CN110217895A

CN110217895A - 一种用于水环境治理的复合微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN110217895A
Application number: CN201910470965.XA
Authority: CN
Inventors: 刘双江; 朱愿; 刘志培; 冯婕; 姜成英; 魏大伟; 彭潇; 柳晓东; 高喜燕; 刘缨; 吴梦茹
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110217895B

Abstract

本发明涉及复合微生物菌剂，具体公开了一种用于水环境治理的复合微生物菌剂及其应用。所述复合微生物菌剂包括：耳炎假单胞菌、昆明假单胞菌、亚洲假单胞菌、产碱菌，菌剂总活菌数不低于1×10⁹cfu/mL。本发明复合微生物菌剂成本低，对环境无污染，以0.01‑0.1％投加比例处理污染水体，1‑2周后氨氮的去除效率接近100％，总氮消除达60％以上，同时未造成任何亚硝酸盐和硝酸盐积累，且功能菌株在修复完成后得到原位示踪，验证了菌剂在实际水环境中具有较强的适应性，本发明复合微生物菌剂可用于水环境治理，为我国黑臭水体的消除提供了一种可行的方法。

Description

一种用于水环境治理的复合微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及复合微生物菌剂与水环境治理技术领域，具体地说，涉及一种用于水环境治理的复合微生物菌剂及其应用。

背景技术

水体呈黑臭主要是由水体富营养化引起，过多的营养物质有利于微生物迅速繁殖，并消耗水体中的溶解氧和造成厌氧微生物的大量繁殖，从而产生大量异味类(硫化氢、铵等)和还原态(FeS、MnS等) 物质。

目前，水环境治理主要通过截污减排、提高水体净化、清淤、修复等方面，其中生物修复技术，特别是投加微生物菌剂，如利用硝化和反硝化细菌有效去除水体中氮素污染，从而提升水质。因其投资小、效果好、能耗低、不造成二次污染，微生物修复技术已成为我国水环境治理的重要手段之一。

传统生物脱氮中氮素的转化过程包括氨化、硝化和反硝化。其中反硝化过程是将氮素转化为气态氮从水体最终去除的过程。好氧反硝化作用是近年来提出的与传统的缺氧反硝化脱氮相比具有独特优势的生物脱氮技术：一方面，在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；另一方面，硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加剧。因此，好氧反硝化作用越来越受到人们的关注，国内外对于好氧反硝化菌的筛选研究也比较多，但其成果仍旧远远不能满足工业生产的实际需求。通过筛选分离好氧反硝化细菌，并对好氧反硝化菌的各种生长特性和反硝化特性进行深入研究，对养殖废水、生活废水及工业污水的脱氮处理有着重要的理论价值和实际意义。

迄今，针对于水环境治理的微生物菌剂相继涌现，如美国AM公司生产的Clear-Flo系列菌剂，美国的CBS公司和Polybac公司开发的复合菌制剂，美国GES公司生产的LLMO(Liquid live microorganisms) 生物活菌液，日本的有效微生物菌群(Effectivemicroorganism，EM) 等，并取得了一定的治理效果，因此市场上的微生物菌剂主要依靠国外进口。但是，进口菌剂的引入对河道的生态系统存在着不可估量的潜在生态威胁，且外来菌剂对本土环境的适应性也是制约着菌剂发挥效果的关键因素。另外，传统脱氮微生物菌剂因其对好氧-厌氧交替的需求，在流域环境中应用仍难具可行性。

