CN114381402B - 一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用 - Google Patents

一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物脱氮技术领域，公开了一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用，所述好氧反硝化细菌为假单胞菌属变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY‑3，于2022年1月4日保藏在广东省微生物菌株保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62181；该菌株及菌剂同时具有异养硝化和好氧反硝化能力，生长速度快、降氮速率高，可分别利用
Figure DDA0003479440800000011
和
Figure DDA0003479440800000012
作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮。该菌株及菌剂能够在pH值5.5‑10.5的水体环境中发挥硝化‑反硝化作用，同时具有良好的生物安全性。

Description

一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物脱氮技术领域，具体涉及一种好氧反硝化细菌，尤其涉及一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其在生物脱氮处理中的应用。
背景技术
中国是水产养殖业大国，当前，我国的水产养殖模式为高密度、集约化，此模式操作方便、产量高、效益好，但易造成养殖水体中氨氮、亚硝酸盐等有害物质积累，对环境、人类及养殖动物均有一定的危害，不利于长远的发展。目前，治理含氮养殖尾水的有效脱氮方法主要包括物理处理法、化学处理法、生物处理法和循环水养殖技术等，其中，生物处理法中的好氧反硝化细菌制剂作为一种新型水体降氮方法，具有安全性高、效果好、成本低的优点，已成为目前国内外的研究热点。
好氧反硝化细菌(Aerobic denitrifyingbacteria)是一类能够利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化细菌。传统理论认为，反硝化是一个严格的厌氧过程，在反硝化进程中，氧气被认为是可抑制反硝化还原酶，另外，在有机物质氧化的过程中，O2被普遍认为是首选的电子受体，在有氧条件下反硝化菌会优先使用溶解氧呼吸，这样就阻止了使用NO3 -和NO2 -作为最终电子受体。
Figure BDA0003479440780000011
以及
Figure BDA0003479440780000012
是评价养殖水体很重要的指标，它们的毒性可以直接影响水产养殖对象的生存和水产品质量。生物脱氮是生物滤池设施中的关键生化过程。异养硝化-好氧反硝化(HN-AD)作为一种新型的生物脱氮技术，不但能够成功克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，与自养生物相比，异养生物还拥有对有机底物更好的利用、更高的耐氧性和脱氮率等优势，近年来受到广泛关注。
目前国内外研究的好氧反硝化细菌，普遍具有强大的降氮性能，且存在菌株同时具备消除氨氮、硝态氮与亚硝态氮的能力。但值得注意的是，同时具备消除氨氮、硝态氮与亚硝态氮能力的菌株仍占少数，且一般都需要经过较长时间的耗氧培养才能显示出较强的脱氮能力。其中最短培养时间为24h，但其实验中所使用的模拟废水氮的初始浓度并不高，可知高浓度氮对好氧反硝化菌株的脱氮具有抑制作用，细菌难以适应和处理高浓度含氮废水。其次，目前国内外研究的好氧反硝化细菌对pH条件十分敏感，一般都需要在中性条件或偏碱性下才能生长并发挥降氮作用。对于具有高酸碱度的工业废水和养殖尾水，大多数反硝化细菌无法正常进行生长增殖，发挥降氮作用。因此，进一步地研究和筛选具有高效降高浓度氮能力与具有广泛pH适应范围的好氧反硝化菌株，对于进行不同的污水处理有显著帮助，并且有利于改善脱氮工艺，开发微生物降氮制剂产品。
在耐酸耐碱方面，Maoxia Chen等人在2014年5月4日报道了一株于CASS反应器活性淤泥中分离得到的气单胞菌属细菌(Aeromonas sp.)HN-02(Maoxia Chen等，Bioresource Technology.167:456-461(2014))，该菌株可在pH＝2.3～10发挥降氮作用，在pH＝2.3，氨氮浓度为200mg/L时48h仍具有39.0％的氨氮去除率，具有较强的耐强酸、耐弱碱能力，其于高碱条件下(pH>11)氨氮去除能力受到抑制，不足30％；中国专利CN106754534A公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，该菌株在pH＝4.5的条件下仍具有反硝化能力，72h内硝酸盐去除率达到90％(初始浓度160mg/L)；在pH5.77～7.71情况下，32h可以将初始浓度为150mg/L的硝酸盐氮完全脱除，但该菌株对硝态氮的去除速度较慢，在最佳条件下培养，其在0～24h为迟缓期，24h后才进入对数生长期。
我国于2008年发布的《环保用微生物菌剂环境安全评价导则》中提到，为促进微生物菌剂在生态环境中的安全应用，应把以下四个方面作为安全评价的重点：(1)菌株的致病性；(2)菌株的耐药性；(3)菌株代谢产物的潜在危害；(4)菌株使用环节中的防范和应急措施。从应用方向的角度来说，应用在水产养殖业中微生物菌株对养殖对象不能有致病性，应用前必须通过生物安全性评估。然而人们对好氧反硝化细菌在水生系统中的有益作用机制研究甚少，目前在对菌株的研究和向实际应用过渡的过程中，常常缺少对微生物菌株的生物安全性试验与耐药性试验，这可能忽视了某些微生物菌剂的潜在有害作用，因此人们仍需要分离纯化得到更多高效、稳定、安全的好氧反硝化菌株进行进一步的生物安全性与生态风险评估。
综上所述，现有技术目前还缺乏具备高效降氮能力、具有较高生物安全性、能同时处理高酸高碱含氮污水的好氧反硝化菌株，难以使用生物方法处理高酸碱性的工业、养殖废水。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌、菌剂及其应用。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌，为假单胞菌属变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3，于2022年1月4日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：62181。
