CN103013867A - 产酸克雷伯氏杆菌df-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用 - Google Patents

产酸克雷伯氏杆菌df-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用 Download PDF

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隆小华
刘元瑞
臧旸
刘兆普
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Abstract

产酸克雷伯氏杆菌DF-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年09月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6623。本发明提供的产酸克雷伯氏杆菌DF-1遗传稳定，繁殖快，亚硝酸态氮去除率高，可进行大规模培养，应用于污水的亚硝酸态氮去除。

Description

产酸克雷伯氏杆菌DF-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用
 
技术领域
本发明属于污水处理领域，尤其涉及一种产酸克雷伯氏杆菌DF-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用。
 
背景技术
近海滩涂水产养殖对世界食物供给具有十分重要的贡献，尤其对那些可利用土地少而人口众多的国家，比如像中国。2006年中国江苏的近海水产养殖面积就已经达到122，000 hm2。反硝化作用是氮的生物地球化学循环中重要的环节，然而近年来随着规模化水产养殖的快速发展，投喂过剩的饲料和饲养的水生生物排泄物积累产生的亚硝态氮已成为危害水产养殖的主要毒性物质。亚硝态氮则会影响养殖水生生物的生理功能和免疫系统。目前已有报道关于氮污染造引起的的养殖水产动物病害甚至死亡。
目前最常用的水污染处理方法主要有三种：物理法，化学法和生物法。同前两种方法相比，生物法具有处理彻底，无二次污染等优点。某些微生物可以将水体中的氮氧化物(NO2 -和NO3 -)通过气态中间产物(NO和N2O)转化为氮气，从而达到减轻水体中氮污染的目的[6，7]。目前已知的反硝化细菌多是从淡水环境中分离得来，能用于海水养殖中水处理且主要针对亚硝酸盐还原能力的报道极少。从近海滩涂养殖池底质淤泥中分离筛选出一株反硝化能力高，且适用于淡水和咸水的好氧反硝化细菌，，以期为近海养殖亚硝酸盐污染的生物修复提供技术依据。
 
发明内容：
解决的技术问题：本发明的目的是从近海滩涂养殖池底质淤泥中分离筛选出一株反硝化能力高，且适用于淡水和咸水的好氧反硝化细菌，及其去除水体中亚硝酸态氮的应用。
技术方案：
产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）DF-1，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年09月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号： CGMCC No.6623。
所述产酸克雷伯氏杆菌DF-1在去除水体中亚硝酸态氮中的应用。
所述产酸克雷伯氏杆菌DF-1在去除水体中亚硝酸态氮中的应用，步骤为：以产酸克雷伯氏杆菌DF-1为作用菌株，经扩大培养，将菌液涂布到载体表面，浸入待处理水中，形成生物膜，进而去除水体中亚硝酸态氮。
本发明所用反硝化细菌从近海滩涂养殖池底质淤泥中筛选，经16srRNA分析，属于克雷伯氏杆菌（Klebsiella），命名为产酸克雷伯氏杆菌DF-1（Klebsiella oxytoca DF-1），该菌株的生理生化特征是（+表示生长，－表示抑制）：
革兰氏染色阴性，菌落呈圆形，边缘整齐，乳脂色，半透明，凸起，表面光滑，半流质，直径3～6 mm。
葡萄糖发酵 +，MR－， VP－， 克氏柠檬酸盐 +，H2S +，NO3还原 +。
pH：3－，5 +，7 +，9 +，11 +，12－。
‰盐度试验：0‰ +， 5‰ +， 10‰ +， 15‰－。
℃温度试验：15℃ +，20℃ +，25℃ +，30℃ +，35℃ +，40℃ +。
有益效果：
本发明利用从近海滩涂养殖池底质淤泥中筛选的反硝化细菌Klebsiella oxytoca DF-1去除水体中亚硝态氮，属于生物法处理污水领域。此方法不仅具有生物法处理污水的优点，同时作为海洋微生物，开辟了海洋微生物资源研究和开发新途径。该菌株遗传稳定，繁殖快，去除作用强，资源保护，环境友好，对水体特别是养殖水体亚硝态氮的去除，具有广阔的前景和意义。
 
附图说明
图1为反硝化细菌DF-1平板生长图；
图2不同pH条件下反硝化细菌DF-1生长及亚硝酸盐氮降解曲线；
图3不同温度条件下反硝化细菌DF-1生长及亚硝酸盐氮降解曲线；
图4不同盐度条件下反硝化细菌DF-1生长及亚硝酸盐氮降解曲线。
产酸克雷伯氏杆菌DF-1最适生长条件：温度35℃，pH 8-9，盐度5‰，产酸克雷伯氏杆菌DF-1能充分利用蔗糖，葡萄糖，乙酸钠，丁二酸钠，酒石酸钾钠。在此条件下，亚硝化细菌Klebsiella oxytoca DF-1的亚硝态氮去除率超过90%。
 