近年来，国内外学者尝试利用异养硝化-好氧反硝化菌株构建完全好氧微生物脱氮体系，国内已相继分离到一些高效功能菌种，包括芽孢杆菌、光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化菌等。无论是在黑臭河道治理，还是在实验室条件下处理人工污水，微生物菌剂的治理效果显著且行之有效。但是，国内微生物脱氮菌剂的研发及应用仍处于不成熟阶段，且水环境治理的成功案例鲜有报道，微生物脱氮菌剂长期存在适应性差、亚硝酸盐和硝酸盐积累、总氮脱除率低等技术难题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有高效、安全性的复合微生物菌剂，改善传统菌剂适应性差、亚硝酸盐和硝酸盐积累、总氮脱除率低等缺陷，为我国水环境治理提供有效解决途径。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)、昆明假单胞菌 (Pseudomonas kunmingensis)、亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)、产碱菌(Alcaligenes sp.)。本发明在进行了大量客观实验的研究基础上，综合利用了耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis) (CGMCC No.1.30234)、昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis) (CGMCC No.1.30235)、亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica) (CGMCC No.1.30236)、产碱菌(Alcaligenes sp.)(CGMCCNo.16044) 的异养硝化和好氧脱氮特性，针对我国城市黑臭水体亚硝酸盐和硝酸盐积累，氮素含量高的问题提供了本发明复合微生物菌剂以更好的进行水体处理，以实现本发明的发明目的。

本发明实施例采用的耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)L23，于2017年4月分离自龙形水系底泥中，分离培养基和培养基均可用LB 培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019 年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为耳炎假单胞菌 Pseudomonas otitidis，保藏号为CGMCCNo.1.30234。

本发明实施例采用的昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis) A11，于2017年6月分离清河水厂活性污泥中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为昆明假单胞菌 Pseudomonas kunmingensis，保藏号为CGMCC No.1.30235。

本发明实施例采用的亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica) DB-2，于2017年4月分离自龙形水系底泥中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Pseudomonas asiatica，保藏号为CGMCC No.1.30236。

本发明实施例采用的产碱菌(Alcaligenes sp.)HO-1，于2016年 10月分离自实验室污水中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为1天，好氧。其已于2018年9月28 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.，保藏号为CGMCC No.16549。

微生物之间存在多种生存的关系，其中就包括不同种属菌株之间复配可能会彼此拮抗，即菌株通过代谢产生某些物质抑制或杀死其它功能菌株而减弱脱氮菌群的脱氮能力，为了确保脱氮菌群能稳定发挥其脱氮功效，所以尽可能避免具有拮抗作用菌株间的配伍。本发明对所有备选菌株进行拮抗测试，剔除拮抗菌株，并通过正交设计优化，最终筛选获得复配效果最好的上述4株菌株用以制备本发明的复合微生物菌剂。

进一步地，本发明所述复合微生物菌剂的总活菌数不低于 1×10⁹cfu/mL。满足该条件的复合微生物菌剂能够更好的降低污染水体中亚硝酸盐和硝酸盐积累，并降低总氮含量。

更进一步，所述复合微生物菌剂中：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/mL，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/mL，亚洲假单胞菌 (Pseudomonas asiatica)的活菌数为2×10⁷-8×10⁸cfu/mL，产碱菌 (Alcaligenes sp.)的活菌数为2×10⁷-1×10¹⁰cfu/mL。

优选地，所述复合微生物菌剂中：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)的活菌数为4×10⁷-6×10⁸cfu/mL，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为4×10⁷-6×10⁸cfu/mL，亚洲假单胞菌 (Pseudomonas asiatica)的活菌数为1×10⁸-6×10⁸cfu/mL，产碱菌 (Alcaligenes sp.)的活菌数为2×10⁸-2×10⁹cfu/mL。

第二方面，本发明提供了前述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)固体斜面培养：将耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)、昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)、亚洲假单胞菌 (Pseudomonas asiatica)、产碱菌(Alcaligenes sp.)分别接种于固体斜面培养基中培养，使菌株充分活化；

2)一级种子培养：将步骤1)中活化的四种菌分别各自接种于无菌液体培养基中，连续振摇培养12-18小时得到一级种子培养菌液；

所述液体培养基的配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉， 1％NaCl，pH7.4；

3)二级种子培养：将所得的一级种子培养菌液以10％体积比的接种量接到发酵罐培养液中，连续振摇培养10-12小时；

所述发酵罐培养液的配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉， 1％NaCl，pH7.4；

4)将步骤3)中获得的四种微生物的二级种子液分别接种于发酵培养基中，进行高密度发酵培养，分别得到菌剂A、B、C、D；

所述菌剂A、B、C、D分别指耳炎假单胞菌、昆明假单胞菌、亚洲假单胞菌、产碱菌的菌剂。

所述发酵培养基的配方为：菌剂A、B、C的发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，玉米浆5g/L，尿素1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，pH7.0，菌剂D发酵培养基配方为：琥珀酸钠20g/L，玉米浆5 g/L，尿素1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，pH7.0；