本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3是通过富集、梯度稀释、选择性培养基培养并通过脱氮能力定性筛选等方法筛选得到。
所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3的生物学特征为：革兰氏阴性，在营养琼脂培养基上28℃培养18小时后，形成表面光滑湿润有闪光、不透明、边缘完整隆起呈现圆形的浅黄色菌落。在100倍油镜下，菌体呈现长杆状，两端圆滑；其接触酶、氧化酶、硝酸盐还原反应呈阳性；吲哚反应、明胶液化、淀粉水解、甲基红试验、V-P试验、酯酶(Tween 80)、反硝化试验呈阴性；所述菌株能利用D-(+)-葡萄糖、肌酸、甘油、甘氨酸、D-果糖、柠檬酸盐作为碳源，不能利用酒石酸钠、D-(+)-麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、甘露醇、L-精氨酸、L-(+)-阿拉伯糖作为碳源。
一种包括有所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)ZY-3的生物脱氮菌剂，其为包含该ZY-3菌株的菌液。
将所述好氧反硝化细菌菌株ZY-3及菌剂，应用于含氮污水的生物脱氮处理，分别利用
Figure BDA0003479440780000031
和
Figure BDA0003479440780000032
作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮。
本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3及其菌剂，同时具有异养硝化和好氧反硝化功能；在完全好氧的条件下，该菌株能够利用
Figure BDA0003479440780000033
和NO- 2-N作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮，且去除速率快，能够在pH＝5.5～10.5的水体中生长并发挥异养硝化-好氧反硝化作用，对pH的适应范围广。
在一些优选的所述方式中，所述含氮污水为养殖尾水。
本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性，并且对多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高。因此适宜在大多数的养殖水体中应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3及其菌剂，同时具有异养硝化和好氧反硝化能力，可以利用多种有机碳源，并具有较好的水体有机碳去除能力；能够克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行，在完全好氧的条件下，该菌株及菌剂可分别利用
Figure BDA0003479440780000034
和NO- 2-N作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；其去除效率最高分别可达93.56％、100％和92.22％。
(2)本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3及其菌剂，能够适应酸性(pH≥5.5)和碱性(pH≤10.5)水体环境，发挥硝化-反硝化作用，实现酸、碱水体的微生物脱氮；将该菌株应用于盐碱地、含氮工业废水的处理，有利于简化废水处理工艺，提高处理效率，符合环境友好要求，具有良好的经济及环保效益。
(3)本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3及其菌剂，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并对硫酸庆大霉素、盐酸四环素、头孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、妥布霉素等多种临床常用抗生素表现为敏感，具有较高的生态安全性，因此可应用于大多数的含氮水产养殖水体处理领域，有利于减少设备占地面积和建设成本，提高处理效率，还能大幅减少水产养殖过程中的周期性换水，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例中所述菌株ZY-3的菌落形态图；
图2是本发明实施例中所述菌株ZY-3的扫描电镜图；
图3是本发明实施例中所述菌株ZY-3的草酸铵结晶紫(A)、革兰氏染色图(B)；
图4是本发明实施例中斑马鱼在所述ZY-3菌液中的时间-存活率结果图；
图5是本发明实施例中临床常用抗生素对所述菌株ZY-3的抑菌作用图；
图6是本发明实施例中所述菌株ZY-3以氨氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图；
图7是本发明实施例中所述菌株ZY-3以硝态氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图；
图8是本发明实施例中所述菌株ZY-3以亚硝态氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图；
图9是本发明实施例中所述菌株ZY-3以在不同pH下以氨氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图；
图10是本发明实施例中所述菌株ZY-3以在不同pH下以硝态氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图；
图11是本发明实施例中所述菌株ZY-3以在不同pH下以亚硝态氮为单一无机氮源的生长情况和脱氮效果对比图。
具体实施方式
下面结合附图1-11及实施例，对本发明作进一步详细描述。
各实施例中
Figure BDA0003479440780000051
三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中：
Figure BDA0003479440780000052
的测定与分析根据《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》(GB HJ535-2009)；
Figure BDA0003479440780000053
的测定与分析根据《水质-硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》(GB HJ/T346-2007)；
Figure BDA0003479440780000054
