CN105420165A - 一株好氧反硝化细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株好氧反硝化细菌变形假单胞菌（<i>Pseudomonas？plecoglossicida</i>）YIM？DC16，该菌株已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.11077；其是具有好氧反硝化能力的微生物菌株；本发明菌株在有氧或限氧条件下能利用葡萄糖、琥珀酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钠等多种碳源进行好氧反硝化作用；该菌株在以葡萄糖为碳源、KNO₃为唯一氮源的液体培养基中，培养条件为20℃、100？rpm、初始pH？7.5、C/N=15时，培养36？h后对硝态氮的去除率达到90.07？%，总氮的去除率也可到达76.99？%，具有较好的市场应用前景。

Description

一株好氧反硝化细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及到一株好氧反硝化细菌菌株及其应用。

背景技术

氮是动物合成蛋白和植物生长必不可少的主要成分，是生物体最重要的营养元素之一。然而随着城市扩展及工、农业的发展，人类过度的向水体中释放含氮化合物，超过环境的承载能力，不仅造成了水体富营养化和水华风险，含氧量减少，生物多样性降低，使水体生态系统遭到破坏等各种影响，同时还严重影响到人体健康。因此人们越来越重视氮素污染的治理以及脱氮工艺的创新。

脱氮工艺可分为物理与化学脱氮法（简称“物化法”）和生物脱氮法，前者往往具有操作费用高，容易造成二次污染等缺点。相对于物化法，生物脱氮是对环境影响较小且经济有效的一种脱氮工艺。传统的生物脱氮由于具有良好的脱氮效率而受到广泛认可，但由于其由好氧硝化和厌氧/缺氧反硝化两部分工艺组成，也造成了操作复杂、能耗大以及运行费用高等缺点。传统理论认为反硝化只有在厌氧或缺氧的条件下才可以进行，而随着好氧反硝化现象的发现以及不断分离得到好氧反硝化细菌的增加，促进了新型脱氮工艺的发展。传统的生物脱氮方法中主要是在有氧条件下由硝化细菌将NH₄ ⁺-N氧化为NO₃ ^--N，之后再在缺氧条件下将NO₃ ^--N转化为N₂，而好氧反硝化细菌的发现则可将硝化和反硝化反应在同一反应器内实现即同步硝化反硝化，大大节省了操作时间与费用。

实现同步硝化反硝化工艺的研究主要基于好氧反硝化菌。反硝化菌为异养菌，而浅层地下水中COD浓度较低，需要外加碳源才能满足反硝化作用，因而研究碳源类型、碳氮比对反硝化菌脱氮性能的影响，可以找到更加有效经济的碳源，从而提高反硝化效率。因此，从自然界中分离高效好氧反硝化菌株并优化其反硝化条件，将对此工艺的发展起到很好的促进作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株具有高效好氧反硝化能力的菌株，为生物脱氮、治理高氮污染水体提供一种良好的微生物材料。

本发明从昆明滇池底泥样品中分离筛选出一株好氧反硝化菌株，该菌株命名为变形假单胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）YIMDC16，并于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.11077。

该菌株的生物学特征为：细胞呈杆状，有鞭毛，端生；菌落在LB培养基上的形态特征为乳白色，圆形，表面光滑；革兰氏染色反应呈阴性，接触酶、氧化酶、硝酸盐还原和精氨酸水解为阳性；硝基-D甲基半乳糖水解，吲哚反应、VP实验、H₂S产生、色氨酸脱氨酶、赖氨酸脱酸酶、鸟氨酸脱羧反应、葡萄糖产酸发酵、脲素水解、七叶灵水解和明胶液化均为阴性。菌株能利用葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸、蔗糖、柠檬酸钠和苯乙酸作为碳源；不能利用阿拉伯糖、甘露醇、N-乙酰葡糖糖胺、麦芽糖和己二酸实验作为碳源。

本发明所涉及的好氧反硝化细菌是通过富集、梯度稀释、选择性培养基培养并结合定性筛选中的颜色反应等方法筛选得到的。

本发明好氧反硝化细菌的16SrRNA基因序列如序列表SEQIDNO：1所示。

本发明菌株变形假单胞菌（P.plecoglossicida）YIMDC16，可以利用多种碳源，如葡萄糖、乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠为唯一碳源并在KNO₃作为唯一氮源条件下进行生长；且在温度为15-35℃、pH在7.5-9.0、转速为100rpm条件下具有较好的脱氮能力。

本发明另一目的是将上述好氧反硝化细菌变形假单胞菌（P.plecoglossicida）YIMDC16应用在高硝氮废水的治理中。

本发明菌株变形假单胞菌（P.plecoglossicida）YIMDC16在以NO₃ ^--N为唯一氮源、葡萄糖为唯一碳源并在C/N为15、初始pH为7.5、培养条件为20℃、100rpm培养时，YIMDC16可以在36h时对硝态氮（NO₃ ^--N）的去除率可以达到90.07%，总氮（TN）的去除率也可到达76.99%，此时NO₂ ^--N的含量也只有0.05mg/L。

