CN101886053A - 一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，包括：将污水按1∶100的体积比接入富集培养基，于30℃，110r/min摇床中富集培养24h；将富集培养后的菌株转接至固体分离培养基，经过3次划线分离得到纯化菌株；将纯化菌株按18～23％的接种量接种到液体分离培养基，测试菌株在30℃、好氧条件下培养24h时的反硝化率，筛选出反硝化良好的单一菌株。本发明的方法简单，成本低，材料来源广泛，适合于共业化生产；所得解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)反硝化效率可达87.6％，且易于灭活，保证了使用的生态安全性。
Description
技术领域
本发明属反硝化菌的筛选纯化领域，特别是涉及一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法。
背景技术
随着工业废水和生活污水的大量排放，水体富营养化日益严重，高效去除水中氮素污染成为当今的一个热点问题。氮污染主要来源为城市污水、工业废水、畜禽养殖废水、垃圾填埋渗滤液等，污染物持续进入水体，造成水生植物和藻类过度生长，同时藻类产生的毒素引起引起鱼和其他水生需氧动物死亡。传统理论认为反硝化是一个严格的厌氧过程，而自20世纪80年代首次发现好氧反硝化菌后，好氧反硝化菌的分离及其性能研究迅速发展，国内外最近报道的有戴尔福特菌属(Delftia)，沙门氏菌属(Salmonella)和假单胞菌属(Pseudomonas)等。C.W.Lindau和M.Robert Hamersley等则分别证实了河流和湖泊等地表水中，都存在着大量的反硝化菌和厌氧氨氧化细菌，而苏州河是上海市内重要的水体功能地表水，但由于其接纳的污水量大，污染负荷远远超过自净能力，水质受到严重污染，各种水体功能也因此受到损害，因此在污染较严重的地段能筛选出高性能的反硝化菌种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，该方法简单，成本低，材料来源广泛，适合于共业化生产；所得解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiellaornithinolytica)反硝化效率可达87.6％，且易于灭活，保证了使用的生态安全性。
本发明的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，包括：
(1)将污水按1∶100的体积比接入富集培养基，于30℃，110r/min摇床中富集培养24h；
(2)将步骤(1)富集培养后的菌株用稀释平板涂布法转接至固体分离培养基，置于30℃恒温培养箱培养24～48h，经过3次划线分离得到纯化菌种；
(3)将纯化菌种富集后，按18～23％的接种量接种到液体分离培养基，测试菌株在30℃、好氧条件下培养24h时的反硝化率，筛选出反硝化率达75％以上的单一菌株，转接斜面培养基，4℃下保存。
所述的污水取自苏州河。
所述步骤(1)中的富集培养基为：蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH 7.4-7.6；固体培养基中加入18g/L的琼脂粉。
所述步骤(2)和(3)中的分离培养基为：碳源3～5g，KNO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.02g，定容到1000ml，调节pH 7.4-7.6；固体培养基另外加1.8％W/V琼脂。
所述的碳源为乙酸钠、丙酸钠、乙醇、谷氨酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、甲醇、硫代硫酸钠、葡萄糖或碳酸氢钠。
所述的碳源为葡萄糖，在分离培养基中的用量为5g，培养基初始pH值为7.5。
所述步骤(3)中的菌株为较短粗的杆菌，单独排列，无芽胞，无鞭毛，长度约0.8-1.5微米，直径约0.3-0.6微米；菌落呈灰白色，圆形；革兰氏染色呈阴性。
所述菌株经16S rDNA序列测定和分析比较，鉴定为解鸟氨酸克雷伯菌，命名为Klebsiella ornithinolytica N-4，同源性达到97％。
本发明为污染治理提供了新的方法。
有益效果
(1)本发明的方法简单，成本低，材料来源广泛，适合于工业化生产；
(1)本发明所得的解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4具有较高的反硝化作用，反硝化效率可达87.6％；菌株在好氧的条件下具有良好效果，能适应复杂的实际条件，在培养基上能存活数周至数月；解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的种源为苏州河污染严重的路段，解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4对一般抗生素均无抗性，且易于灭活，55℃30分钟即可杀死，保证了使用的生态安全性。
附图说明
图1为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的系统进化树；
图2为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的扫描电镜；
图3为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的革兰氏染色效果图；
图4为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的生长曲线及其反硝化效果；
图5为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4在不同接种量下所需的反硝化时间；
图6为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4在不同温度下的反硝化效果；
图7为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4在不同pH下的反硝化效果；
图8为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4降解速率的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
高效脱反硝化菌的分离筛选与鉴定
(1)将苏州河不同地段取回来的水样，分别吸取1ml至装有100ml富集培养基的250ml锥形瓶中，30℃，110r/min摇床中培养24h；
富集培养基：蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.4-7.6。
(2)然后用稀释平板涂布法接种至固体分离培养基，置于30℃恒温培养箱培养24～48h，经过3次划线分离得到纯化菌种；
分离培养基：葡萄糖5g，KNO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.02g，琼脂18g，定容到1000ml，调节pH 7.4～7.6。
(3)将纯化得到的菌株富集后，按20％接种量接种到反硝化试验培养基中(即液体分离培养基)，测试各菌株在不同碳源(乙酸钠、丙酸钠、乙醇、木糖、乳糖、酒石酸钾钠、甲醇、硫代硫酸钠、葡萄糖或碳酸氢钠)中，于30℃、好氧条件下培养24h时后的反硝化率，筛选出反硝化率在75％以上性能良好的菌株；
反硝化试验培养基：葡萄糖5g(或等量替代上述碳源)，KNO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.02g，蒸馏水1000ml，pH 7.4～7.6。
(4)然后对菌体进行革兰氏染色(图3)和电镜扫描(图2)，观察菌株的外部形态特征，并将分离出的菌种接种到斜面培养基上(酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.2)，4℃下保存于冰箱中待后续进行降解试验，同时将单一菌落送至上海基康生物技术公司测定全序列，确定菌种类型。
实施例2
高效反硝化菌的最佳条件
将实施例1筛选出的性能最好的反硝化菌命名为N-4。
将N-4菌种以1％接种量，分别接种于实施例1富集培养基和分离培养基，在30℃好氧条件下，检测30h内菌种生物量及其硝态氮含量的变化(图4)，由图可知，生物量在15h前后达到峰值，而硝态氮含量在24h达到最低，并且在接种量较小情况下，菌种延迟期时间较长，不能短时间内发挥反硝化作用。然后分别测定N-4菌在1％-30％接种量情况下(其余培养条件相同)，反硝化所需的时间(图5)，由图可知，在接种量由1％增加到20％时，反硝化时间大大缩短，但当接种量大于20％后，反硝化时间都没有太大变化，而且随菌体浓度增加，营养物质消耗加快，菌体进入衰亡期时间提前，不利于长期观察。因此菌株N-4的最佳接种量为20％左右。
