CN113234608A - 一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌，所述菌株经过18SrDNA菌株鉴定测序序列分析结果确定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，该菌株已于2021年1月保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2021030，经检测该菌剂投放用于水产养殖池塘中，可以稳定降解亚硝酸盐和铵态氮，又不会对水体有益微生物以及鱼虾蟹等养殖生物产生毒害，能够改善水产养殖池塘的水质；还可以用于其他方面亚硝酸盐的去除工作。

Description

一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌及其应用。
背景技术
亚硝酸盐的积累是造成养殖水体污染的主要原因之一，是诱发水产动物爆发性疾病的重要环境因素。在水产养殖中，除了养殖动物外，还有大量的浮游植物和藻类，仅以这些植物为食远远不能满足高密度水产养殖动物的需求，因此，需要人工饵料来满足养殖动物的营养需求。然而,为了追求高收益在短时间内,许多养殖企业和农民增加太多的人工鱼饵,结合繁殖动物的排泄物和分泌物的积累,导致养殖水体的严重污染,最重要的氮污染物是氨和亚硝酸盐。亚硝酸盐是将氨转化为硝酸盐的中间体。一旦硝化过程被阻止，亚硝酸盐就会在水生生态系统中迅速积累。铵态氮和亚硝酸盐含量过高，严重影响了水生生物的生存和生长，给养殖造成了巨大的经济损失。
在水产养殖中，生物脱氮菌主要是硝化反硝化菌和厌氧氨氧化菌。除上述细菌菌株外，酵母作为一种优良的环境污染物降解菌，已被国内外学者研究。它不仅在葡萄酒工业中发挥着重要的作用，而且在各种污水的处理、废物的利用和污染土壤的修复中得到了更广泛的应用。然而，从现有专利和文献来看，酵母作为一种亚硝酸盐去除菌株的详细报道很少。
因此找寻可降解亚硝酸盐的酵母菌株成为本领域技术人员研究的主要方向。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供了一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌，所述菌株经过18SrDNA菌株鉴定测序序列分析结果确定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，该菌株已于2020年12月保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2021030，经检测该菌株制备的菌剂投放用于水产养殖池塘中，可以稳定降解亚硝酸盐和铵态氮，又不会对水体有益微生物以及鱼虾蟹等养殖生物产生毒害，能够改善水产养殖池塘的水质；还可以用于其他方面亚硝酸盐的去除工作。
本发明的具体技术方案是：
本发明所获得的菌株具体来源为山东省日照市万平风景区的海水样中筛选获得的，暂命名为WP-1，发明人于2021年1月7日提交至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为：CCTCC M2021030；
发明人进一步采用生理特性试验和18S rDNA分子鉴定方法对WP-1菌株进行综合鉴定，其中18S rDNA分子鉴定方法程序为：热曲线包括:95℃变性5min，然后是30个循环，包括95℃变性30min,55℃退火30min,72℃延伸1min；最后在72℃延长10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送测序公司(中国山东华大基因)，其18S rDNA核苷酸序列如Seq ID No：1所示；将获得的序列与GenBank数据库中可用的序列进行查询，发现WP-1与GenBank数据库中异常威克汉姆酵母的18S rDNA序列有99％-100％的同源性，结果确定上述WP-1菌株类别为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)；
经过实验，发明人发现上述异常威克汉姆酵母(WP-1)的最适生长条件为：温度30℃，碳源选择为葡萄糖，碳氮源的添加比列为20：1，pH＝6时异常威克汉姆酵母(WP-1)的生长速度最快；
基于上述发现，发明人确定当上述异常威克汉姆酵母(WP-1)作为降解亚硝酸盐的菌株时，其最佳降解条件为：温度30℃，碳源选择为葡萄糖，碳氮源的添加比列为20：1，pH＝6，上述条件下异常威克汉姆酵母(WP-1)对亚硝酸盐和铵态氮的降解率最高。
