。通气量过大造成水分大量散失，直接影响最后发酵液的收成；其次由于大量水分的散失，将导致发酵液各种盐浓度的提高，不利于菌的生长。所以在后期的实验，可根据菌的需要，前期控制通气量在一个较低水平；当进入对数生长期，菌的呼吸作用加大，再提高通气量；到了稳定期后期和衰亡期，再略微降低通气量。

由图3可以看出，在20-24h，pH略有下降，之后又开始提升到8.1。分析可能由于发酵初期，通气量比较大，导致罐内CO₂在水中的含量略有所升高，致使pH略有所下降，之后AN02开始生长利用无机氮源NaNO₃，pH上升。之后由于菌体生长非常迅速，通气量略有不足，致使菌体进行无氧呼吸产酸，pH又开始下降，之后菌体生长进入到稳定期，在无机氮源被利用和溶氧双重影响下，pH继续上升直到发酵结束。

上述结果表明细黄链霉菌AN02的培养条件还有进一步提升的空间。

由图4可以看出，发酵4天的上清液的溶藻效果最好，溶藻效果添加量200:1与500:1效果几乎相当。分析第三天的时候发酵尚未结束，溶藻产物开始分泌产生，但产生的量不足；到了第五天，发酵时间过长，分泌的产物可能又被菌体部分分解。可见，发酵时间控制在4天，其上清中的溶藻效果最好。

通过上述实施例得出使细黄链霉菌AN02活性物质分泌量最大的工业化发酵的条件如下：

培养基配方：玉米淀粉25g/L、蔗糖18g/L、硝酸钠1.25g/L、氯化钠0.75g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L。

发酵条件：在10L的发酵罐中，装填量70％、接种量10％，搅拌速度为150r/min，通气量为9L/min，发酵温度为28.0℃，采用聚醚类消泡剂1mL。发酵至第4天时对铜绿微囊藻的溶藻效率最高。

Claims

1.一种溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法，其特征在于：使用如下配方的培养基在发酵罐中发酵：玉米淀粉25g/L、蔗糖18g/L、硝酸钠1.25g/L、氯化钠0.75g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L。

2.根据权利要求1所述的溶藻链霉菌活性物质的工业化发酵方法，其特征在于：所述的溶藻链霉菌为细黄链霉菌AN02。

3.根据权利要求1所述的溶藻放线菌活性物质的工业化发酵方法，其特征在于：在发酵罐中发酵的条件为：装填量70%、接种量10%，发酵温度为28.0℃，搅拌速度为150r/min，通气量为9L/min，采用聚醚类消泡剂，不补料不调节pH，发酵4天。

4.根据权利要求3所述的溶藻放线菌活性物质的工业化发酵方法，其特征在于：发酵罐为10L发酵罐，聚醚类消泡剂的量为1mL。