5)将菌剂A、B、C、D混合，即得复合微生物菌剂。

作为优选，所述菌剂A、B、C、D以(1-10):(1-10):(1-10): (1-50)的体积比混合。所述菌剂A、B、C、D在该体积比例下混合，能够使复合微生物菌剂具有更好的菌种数量组成从而达到最佳的降低水体中总氮量的效果。

进一步地，所述步骤4)的发酵培养条件为：罐压0.02-0.05MPa，温度30-35℃，pH控制在6.5-7.5，搅拌转速150-200rpm，溶氧>20％，初始接种量为10％。

按照上述接种量接种以上种子液进行发酵，能够保证各菌种发酵后的数量。

第三方面，本发明提供了前述复合微生物菌剂在水环境治理中的应用、在降低污染水体中总氮量中的应用、在消除污染水体中亚硝酸盐和硝酸盐积累中的应用。

作为优选，将所述复合微生物菌剂以0.01％-0.1％的比例加入到待处理的污染水体中，于15-35℃，溶解氧为3-7mg/L进行治理，可达到氨氮和总氮同步去除。

本发明提供了一种复合微生物菌剂，将不同功能菌株进行复合，并对其组合进行配伍优化，混合得到的复合菌用于污染水体中总氮量的处理，具有以下优点：

(1)本发明通过在具有脱氮作用的菌株中选择大量菌株进行复配，避免具有拮抗作用菌株间的配伍，确保了脱氮菌群能稳定发挥其脱氮功效；

(2)本发明的复合微生物菌剂在好氧条件下脱除总氮的能力强，能同步去除污染水体中的氨氮和总氮，实验室内对污染水体处理24 小时后氨氮的去除效率接近100％，且消除60％以上总氮，远优异于报道的单菌处理效果。

(3)对于黑臭河道水体的治理效果显著，修复2周后，氨氮去除率接近100％，总氮去除率达65％以上，并且没有亚硝酸与亚硝酸盐的积累，表现出较强的总氮去除能力。

(4)本发明的复合微生物菌剂能够修复黑臭水体污染底泥，可有效的消除底泥黑臭，并加快底泥中重要污染物氨氮的去除，经过10 天处理，底泥中氨氮降低了83％，大大改善了污染水体底泥情况，为水生态恢复奠定基础。

(5)本发明的复合微生物菌剂施用后，对环境无潜在危害，且效果持久，两周后仍旧以一定的丰度存在于水环境中，具有优异的环境适应性和良好的环境友好性。

附图说明

图1为实施例1的产生拮抗作用菌株的效果图。

图2为实施例1中氨氮脱除效果均值主效应图。

图3为实施例1中总氮脱除效果均值主效应图。

图4为实施例4中黑臭坑塘的氨氮去除效果图。

图5为实施例4中黑臭坑塘的总氮去除效果图。

图6为复合微生物菌剂对黑臭底泥的修复效果，从左到右依次为处理前底泥；菌剂处理10天后底泥；修复过程中底泥氨氮含量变化图。

图7为实施例6中修复前后功能菌株特异基因的PCR检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明所用试剂和原料均为市售可得。

本发明实施例所用的耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis) (CGMCCNo.1.30234)、昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis) (CGMCC No.1.30235)、亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica) (CGMCC No.1.30236)、产碱菌(Alcaligenes sp.)(CGMCCNo.16044) 的信息如下：

耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)L23，于2017年4月分离自龙形水系底泥中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，分类命名为耳炎假单胞菌Pseudomonas otitidis，保藏号为 CGMCC No.1.30234。

昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)A11，于2017年6月分离清河水厂活性污泥中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019年5月21 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为昆明假单胞菌Pseudomonas kunmingensis，保藏号为CGMCCNo.1.30235。

亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)DB-2，于2017年4月分离自龙形水系底泥中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为3天，好氧。其已于2019年5月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为Pseudomonas asiatica，保藏号为CGMCC No.1.30236。

产碱菌(Alcaligenes sp.)HO-1，于2016年10月分离自实验室污水中，分离培养基和培养基均可用LB培养基，适宜培养温度为30℃，培养时间为1天，好氧。其已于2018年9月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.，保藏号为CGMCC No.16549。

实施例1复合微生物菌剂中各菌株的筛选

1、避免拮抗作用的菌株间的配伍

微生物之间存在多种生存的关系，其中就包括不同种属菌株之间可能会彼此拮抗，即菌株通过代谢产生某些物质抑制或杀死其它功能菌株而减弱脱氮菌群的脱氮能力，为了确保脱氮菌群能稳定发挥其脱氮功效，所以尽可能避免具有拮抗作用菌株间的配伍。本实施例对所有具有除氮功能的备选菌株进行拮抗测试，剔除拮抗效果特别显著的菌株。再进一步缩小范围，针对表1中的除氮功能较好的菌株进行拮抗测试。

表1功能菌株

拮抗现象检测方法：通过抑菌圈法来考察菌株间的拮抗作用。将 8株除氮效果优良的备选功能菌分别接种至单独的LB液体培养基，培养12h后(160rpm，30℃)，离心培养液收集菌体(5000rpm，10 min)，弃上清，用无菌生理盐水清洗并重悬菌体，取80μL主试菌的菌悬液均匀地涂布在LB固体培养基上。将无菌培养皿的底面积等分，在每个等分格子里放上直径为5mm的无菌滤纸片，用无菌镊子轻轻按压，使无菌滤纸片贴在LB培养基表面上。再分别取10μL其它功能菌株，即被试菌，单独滴加在不同滤纸片上，待滤纸片吸收完全菌液后倒置平皿，30℃条件下培养24h。最后，根据主试菌与被试菌之间是否出现抑菌圈来评估两者之间是否相互拮抗)。依次进行测试，排除与其它菌株存在拮抗现象的菌株。

所选菌株间的拮抗结果如图1，发现广东假单胞菌分别与耳炎假单胞菌、亚洲假单胞菌及产碱菌之间(图1的a-c图)，查氏生丝微菌与菌株亚洲假单胞菌之间均出现了宽度为1mm大小的抑菌圈(图 1的d图)，而其他菌株间未观察到显著抑菌圈。

考虑到本发明采用的耳炎假单胞菌和亚洲假单胞菌均分离于流域水体，在流域水体具备更好的环境适应能力，暂且排除广东假单胞菌和查氏生丝微菌。因此，在制备微生物脱氮菌剂时被排除在外，通过拮抗测试优选，备用功能菌株缩减为耳炎假单胞菌、亚洲假单胞菌、贝克斯芽孢杆菌、昆明假单胞菌、亚硝基还原假单胞菌和产碱菌。

2、正交设计试验

为了更好地发挥微生物菌群优势和保障其功能稳定，在拮抗效应测试结果基础上，本试验先分别对无拮抗现象的功能菌株(6株)进行正交优化配伍，具体如下：

正交试验设计：正交试验设计选择L8(2⁶)，即6因素2水平，正交表格因素水平表见表2。单菌株细菌的菌悬液制备过程同单株细菌脱氮特性实验一致，按所接种菌株的总量为1％接种至100mL C/N比为10:1的液体培养基，培养24h后(160rpm，30℃)取样本进行水质分析，重复2次正交试验，主要检测细胞生长量、总氮和氨氮。利用Minitab软件对水质分析数据结果进行分析，获得功能菌株的最佳配方，并对重复正交试验进行方差分析和显著性检验。