具体实施方式：
实施例1：
以产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）DF-1为作用菌株，经母种制备，扩大培养，将菌液涂布到载体表面，浸入待处理水中，形成生物膜。具体操作步骤是：
（1）用液体SM培养基富集微生物，即将底质淤泥加入到已灭菌的液体SM培养基中培养。SM液体培养基配方为：0.284%wt丁二酸钠，0.0015%wt NaNO2，0.136%wt KH2PO4，0.027%wt (NH4)2SO4，0.1%wt 酵母提取物，0.019%wt MgSO4·7H2O，0.368 %wt NaCl，pH 8.2。
（2）用固体DM培养基初筛微生物，即用液体SM培养基中的菌液在固体DM培养基上划线37摄氏度培养，固体DM培养基配方为： 0.472%wt丁二酸钠，0.0015%wt NaNO2，0.15%wt KH2PO4，0.042%wt Na2HPO4，0.06%wt NH4Cl，0.5%wt 酪蛋白氨基酸，0.368 %wt NaCl，pH 8.2，2%wt琼脂。
（3）用BTB培养基复筛反硝化细菌，即挑取DM固体培养基上菌落在BTB培养基上划线，使BTB培养基有绿色变为蓝色的微生物是反硝化细菌。BTB培养基配方为： 0.1%wt L-天冬酰胺，0.1%wt KNO3，0.1%wt KH2PO4，0.005%wt FeCl2·6H2O，0.02%wt CaCl2·2H2O，0.1%wt MgSO4·7H2O，0.368%wt NaCl，1g/L BTB(溶剂为1%wt乙醇溶液)，pH7.0，2%wt琼脂。
（4）用液体DM培养基筛选产酸克雷伯氏杆菌DF-1，即将使BTB培养基由绿变蓝的菌株加入到液体DM培养基培养，计算不同菌株亚硝态氮去除率，选取去除率最大的菌株。
（5）将筛选出的最适菌株进行序列分析及系统发育分析。用于16S rRNA PCR反应的引物为通用引物，PF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，PR：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系（20uL）：2.0uL 10×PCR缓冲液；0.4uL dNTP；1.0uL引物PF；1.0uL引物PR；2uL模板；0.2uLTaq酶；13.4uL超纯水。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃，1 min；57℃，1 min；72℃ ，1 min；进行30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，通过片段大小确定是否为目的片段，然后将含有目的片段的PCR产物再经琼脂糖凝胶电泳后用DNA胶回收试剂盒进行片断回收，回收产物进行PCR产物测序，测序为双向引物测序，测序引物为27F和1492R，将所测序列经BLAST程序与GenBank核酸数据库进行比对分析，用Custal X1.8软件进行多重比较分析，再用MEGA5.0软件中Neighbor-Jioning方法构建系统发育树。
（6）经过菌体形态、生理生化、16srRNA分析鉴定，确定所选菌株属于克雷伯氏杆菌（Klebsiella），命名为产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）DF-1。以产酸克雷伯氏杆菌DF-1为作用菌株，经母种制备，扩大培养，将菌液涂布到载体表面，浸入待处理水中，形成生物膜。在生物膜形成和稳定过程，对亚硝态氮的去除作用会持续进行，处理实验结果如下表所示。
表1 不同碳源对反硝化细菌DF-1生长及反硝化性能的影响
碳源 菌体A600值 起始NO2 -含量（mg/L） 最终NO2 -含量（mg/L） 去除率﹪
蔗糖 0.53 10.011±0.021 0.069±0.132 99.3
葡萄糖 0.31 10.009±0.013 0.233±0.125 97.7
乳糖 0.06 10.004±0.032 8.010±0.157 20.1
乙酸钠 0.58 9.999±0.025 0.051±0.146 99.5
丁二酸钠 0.36 10.002±0.047 0.354±0.133   96.5
柠檬酸钠 0.08 10.011±0.031 8.026±0.141 19.8
酒石酸钾钠 0.23 10.000±0.026 0.823±0.098 91.8
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京农业大学
 
<120>  产酸克雷伯氏杆菌DF-1及其去除水体中亚硝酸态氮的应用
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
agagtttgat cctggctcag                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ggttaccttg ttacgactt                                                  19
 
 

Claims (3)

1.产酸克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）DF-1，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年09月25日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号： CGMCC No.6623。
2.权利要求1所述产酸克雷伯氏杆菌DF-1在去除水体中亚硝酸态氮中的应用。
3.权利要求2所述产酸克雷伯氏杆菌DF-1在去除水体中亚硝酸态氮中的应用，其特征在于步骤为：以产酸克雷伯氏杆菌DF-1为作用菌株，经扩大培养，将菌液涂布到载体表面，浸入待处理水中，形成生物膜，进而去除水体中亚硝酸态氮。
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