CN104004674B - 一株好氧反硝化细菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株好氧反硝化细菌菌株，该细菌命名为克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)HLNR05，并于2013年12月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：(GCMCC No.8539)；菌株能在好氧条件下进行反硝化作用，对模拟富营养化废水也有较强的脱氮效果，为治理污染的水体进行生物法脱氮治理提供一种良好的微生物材料。

Description

一株好氧反硝化细菌菌株
技术领域
本发明涉及微生物领域的细菌，尤其涉及一株好氧反硝化细菌菌株。
背景技术
硝酸盐是造成水体富营养化的主要污染物之一。硝酸盐污染不但影响地表水，还对地下水造成污染，被硝酸盐污染的饮用水还会直接危害人类健康。目前解决水体中氮素污染的方法有物理、化学和生物方法。随着氮素污染的不断加剧和人们对环境问题的日益重视，除氮技术，特别是生物脱氮技术已经成为控制水体污染的重要方向和手段。人们目前普遍认为，在生物脱氮过程中，硝酸盐氮在缺氧条件下被反硝化细菌还原为气态氮如N2等从水中逸出。事实上，厌氧条件下氧气的不足大大限制了细菌的生长与代谢，造成传统的反硝化效率不高。同时，由于硝化作用是在好氧条件下进行的，在同一反应体系中硝化、反硝化作用严重不同步，影响了污水的彻底脱氮。
好氧反硝化是指在有氧条件下进行反硝化的过程。好氧反硝化细菌的发现，突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路。然而，目前关于好氧反硝化菌发现的文章和专利报道不多，而且相关菌株的脱氮效果不高且应用范围有限。
本发明公布的好氧反硝化菌株能在好氧条件下进行反硝化作用，对模拟富营养化废水也有较强的脱氮效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种好氧反硝化菌株。为治理污染的水体进行生物法脱氮治理提供一种良好的微生物材料。
本发明的技术解决方案是，寻找分离出一种好氧反硝化菌株，该细菌命名为克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)HLNR05，并于2013年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：(GCMCC No.8539)。
该菌株的生物学特性为：革兰氏染色反应呈阴性，葡萄糖发酵产酸、硝酸盐还原、淀粉水解、产氨试验呈阳性，甲基红试验(M.R.)呈阴性，石蕊牛奶试验结果为产酸。在LB培养基上，培养5d时的菌落直径大约为4mm，圆形，边缘整齐；菌落呈乳白色，质地均匀，有光泽，表面湿润光滑，凸起，正反面均匀一致。最适宜pH值为7.2，最适温度28℃。
本发明所涉及的好氧反硝化细菌是通过以下方法分离筛选得到：
(1)于江西省吉水县新源污水厂氧化沟中采集的活性污泥样品10g，样品采集后加入到盛有玻璃珠的100mL无菌水中，充分混匀并静置30min后，取1mL上清液转移至100mL含硝酸盐的富集培养基三角瓶中，将该培养基置入28℃温度，振动频率为200rpm／min的振荡培养箱中培养4d。4d后取1mL菌液于99mL灭菌的含硝酸 盐的富集培养基中，在上述培养条件下培养4d，接着按同样的操作重复3次，进行4个周期的富集培养。
(2)取步骤(1)中的第4周期获得的菌液1mL，加到硝酸盐浓度提高50％的驯化培养基中，进行4个周期的驯化培养，接种量和培养条件同富集培养。获得驯化培养液。
(3)从步骤(2)中获得的驯化培养液中取菌液5份，每份为1mL，分别进行梯度稀释，选用梯度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7；从每份中分别取0.1mL所得的稀释菌液分别涂布于含有含硝酸盐的固体平板培养基中，37℃培养2d。
(4)用已灭菌的移液枪头从步骤(3)的平板培养基上挑取较大而且独立的菌落，采用划线法接种于LB固体培养基上，于28℃培养。通过3次划线获得单菌落。单菌落在新鲜LB培养基中再进行扩大培养，扩大培养后的菌种，部分置于-80℃冰箱内保种，部分置于4℃保存备用。
本发明一种好氧反硝化菌株的有益效果在于：菌株对废水中硝态氮和总氮有较强的降解能力，环境适应能力较强，对模拟富营养化废水具有强好的降氮效果。
附图说明
图1为本发明一种好氧反硝化细菌菌株HLNR05的反硝化活性曲线图；
图2为本发明一种好氧反硝化细菌菌株HLNR05同相近序列采用N-J法构建的系统进化树图；
图3为本发明一种好氧反硝化细菌菌株HLNR05在模拟富营养化废水中的解氮效果图。
具体实施方式：
实施例一
菌株(Klebsiella sp.)HLNR05的分离：
(1)于江西省吉水县新源污水厂氧化沟中采集的活性污泥样品10g，样品采集后加入到盛有玻璃珠的100mL无菌水中，充分混匀 并静置30min后，取1mL上清液转移至100mL含硝酸盐的富集培养基的三角瓶中，将该培养基置入28℃温度，振动频率为200rpm／min的振荡培养箱中培养4d。4d后取1mL菌液于99mL灭菌的含硝酸盐(N浓度139mg／L)的富集培养基中，在上述培养条件培养4d，接着按同样的操作重复3次，进行4个周期的富集培养。