本发明提供的异常威克汉姆酵母，生殖的方式为出芽生殖，所以对高温、高压、氧化等不良的环境造成的影响不敏感，它的这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。本发明进一步验证了异常威克汉姆酵母(WP-1)的应用效果，将其投放入养殖池塘中后，异常威克汉姆酵母(WP-1)的对水中亚硝酸盐氮的降解率在48h内可达到98％。本发明筛选得到的异常威克汉姆酵母(WP-1)经过安全性试验等证明，其对环境无污染，无残留，同时也具有生物环保等特性，在水产养殖中降解亚硝酸盐等有害物质具有显著的效果。
综上所述，本发明所提供的菌株制备的菌剂投放用于水产养殖池塘中，可以稳定降解亚硝酸盐和铵态氮，又不会对水体有益微生物以及鱼虾蟹等养殖生物产生毒害，能够改善水产养殖池塘的水质；还可以用于其他方面亚硝酸盐的去除工作。
保藏信息
保藏时间：2021年1月7日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC M 2021030
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山
分类命名:异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces anomalus)
附图说明
图1为亚硝酸盐氮标准曲线，
图2为铵态氮标准曲线，
图3为异常威克汉姆酵母WP-1的菌落形态图，
图4为异常威克汉姆酵母WP-1在显微镜下形态图，
图5为异常威克汉姆酵母WP-1的系统发育树，
图6为异常威克汉姆酵母WP-1的安全性试验结果，
图7为异常威克汉姆酵母WP-1在不同条件下的生长速度结果，
图8为异常威克汉姆酵母WP-1的在不同条件下的对亚硝酸盐氮和铵态氮的降解结果。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配置方法如下表1：
表1培养基成分
Figure BDA0003091804010000031
实施例1异常威克汉姆酵母WP-1的分离与鉴定
原始水样取自山东省日照市万平风景区；将12.5mL水样样品富集于含有亚硝酸盐富集培养基的250mL无菌锥形瓶中，28℃72h；每天添加12.5mL新鲜富集培养基。
经过上述28℃培育72h后，将接种的菌株稀释10倍，取0.5mL均匀涂布于分离培养基表面，28℃培养72-96h。
样品自然干燥后，将培养皿倒置置于30℃恒温培养箱中培养。根据菌落形态特征和优势度，共分离到8株具有代表性的菌种。根据菌落的颜色和形态特征，选择有代表性的单株菌落，整理纯化培养基平板，直至获得单株菌落。将分离纯化的菌株转移到A8190琼脂培养基上，4℃保存。
将从样品中分离得到的8株菌，在分离液培养基中进行活化接种。将获得的8个菌种分别取2.5mL于最初浓度为180mg/L的NH4+-N和150mg/L的NO2 ˉ-N的100mL富集培养液中，经28℃摇床培养48h，8000r/min离心10min，测定其质量浓度。测得剩余NO2 ˉ-N、NH4 +-N的质量浓度的测定采用N-(1-蔡基)-乙二胺光度法(国家标准GB/T7493-1987)、和纳氏试剂光度法测定(国家标准HJ535-2009)标准方法。标准曲线如图1和2所示，计算降解率如下:
亚硝酸盐氮降解率(％)＝|T初始-T末|/T初始×100％
(T初始:培养前NO2 ˉ-N浓度；T末:培养结束时NO2 ˉ-N浓度)
铵态氮降解率(％)＝|T初始-T末|/T初始×100％
(T初始:培养前NH4+-N浓度；T末:培养结束时NH4+-N浓度)
经过实验评估，其中菌株WP-1的降解率最高。
发明人进一步对菌株WP-1进行了形态学鉴定
将处于对数生长期且菌落大小较稳定的菌株WP-1进行菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态的单菌落状态描述，进行显微镜下形态观察。所得单菌落大小为10-12mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面平滑，边缘规则。(如图3和4所示)；
WP-1的18SRNA序列同源性分析
热曲线包括95℃变性5min,95℃变性30min,55℃退火30min,72℃延伸1min的30个循环；最后在72℃延长10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送测序公司(中国山东华大基因)，其18S rDNA核苷酸序列如Seq ID No：1所示；将获得的序列与GenBank数据库中可用的序列进行查询比对，确定菌株类型为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。