附图说明

图1为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16细胞的透射电镜图片；

图2为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16与相近菌株的16SrDNA序列采用N-J法构建的系统进化树；

图3为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同碳源下的反硝化脱氮结果示意图；

图4为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同温度下的反硝化脱氮结果示意图；

图5为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同pH下的反硝化脱氮结果示意图；

图6为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同转速下的反硝化脱氮结果示意图；

图7为本发明好氧反硝化菌株YIMDC16在不同C/N下的反硝化脱氮结果示意图；

图8为本发明菌株YIMDC16在最佳反硝化条件下的脱氮效果图；

图9为本发明的菌株YIMDC16对模拟高硝氮废水的脱氮效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不限于所述内容，实施例中如无特殊说明，均为常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：好氧反硝化菌株YIMDC16的分离

（1）所使用的培养基及成分如下：

富集培养基（g/L）：KNO₃2g、K₂HPO₄1g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、柠檬酸钠5g、微量盐溶液2mL；蒸馏水1000mL，用1NNaOH调节pH7.0-7.2；

其中微量盐溶液（g/L）：EDTA50g、ZnSO₄·7H₂O22g、CaCl₂5.54g、MnCl₂·4H₂O5.06g、FeSO₄·7H₂O4.99g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O1.10g、CuSO₄·5H₂O1.57g、CoCl₂·6H₂O1.61g。

BTB培养基（g/L）：即溴百里酚蓝（BTB）选择性培养基，琼脂15g、KNO₃1g、KH₂PO₄1g、FeCl₂·6H₂O0.5g、CaCl₂·7H₂O0.2g、MgSO₄·7H₂O1g、琥珀酸钠8.5g、BTB（1%溶于酒精）1mL；蒸馏水1000mL，用1NNaOH调节pH7.0-7.2。

LB培养基（g/L）：蛋白胨10g、NaCl5g、酵母提取物5g、琼脂15g。

反硝化培养基（g/L）：KNO₃0.6g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、柠檬酸钠5g；去离子水1000mL，用NaOH调节pH7.0。

（2）筛选方法

采集昆明滇池底泥样品，称取底泥2g放入含有100mL富集培养基的三角瓶中，30℃、160rpm条件下培养24h。将富集液进行梯度稀释，选用梯度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，每一梯度取0.2mL的稀释液均匀涂布于BTB培养基表面，放入恒温培养箱30℃培养1-2d，挑取使周围培养基变为蓝色的单菌落，并在LB培养基上纯化，即得到初筛菌株。

将初筛菌株接于反硝化培养基中，30℃、160rpm条件下培养48h进行定性复筛，吸取培养液滴于干净白瓷板上，加入Griess溶液Ⅰ、溶液Ⅱ各1滴，如果溶液显红色则显示培养液中有亚硝态氮存在；无色，加入二苯胺-硫酸试剂，生成蓝色沉淀，则说明有硝态氮存在，无色则说明既无亚硝态氮也无硝态氮。

上述Griess试剂（亚硝态氮定性检测试剂），其配方为：溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g溶于溶液150mL醋酸溶液(30%)中；溶液Ⅱ：称取a-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水中，沸水浴后，缓缓加入30%醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。

上述二苯胺-硫酸试剂（硝态氮定性检测试剂），其配方为：称取二苯胺1g溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸100mL，保存于棕色瓶中。

结合上述两种方法筛选到一株好氧反硝化菌株YIMDC16。

实施例2：菌株YIMDC16菌株的分子生物学鉴定

（1）菌落形态特征：YIMDC16在LB培养基上培养24h后的菌落形态特征为圆形，表面光滑，乳白色。革兰氏染色呈阴性，菌体呈杆状，有鞭毛（见图1）。

（2）利用Takara公司的LysisBuffer提取菌株YIMDC16的基因组DNA，以其为模版，PCR扩增其16SrRNA基因，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并通过胶回收试剂盒进行DNA纯化。利用TA克隆技术将菌株YIMDC16的16SrRNA基因片段转化到E.coliDH5α中，挑选阳性克隆子送上海生工进行序列测定，序列如序列表SEQIDNO：1所示；测序结果与GenBank和Eztaxon数据库中的16SrRNA基因序列进行比对分析，获取相近的菌株的16SrRNA基因序列，通过MEGA6.0软件用Neighbor-joining构建系统发育树（见图2）。

通过Blast和Eztaxon在线比对分析，菌株YIMDC16与变形假单胞菌（P.plecoglossicida）的典型菌株NBRC103162^T的16SrRNA基因序列相似度最高，其相似性为99.7%，根据生理生化特征（见表1）和系统发育分析，菌株被命名为变形假单胞菌（P.plecoglossicida）YIMDC16。