(2)取步骤(1)中的第4周期获得的菌液1mL，加到硝酸盐浓度提高50％的驯化培养基中，进行4个周期的驯化培养，培养条件同富集培养，获得驯化培养液。
(3)从步骤(2)中获得的驯化培养液中取菌液5份，每份为1mL，分别进行梯度稀释，选用梯度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7；从每份中分别取0.1mL所得的稀释菌液分别涂布于含有含硝酸盐的固体平板培养基中，37℃培养2d。
(4)用已灭菌的移液枪头从步骤(3)的平板培养基上挑取一株较大而且独立的菌落，采用划线法接种于LB固体培养基上，于28℃培养。通过3次划线获得单菌落。单菌落在新鲜LB培养基中再进行扩大培养，扩大培养后的菌种，部分置于-80℃冰箱内保种，部分置于4℃保存备用。
上述富集培养基，是指以硝酸盐(NO3 --N)为氮源的富集培养基，该培养基包含以下物质组份和条件：葡萄糖5g，KNO31g，K2HPO40.5g，KCI63mg、MgSO423mg、无水CaCl223mg、NaHCO365mg、KH2PO423mg、微量元素溶液2mL，蒸馏水1000mL，pH7.2。
上述LB培养基：包含有蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g， pH7.2。
上述固体培养基为液体培养基加1.5％琼脂粉。
上述微量元素溶液，其配方(g·L-1)为：ZnSO42.2，CaCl25.5，MnCl2·4H2O5.06，FeSO4·7H2O5.0，CuSO4·SH2O1.57，COCl2·6H2O1.61。
实施例二.
菌株HLNR05的反硝化活性检测：
(1)从上述菌株(Klebsiella sp.)HLNR05的分离的第(4)步骤中获得的菌株按1∶100的量分别接种于100mL新鲜的反硝化培养基中，于28℃、200rpm／min的振荡培养箱中培养1d，且按时检测培养基中硝酸盐氮(NO3-N)以及总N浓度；以此同时设置空白对照组。其中，NO3 --N采用盐酸-萘乙二胺分光光度法；TN采用过硫酸钾-紫外分光光度法。
上述硝酸盐(NO3 --N)为氮源的硝化培养基：葡萄糖169mg，KNO337.71mg，KCI63mg、MgSO423mg、无水CaCl223mg、NaHCO365mg、KH2PO423mg、微量元素溶液2mL(配方同上)，蒸馏水1000mL，pH7.2。
(2)检测结果：株菌HLNR05在以葡萄糖为碳源，硝酸钾为氮源的培养液中培养生长时，具有明显的反硝化作用(见附图1)。24小时内，硝态氮和总氮的去除率分别达96.6％和92.1％。其中用于微生物同化作用的氮占总去除率的23.4％，其余大部分以氮气的形式散失。菌株HLNR05的反硝化活性检测结果见附图1。
实施例三
HLNR05菌株的分子鉴定：
(1)将HLNR0516S rDNA PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并用琼脂糖凝胶分离纯化试剂盒进行纯化。通过TA克隆技术将纯化后的16S rDNA片段转化到E.coli DH5a中，氨苄青霉素及蓝白斑筛选挑取阳性克隆子送上海生工进行序列测定。测序结果与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行比对分析，获得最相近菌株的16S rDNA序列。通过MEGA5.0软件，用Neighbor-joining构建系统发育进化树。
(2)RDP聚类分析表明菌株HLNR05属于β变形杆菌亚门(β-proteobacteria)克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)，相似性为99％。菌株命名为Klebsiella sp.HLNR05(见附图2)。
买施例四
应用HLNR05菌株在模拟富营养化废水中去除硝态氮和总氮的试验：
(1)实验材料
供试废水：模拟富营养化废水：葡萄糖169mg，蛋白胨88.88mg，KCI63mg，无水CaCl223mg，KH2PO423mg，MgSO423mg，NaHCO365mg，KNO337.71mg，微量元素2mL，该微元素配方(g·L-1)为：ZnSO42.2，CaCl25.5，MnCl2·4H2O5.06，FeSO4·7H2O5.0，CuSO4·5H2O1.57，COCl2·6H2O1.61，蒸馏水1L。
(2)实验方法
取1mL菌液，用无菌水清洗3次后接种于100mL新鲜的模拟富营养化废水中，28℃、200r／min的振荡培养箱中培养1d，且按时检测培养基中NO3 --N以及TN浓度。其中，NO3 --N采用盐酸-萘乙二胺分光光度法；TN采用过硫酸钾-紫外分光光度法。
(3)试验结果
HLNR05对模拟富营养化废水中NO3 --N和TN均有很好的降解效果。24小时内NO3 --N的去除率达91.4％，TN的去除率达88.2％。HLNR0524小时内的脱氮贡献率占溶液中氮去除率的87.8％，说明HLNR05菌具有将模拟废水中的NO3 --N降解的能力(见附图3)。

Claims (1)

1.一株好氧反硝化细菌菌株，该细菌命名为克雷伯氏菌属细菌Klebsiellasp.HLNR05，并于2013年12月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：GCMCC No.8539。
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