WP-1的菌株理化性质鉴定
1、对不同糖源的同化结果表明，WP-1菌不能进行乳糖发酵，但能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉。见表2。
表2不同糖源的同化
Figure BDA0003091804010000041
注"+"表明可发酵and"-"表明不可发酵。
2、菌株WP-1对不同碳源的同化结果表明，WP-1不能同化乳糖、木糖、柠檬酸和甲醇，但能同化可溶性淀粉、葡萄糖、乙酸钠和甘油。见表3。
表3不同碳源的同化
Figure BDA0003091804010000042
注"+"表明可发酵and"-"表明不可发酵
3、同化物碳源试验、同化物氮源试验、无维生素培养基生长试验、不含微量元素的培养基上生长试验见表4。
表4理化试验
Figure BDA0003091804010000043
注:“+”表示菌株能正常生长；“-”表示菌株不能正常生长。
根据上述生理生化特性结果结合系统发育树(图5所示)，最终鉴定该WP-1菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。
实施例2异常威克汉姆酵母(WP-1)的安全性检测试验
凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)是重要的水生物种之一，因此选择该菌株进行生物安全性评价：
选取日照市某养殖场健康虾(3±1cm)，提前7天在8‰海盐配制的人工海水中养殖，选用已经进行曝气处理的自来水作为实验用水。ClO2消毒后，将虾随机分为3个实验和3个对照组，各于5L人工海水池(烟台壹塑料包装制品有限公司)，每一组有30只虾。离心100mL菌液(1.5×108cfu/mL经过优化实验得出的最佳接种量)，重悬10mL灭菌海水，用相同体积的灭菌海水洗涤2-3次。实验组在每个水箱中加入1mL悬浮菌细胞，对照组在每个水箱中加入1mL灭菌海水。试验组和对照组各设3个重复。在实验过程中，对虾的喂养按照正常流程进行每天完全更换海水。换水后，实验组加入1mL悬浮菌细胞，对照组替换1mL杀菌海水。存活7天的虾的数量被记录下来。
实验虾和对照虾的存活率如图6所示。添加WP-1菌的实验组的累积存活率为85％，未添加WP-1菌的对照组的累积存活率为81％，说明实验组与对照组之间无显著差异。
实验组接种WP-1菌量约为1×108cfu/mL，说明WP-1菌株对南美白对虾具有较好的生物安全性。
实施例3温度、pH、碳源种类和C/N对WP-1菌株生长速率的影响
在250mL锥形瓶中，加入1.4×108cfu的WP-1-1 5％(v/v)菌株溶液和95％(v/v)基础培养基:0.05g NaNO2、0.5g葡萄糖、0.05g KH2PO4、0.01g MgSO4·7H2O、0.5mL FeSO4·EDTANa2(*1000)和无菌水，使总容量为100mL。
摇床中180r/min培养48h，重复3次。
pH设置为4、5、6、7、8、9；温度设置为15、20、25、30、35、40℃；
碳源种类是蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油和不加碳源做对照(不同碳源的添加量都为0.5g)；
C/N(葡萄糖/亚硝酸钠)是10：1，15：1，20：1，25：1，30：1和35：1；(上述比例调节通过改变培养基中物质的添加量实现)
在不同pH、温度、碳源和C/N的设置下，每个样品取样三次，在显微镜下利用血球计数板计数，取平均值研究WP-1菌株的生长速率。
在单一条件下，采用控制变量法进行实验，结果如图7所示。
A为不同pH值下菌株WP-1的生长情况。从图中可以看出，当pH＝6时，菌株生长速度最快，48h时菌株含量为7.98×108CFU/mL；
B为不同温度下WP-1菌株的生长情况。从图中可以看出，当温度为30℃时，菌株生长速度最快，48h时菌株含量为12.1×108CFU/mL；
C为以不同碳源为基本培养基组分的WP-1菌株的生长状况。以葡萄糖为碳源时，菌株wP-1的生长状况最好，48h时菌株含量达到9.86×108CFU/mL；
D为以葡萄糖为碳源时，不同碳源和氮源添加比例对菌株生长速率的影响。由上述实验可知，当C/N为20/1时，菌株的生长速度最快，48h时菌株数量为10.72×108CFU/mL。
实施例4在不同pH、温度、培养基转速下WP-1对亚硝酸盐和铵态氮降解的影响
采用控制变量法研究了不同条件下WP-1菌对48h亚硝酸盐和铵态氮降解的影响，结果见图8。
其中A为WP-1菌在不同温度下WP-1菌的降解情况。当温度为30℃时对亚硝酸盐的降解率为82.9％，铵态氮的降解率81.9％；