(1)将菌株N-4接种于不同初始pH值的试验培养基中(培养基成分相同)，接种量为20％，30℃培养24h，测定反硝化率知反硝化适宜在偏碱条件下(pH为6.5～8.5)进行，pH低于7.0和高于8.0反硝化速率下降幅度很大见(图6)，最适生长pH值为7.5。
(2)不同温度下，在pH值7.5的反硝化试验培养基中接入20％的含菌株N-4的培养液，培养测定菌株N-4的反硝化速率和反硝化率(图7)。由图7可知30℃时菌株N-4的反硝化效率最大，从应用角度考虑，生物反硝化宜选用在30℃左右条件下进行。
通过生长条件优化得出N-4的最适生长条件为在葡萄糖为唯一碳源下，最适接种量为20％，最适培养基初始pH值为7.5，最佳温度为30℃。
实施例3
高效反硝化菌的降解效率分析
在反硝化试验培养基中，培养基初始pH值调为7.5，NO3-N质量浓度为280mg·L-1(此处的浓度是否根据培养基中KNO32g的量换算得到)接种量为20％，在30℃下培养，间隔2h取样测定培养基中硝态氮的降解速率(图8)。由图可知，N-4对NO3-N的降解效果良好，在培养基中延迟期很短。在0～8h营养液中的NO3-N浓度迅速下降，8h后NO3-N浓度继续呈下降趋势，但趋于平缓，16h内降解率达87.6％。
反硝化试验培养基：葡萄糖5g，KNO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O0.05g，CaCl20.02g，蒸馏水1000ml，pH 7.5。
表1反硝化菌株筛选的碳源试验
序列表
解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的16S rDNA序列
CCTCTGCATCAAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTG
CAACCCACTCCCATGGTGTTACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC
GTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGA
CTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTT
CTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGA
CTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCG
ACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAA
CATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAA
GGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCG
CGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCAT
TTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCC
GGAAGCCACTCCTCAAGGGAAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGAAC
TACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCGGCAAGGCGGAGTCTACCATGCA
GTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGT
AATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATA
CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATG
TGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCC
TAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCC
TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCAT
GCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGG
CATTAAGGTTAATAACCTTAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAAC
TCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG
GCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAAC
CTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTC
CAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC
CCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG
ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGA
GTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGT
TAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTATT
CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGACTTAGCAGAGATG
CTTTGGTGCCTTCGGGACTCTGAAACAGTGCTGCATGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT
GAATGTTGGTAAGTCCCGCACGAGCCACCTTTTCTTTGTTGCAGCGATCCGTCGAAC
TCAGGAACTGCAATGGATAACTGGAGAGTGGATAGACTCGAGTCATCTGGCTACGA
AGGGCTCACGTTCCAATGCTTAACAAGGACCCCCCTGGGGGAAACAACGGAACCTA
Claims (6)
1.一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，包括：
(1)将污水按1∶100的体积比接入富集培养基，于30℃，110r/min摇床中富集培养24h；
(2)将步骤(1)富集培养后的菌株用稀释平板涂布法转接至固体分离培养基，置于30℃恒温培养箱培养24～48h，经过3次划线分离得到纯化菌株；
(3)将纯化菌株富集后，按18～23％的接种量接种到液体分离培养基，测试菌株在30℃、好氧条件下培养24h时的反硝化率，筛选出反硝化率为75％-100％的单一菌株，转接斜面培养基，4℃下保存。
2.根据权利要求1所述的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中的富集培养基为：蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.4-7.6；固体培养基中加入18g/L的琼脂粉。
3.根据权利要求1所述的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中的分离培养基为：碳源3～5g，KNO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.02g，定容到1000ml，调节pH 7.4-7.6；固体培养基另外加1.8％W/V琼脂。
4.根据权利要求3所述的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，其特征在于：所述的碳源为乙酸钠、丙酸钠、乙醇、谷氨酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、甲醇、硫代硫酸钠、葡萄糖或碳酸氢钠。
5.根据权利要求3或4所述的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，其特征在于：所述的碳源为葡萄糖，在分离培养基中的用量为5g，培养基初始pH值为7.5。
6.根据权利要求1所述的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中的菌株经16S rDNA序列测定和分析比较，鉴定为解鸟氨酸克雷伯菌，命名为Klebsiella ornithinolytica N-4，同源性达到97％；菌株为短粗的杆菌，单独排列，无芽胞，无鞭毛，长度0.8-1.5微米，直径0.3-0.6微米；菌落呈灰白色，圆形；革兰氏染色呈阴性。
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