表1：P.plecoglossicidaYIMDC16和典型菌株PseudomonasplecoglossicidaNBRC103162^T的特征区别

。

实施例3：不同的环境因子对好氧反硝化菌株YIMDC16脱氮效能的影响

基础培养基：KNO₃0.6g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、去离子水1000mL。

不同碳源对菌株反硝化效能的影响：分别以葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠和甲醇作为唯一碳源进行反硝化效果测试实验，30℃、160rpm条件下培养48h。结果表明好氧反硝化菌在蔗糖和甲醇培养基中反硝化效果均不是很好，而在葡萄糖、琥珀酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠和酒石酸钠培养基中反硝化效果都较好，尤其在葡萄糖、柠檬酸钠和酒石酸钠培养基中，硝酸盐去除率在95%以上，且在以葡萄糖为碳源的培养基中NO₃ ^--N和TN的去除率最高，分别为100%和82.11%（图3）。

温度对好氧反硝化菌生长和反硝化能力的影响：分别选定了15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃共6个不同的温度条件，考察其对好氧反硝化菌株YIMDC16的生长及脱氮能力的影响。其中配制的培养基以葡萄糖为碳源，C/N为15。试验结果表明菌株在15-35℃均具有较高的脱氮效果，其中在20℃时脱氮效果最佳，NO₃ ^--N和TN的去除率分别为96.08%和82.68%（图4）。

pH值对好氧反硝化菌生长和反硝化能力的影响：分别选定5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9共9个不同的pH值条件，考察其对好氧反硝化菌株YIMDC16的生长及脱氮能力的影响。其中配制的培养基以葡萄糖为碳源，C/N为15，培养温度为20℃。试验结果表明菌株YIMDC16在酸性条件（pH=5）下基本没有反硝化效果，其反硝化作用最适条件为中性偏碱(pH=7.5-9.0)。pH在7.5-9.0之间时脱氮效率差异不大，NO₃ ^--N的去除率都在95%以上，而TN的去除率也都在70%以上（图5）。

不同溶氧对菌株生长及反硝化效能的影响：分别选定0、50、100、150和200rpm共5个不同的转速，考察溶氧对好氧反硝化菌株生长及脱氮能力的影响。其中配制的培养基以葡萄糖为碳源，C/N为15，培养温度为20℃，初始pH为7.5。试验结果表明菌株YIMDC16在0-200rpm范围内均可以生长，但在100rpm时NO₃ ^--N和TN反硝化效果最佳，TN和NO₃ ^--N的去除率分别为77.91%和94.17%（图6）。

不同C/N条件下对菌株反硝化效能的影响：调节葡萄糖的含量使C/N为4、6、8、10、12、15、18和20，考察C/N对好氧反硝化菌株生长及脱氮能力的影响。培养温度为20℃，初始pH为7.5。实验结果表明菌株YIMDC16在C/NC=4-15范围内随着C/N的增加，反硝化效率也随之增加。在C/N=18时脱氮率达到最高TN去除率为83.98%，但C/N为18时其OD600对于C/N为15时有较大幅度增加，但TN的去除率差异不大，结合OD600和TN去除率DC16的最适C/N为15（图7）。

综上所述，变形假单胞菌（P.plecoglossicida）YIMDC16在以葡萄糖为碳源，KNO₃为唯一氮源的液体培养基中，培养条件为20℃、100rpm、初始pH7.5、C/N=15时，脱氮效率最优。在脱氮最优的条件下，当接种量为3%（v/v），培养36h时，NO₃ ^--N的去除率达到90.07%，TN的去除率也可到达76.99%，此时NO₂ ^--N的含量很低，仅有0.05mg/L（见图8）。

实施例4：好氧反硝化菌株YIMDC16在模拟高氮废水中反硝化效能评价

（1）实验材料

种子培养基（g/L)：葡萄糖3.12g、KNO₃0.6g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、pH7.0左右。

供试废水：模拟高硝氮废水（g/L）：KNO₃1.08g、葡萄糖5.63g、NaHCO₃0.68g、MgSO₄·7H₂O0.1g、KH₂PO₄0.045g、Na₂HPO₄·12H₂O0.242g、微量元素0.2mL（同实施例1），pH7.5。

（2）实验方法

以种子培养基活化YIMDC16于30℃、160rpm条件下培养至OD600为1.0左右，将培养得到的菌液进行离心（1000rmp，10min)，用PBS洗涤一次后制成菌悬液以3%接种量（体积比）接种于100mL的模拟高氮废水中；在20℃、100rpm的条件下进行培养，每隔一定时间测定OD600，并在测定完OD600后，对菌液进行离心（1000rmp，10min)，取上清测定NO₃ ^--N，NO₂ ^--N和TN。

（3）实验结果

YIMDC16对模拟高硝氮废水有较好的NO₃ ^--N降解效果，并在降解过程中有很少的NO₂ ^--N积累量。48h内对NO₃ ^--N的去除率达到100%，TN的去除率达86.74%，说明DC16对模拟废水中的NO₃ ^--N具有较好的降解能力以及可用于高硝氮废水的治理应用中（见图9）。

序列表

<110>云南大学

<120>一株好氧反硝化细菌及其应用

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1529

<212>DNA

<213>PseudomonasplecoglossicidaYIMDC16

<400>1

agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc60

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aggggaacctgcggctggatcacctcctt1529

Claims (2)

1.一株好氧反硝化细菌变形假单胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）YIMDC16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.11077。

2.权利要求1所述的好氧反硝化细菌在高硝氮废水治理中的应用。