B为不同pH值下WP-1菌的降解情况。当pH＝6时，亚硝酸盐的降解率为77.7％，铵态氮的降解率75.6％都为最佳；
C为WP-1菌在不同培养基转速下的降解结果。当菌株WP-1在转速为120r/min时降解亚硝酸盐氮和铵态氮的效率最高，48h时对亚硝酸盐氮和铵态氮的降解率为最高，为85.5％和79.5％。
当培养温度30℃、pH为6和培养箱转速120r/min，此时菌株WP-1降解率为91.4％，达到最佳值。
实施例5WP-1菌在实际池塘中的降解研究。
池塘选址为山东省日照市日照职业技术学院水产养殖学院水产养殖5×6×1m养虾池塘，调节池塘的水体初始pH为6,试验水温控制在28-30℃。本试验研究了在投放菌株前后池塘中亚硝酸盐的含量变化。
在未投放异常威克汉姆酵母WP-1前24h时，池塘中亚硝酸盐含量为0.210μg/mL，在将要投放异常威克汉姆酵母WP-1的前12h时，池塘中亚硝酸盐的含量为0.303μg/mL；经过12h后向池塘泼洒经过优化实验和安全性实验得到的菌株，菌株用量为：在泼洒前用梯度稀释法进行菌种计数，菌液投加量可使得菌液泼洒终浓度为107个/L，最终确定异常威克汉姆酵母WP-1菌液投放量为3-4L，泼洒后的12h测得亚硝酸盐的含量为0.016μg/mL，24h后为0.009μg/mL，48h后测得的亚硝酸盐含量为0.006μg/mL。
可见异常威克汉姆酵母WP-1降解率达到98％，在实际应用中对亚硝酸盐的降解效果较之实验室中的效果更好，可见该菌株可以用于水体中亚硝酸盐的降解。经过以上菌株特性及应用研究可知，该菌株作为一株益生菌可很好的用于水产养殖中的亚硝酸盐降解。
序列表
<110> 山东工匠生物科技有限公司
<120> 一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 617
<212> DNA
<213> 异常威克汉姆酵母菌 (Wickerhamomyces anomalus)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tagtattcta ttgccagcgc ttaattgcgc 60
ggcgataaac cttacacaca ttgtctagtt tttttgaact ttgctttggg tggtgagcct 120
ggcttactgc ccaaaggtct aaacacattt ttttaatgtt aaaaccttta accaatagtc 180
atgaaaattt ttaacaaaaa ttaaaatctt caaaactttc aacaacggat ctcttggttc 240
tcgcaacgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtattg tgaattgcag attttcgtga 300
atcatcgaat ctttgaacgc acattgcacc ctctggtatt ccagagggta tgcctgtttg 360
agcgtcattt ctctctcaaa ccttcgggtt tggtattgag tgatactctg tcaagggtta 420
acttgaaata ttgacttagc aagagtgtac taataagcag tctttctgaa ataatgtatt 480
aggttcttcc aactcgttat atcagctagg caggtttaga agtattttag gctcggctta 540
acaacaataa actaaaagtt tgacctcaaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca 600
tatcaataag cggagga 617

Claims (3)

1.一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌，其特征在于：其生物保藏编号为CCTCCM 2021030；属于异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。
2.根据权利要求1所述的可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌，其特征在于：其18SrDNA核苷酸序列如Seq ID No：1所示。
3.权利要求1所述可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌在降解亚硝酸盐和铵态氮中的应用。
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