表2正交试验因素与水平

注：1代表不加该菌株，2代表加该菌株。

表3正交试验各处理组24h水质分析结果。

注：1代表不加该菌株，2代表加该菌株。

氨氮去除效果：通过Minitab软件分析重复正交试验水质分析的氨氮去除情况可知，组合菌剂中6株菌种均有利于NH₄ ⁺-N去除，且当所有菌株全部存在时，菌剂对氨氮的去除最高效。氨氮脱除效果均值主效应图见图2，结果表明，本试验通过菌株配伍有效地增强了氨氮的去除，因此，就氨氮去除而言，最优组合为耳炎假单胞菌、亚洲假单胞菌、贝莱斯芽孢杆菌、昆明假单胞菌、亚硝基还原假单胞菌和产碱菌。

总氮去除效果：通过Minitab软件分析重复正交试验水质分析的总氮去除情况可知，组合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌和亚硝基还原假单胞菌不利于总氮去除或对总氮去除无显著贡献，最优组合为耳炎假单胞菌、亚洲假单胞菌、昆明假单胞菌和产碱菌。总氮脱除效果均值主效应图见图3。

本实施例针对污染水环境高氨氮的实际情况构建好氧脱氮菌群，从氨氮和总氮同步消除的角度出发，耳炎假单胞菌、亚洲假单胞菌、昆明假单胞菌和产碱菌成为构建好氧脱氮微生物菌群的最佳配伍方式。

实施例2复合微生物菌剂的制备

5)将菌剂A、B、C、D混合，即得液体复合微生物菌剂。

6)所述复合微生物菌剂为固体菌剂形式，将菌剂按照一定比例混合获得液体细菌，同时也可将其吸附在硅藻土上，进行造粒烘干，制备颗粒微生物菌剂。菌剂中耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis) 的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/g，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为1×10⁷-5×10⁸cfu/g，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/g，产碱菌 (Alcaligenes sp.)的活菌数为1×10⁷-1×10⁹cfu/g。

实施例3本发明的复合微生物液体菌剂

所述复合微生物菌剂为菌液形式，包括

耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)的活菌数为4×10⁷-6×10⁸ cfu/mL，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为 4×10⁷-6×10⁸cfu/mL，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)的活菌数为1×10⁸-6×10⁸cfu/mL，产碱菌(Alcaligenes sp.)的活菌数为 2×10⁸-2×10⁹cfu/mL。

复合微生物液体菌剂1：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)，亚洲假单胞菌 (Pseudomonas asiatica)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，菌剂1中前述4种微生物的有效活菌数分别为：4×10⁸cfu/mL、4×10⁸cfu/mL、 4×10⁸cfu/mL、4×10⁸cfu/mL。

菌剂2：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌 (Pseudomonaskunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，菌剂2中前述4种微生物的有效活菌数分别为：2×10⁸cfu/mL、2×10⁸cfu/mL、2×10⁸cfu/mL、 1×10⁹cfu/mL。

菌剂3：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌 (Pseudomonaskunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，菌剂3中前述4种微生物的有效活菌数分别为：1×10⁸cfu/mL、2.5×10⁸cfu/mL、2.5×10⁸cfu/mL、 1×10⁹cfu/mL。

菌剂4：由昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，菌剂4中不含耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，菌剂4中3种微生物的有效活菌数分别为：5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL。

菌剂5：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，亚洲假单胞菌 (Pseudomonasasiatica)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，不含昆明假单胞菌(Pseudomonaskunmingensis)。菌剂5中3种微生物的有效活菌数分别为：5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL。

菌剂6：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌 (Pseudomonaskunmingensis)，产碱菌(Alcaligenes sp.)组成，不含亚洲假单胞菌(Pseudomonasasiatica)。菌剂6中3种微生物的有效活菌数分别为：5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL。

菌剂7：由耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌 (Pseudomonaskunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica) 组成，不含产碱菌(Alcaligenessp.)。菌剂7中3种微生物的有效活菌数分别为：5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL。

实施例4实验室内复合微生物菌剂对氨氮和总氮的同步去除实验

采用实施例2制得的7组不同配比的复合微生物菌剂，按1‰的接种量将复合微生物菌剂的菌悬液接种于100mL异养硝化培养基中，于 30℃、160rpm条件下摇床培养，在培养24h后检测氨氮和总氮(包括细胞氮)含量变化(每组3个重复)。

在实验室条件下，不同复合菌剂组合氨氮和总氮的去除结果如表 1，前3种组配的复合菌剂均可迅速去除体系内氨氮，24h后氨氮去除效率达到100％，且总氮在一定程度上也得到降低。虽然组合4-7表现出氨氮和总氮的同步去除能力，但是去除效率略低于组合1-3，且组合4、5、7均产生少量亚硝酸盐积累，表明该类组合反硝化效率较低。整体而言，本发明实施例2提供的复合菌剂1-3为最优组合。

表4不同复合菌剂的处理效果

实施例5复合微生物菌剂对黑臭纳污坑塘的治理

河北省保定市一纳污坑塘，平均水深为3m深，水域面积4000平方米，总水量约1.2万立方米，起初氨氮为2.35mg/L、硝氮为0.9mg/L，总氮为5.05mg/L。菌剂投加前，已经曝气一周(间断曝气，溶解氧保持在3mg/L以上)，但是氨氮未下降。随后采用本发明实施例2制得的复合微生物菌剂1(液体形式)，投撒1.2t至坑塘里(投加体积比为 0.01％)，修复过程中白天水温在13-18℃。监测修复过程中氨氮和总氮指标变化(每次取3个点样)。

投撒菌剂1，氨氮从2.35mg/L迅速降至1.5mg/L(图4)，虽然坑塘一直处于纳污状态，但是氨氮指标一直维持在2mg/L以内，达到地表V类水质要求。

随着处理时间的增加，11天后氨氮最终降至0.88mg/L，达到地表 III类水氨氮指标，完成预期目标。这表明复合微生物菌剂具备高效的氨氮脱除能力。与此同时，修复过程中水体总氮浓度也出现下降，从 5.04mg/L降至3.10mg/L(图5)，这表明本发明提供的复合微生物菌剂具备在好氧条件下脱除总氮的能力，突显出好氧脱氮菌株的重要功能，同时体现了硝化与反硝化作用是本复合型菌剂脱除氨氮的重要途径之一。

实施例6复合微生物菌剂对黑臭水体污染底泥的修复

底泥采自某水产养殖区，呈完全黑臭，属于重度污染底泥，处理前底泥中氨氮约为600mg/L，底泥处于完全厌氧状态。投加本发明的复合型微生物菌剂2，投加量为0.15kg/m²，曝气保持溶氧在5mg/L以上，温度维持在25℃左右。修复10天后，采底泥，对处理前后底泥中氨氮含量进行测定。

如图6所示，本发明提供的复合微生物菌剂可有效的消除底泥黑臭，并加快底泥中重要污染物氨氮的去除，经过10天微生物处理，底泥中氨氮降至100mg/kg以内，氨氮去除率达83.3％，大大改善了污染底泥情况，为沉水植物构建提供有利生存条件。

实施例7复合微生物菌剂对黑臭水体的实地修复

试验区为典型的黑臭河道，起初水质为COD为30mg/L、氨氮为 13.9mg/L水体透明度低，河道周边明显散发着异味气体。从主河道引入周边坑塘约200m³水，随后均匀投撒复合型微生物菌剂2，并及时投加碳源和曝气，运行期间采用间断曝气，溶氧维持在3mg/L以上，并根据水体COD结果间断补给碳源，当地气温为25℃。运行两周，检测处理前后水质变化，包括氨氮、总氮、硝酸盐及亚硝酸盐，每组3个重复，并通过PCR技术检测功能菌株之一产碱菌(Alcaligenes sp.)是否存在。

PCR检测如下：采用产碱菌(Alcaligenes sp.)特异性引物对水样细菌DNA进行PCR扩增，反应体系(50μL)：25μL 2xTaqMix、1μL模板、上下游特异性引物(10μM)各2μL，ddH₂O补足50μL。PCR反应进程：95℃预变性2min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，循环数为30个，之后72℃延伸5min，4℃保温。

经过两周本发明复合微生物菌剂的修复，处理后的水体中氨氮降至0.2mg/L，达到地表II类水对氨氮指标的要求，氨氮去除率接近 100％，同时总氮去除率也高达65％，未检测到硝酸盐与亚硝酸盐积累 (表5)。结果再次表明，本发明提供的复合微生物菌剂具备硝化与反硝化同步进行的能力，在生物脱氮应用方面发挥出氨氮和总氮同步去除的优势，对黑臭水体的现场修复达到预期效果，表明本发明的复合微生物菌剂对我国黑臭水体修复具有很大的应用价值。

表5黑臭水体修复前后氨氮和总氮含量变化

利用产碱菌(Alcaligenes sp.)特异引物对处理前后水样细菌DNA 进行扩增实验，特异序列长度为163bp，实验结果见图7，其中修复前为投菌剂之前的样本总DNA扩增结果，修复后指修复两周后样本总DNA扩增结果，每组做3个重复。修复前的3个生物学样本均没有条带，而修复后的3个生物学样本均扩增出比Marker更亮的条带，说明修复后功能菌株之一的产碱菌(Alcaligenes sp.)仍然高丰度的存在于水体中。

参考上述方法对处理前后水样中本发明菌剂中的耳炎假单胞菌 (Pseudomonasotitidis)，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonasasiatica)进行检测，结果显示采用本发明的菌剂进行污水处理后，耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)与产碱菌(Alcaligenes sp.)类似，存在于水体中，保持高丰度。

这直接证明了在修复的过程中，本发明研发的复合脱氮菌剂始终能以一定的丰度存在于水环境中，具有优异的环境适应性。

通过修复过程中关键脱氮菌株的示踪，提供了水体的改善与菌剂的投加相关性的直接证据，同时也对本发明复合微生物菌剂在适应环境方面做出了重要的验证，为以后的广泛应用奠定了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂包括：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)、昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)、亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)、产碱菌(Alcaligenes sp.)。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的总活菌数不低于1×10⁹cfu/mL。

3.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/mL，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为1×10⁷-8×10⁸cfu/mL，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)的活菌数为2×10⁷-8×10⁸cfu/mL，产碱菌(Alcaligenes sp.)的活菌数为2×10⁷-1×10¹⁰cfu/mL。

4.权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中：耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)的活菌数为4×10⁷-6×10⁸cfu/mL，昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)的活菌数为4×10⁷-6×10⁸cfu/mL，亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)的活菌数为1×10⁸-6×10⁸cfu/mL，产碱菌(Alcaligenes sp.)的活菌数为2×10⁸-2×10⁹cfu/mL。

5.权利要求1-4任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)固体斜面培养：将耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)、昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)、亚洲假单胞菌(Pseudomonas asiatica)、产碱菌(Alcaligenes sp.)分别接种于固体斜面培养基培养，使菌株充分活化；

5)将菌剂A、B、C、D混合，即得复合微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述菌剂A、B、C、D以(1-10):(1-10):(1-10):(1-50)的体积比混合。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述固体斜面培养基为1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉，1％NaCl，pH7.4；所述液体培养基的配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取粉，1％NaCl，pH7.4；所述菌剂A、B、C的发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，玉米浆5g/L，尿素1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，pH7.0，菌剂D发酵培养基配方为：琥珀酸钠20g/L，玉米浆5g/L，尿素1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，pH7.0。

8.根据权利要求5-7任一所述的制备方法，其特征在于，步骤4)的发酵培养条件为：罐压0.02-0.05MPa，温度30-35℃，pH控制在6.5-7.5，搅拌转速150-200rpm，溶氧>20％。

9.权利要求1-4任一项所述的复合微生物菌剂在水环境治理中、或在降低污染水体中总氮量、或在消除污染水体中亚硝酸盐和硝酸盐积累中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述复合微生物液体菌剂以0.01-0.1％v/v的比例或固体菌剂以0.01-0.1％wt/v的比例加入到污染水体中，于15-35℃，溶解氧为3-7mg/L进行治理，修复1-2周。