的测定与分析根据《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》(GB 7493-87)。
本发明提供的一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌，为假单胞菌属变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)ZY-3，于2022年1月4日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，保藏编号为GDMCC No：62181。
所述好氧反硝化细菌菌株ZY-3为革兰氏染色阴性、能在NH4Cl、NaNO3、NaNO2为唯一氮源的液体培养基上生长；且在营养琼脂平板上培养时，其菌落呈现淡黄色、半透明，边缘完整隆起呈现圆形，菌落表面湿润光滑，菌体呈长杆状，两端圆滑，分散排列。
本发明所述变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌株ZY-3是通过富集、梯度稀释、选择性培养基培养并通过脱氮能力定性筛选等方法筛选得到。
一种生物脱氮菌剂，其包括所述的好氧反硝化细菌菌株ZY-3，其具体为对ZY-3菌株经过扩繁后获得的、包含大量该ZY-3菌株的菌液，菌株的含量可以根据需要选择。
本发明将所述的耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌ZY-3菌株，及其制备的生物脱氮菌剂(菌液)，应用于在含氮污水的脱氮处理，其分别利用
Figure BDA0003479440780000056
和
Figure BDA0003479440780000055
作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；所述含氮污水包括养殖尾水和/或含氮工业废水；所述含氮污水的pH值为5.5-10.5；所述好氧反硝化细菌菌株ZY-3的培养温度为30℃。
实施例1
本发明所述ZY-3菌株的分离鉴定
1、样品采集
本发明的变形假单胞菌ZY-3于广东省佛山市南海区南海通威水产科技有限公司(北纬N:22°50′34″、东经E:113°57′25″)罗非鱼养殖池塘的水样以及泥样筛选分离得到；样品采集根据《土壤环境监测技术规范》(HJ/T 166-2004)中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用；
2、培养基及溶液的配制
(1)微量元素溶液(g/L)：EDTA50g，ZnSO4·7H2O 5.02g，CuSO4·5H2O 1.57g，FeSO4·7H2O 5.0g，CoCl2·6H2O 1.61g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1g，CaCl2·2H2O 5.5g，MnCl2·4H2O 5.06g，pH＝6.0；
(2)富集培养基(g/L)：KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO47.9g，二水柠檬酸钠6.45g，NaNO30.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO20.362g，微量元素溶液2mL，pH＝7.2；
(3)BTB培养基(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，1％BTB乙醇溶液1mL，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO47.9g，NaNO30.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO20.362g，微量元素溶液2mL，琼脂20g，pH＝7.0～7.5；
(4)高浓度单一氮源培养基(DM)(g/L)：KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaHPO47.9g、无水柠檬酸钠5.66g、微量元素溶液2mL；分别加入三种单一氮源：NH4Cl0.6036g(DMⅠ)、NaNO30.9590g(DMⅡ)、NaNO20.7790g(DMⅢ)，pH＝7.2；
(5)低浓度单一氮源培养基(g/L)：KH2PO40.1130g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaHPO40.592g、无水柠檬酸钠1.608g、微量元素2mL；分别加入三种单一氮源：NH4Cl 0.1000g(DMⅠ)、NaNO30.1590g(DMⅡ)、NaNO20.1290g(DMⅢ)，pH＝7.2；
所述培养基使用121℃，20min高压蒸汽灭菌后使用；
3、菌株的富集、分离与筛选
(1)样品预处理：取池塘底泥10g，于超净工作台中接入装有90mL，0.9％无菌生理盐水以及少许经121℃高压蒸汽灭菌20min的无菌玻璃珠的500mL三角烧瓶中，180r/min震荡1h以打散底泥样品，使底泥中含有的微生物充分悬浮于生理盐水中，以便下一步进行目标菌株的筛选与分离；水样样品处理方法同污泥；
(2)富集培养：取22.2mL上述混合液体(10-1底泥)加入到装有200mL富集培养基的500mL锥形瓶中，摇床内30℃，180r/min培养2～3天，每天向富集培养基中加入1mL 5％(质量分数)的灭菌NH4Cl溶液以保持培养基内
Figure BDA0003479440780000061
离子浓度；水样则取10mL接种于含90mL富集培养基的300mL大口三角烧瓶中，摇床内30℃，180r/min振荡培养2～3天，NH4Cl的添加同污泥；
(3)样品平板涂布：分别取(1)中经过预处理的水样和泥样原液1mL，于超净工作台内接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，移液枪轻轻吹打或震荡混匀，取出1mL液体接入到新的装有9mL无菌生理盐水的试管中，重复该操作，依次把10-1底泥和水样原液梯度稀释为10-2～10-4浓度；分别取10-1～10-4浓度梯度的底泥和水样浓度的原液100μL～200μL，直接涂布于BTB平板培养基中，每个梯度设置3个平行组，1个空白对照组，在恒温生化培养箱中30℃倒置培养2～3天；
(4)样品富集液平板涂布：将(2)中的富集培养后的菌悬液梯度稀释，过程如下：从(2)中的锥形瓶中取1mL菌悬液接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，充分混匀，即稀释浓度为10-1，再从此试管中吸取1mL液体接入到新的装有9mL无菌生理盐水的试管中混匀，重复此步骤，依次稀释达到10-2～10-8浓度梯度，然后从每个浓度梯度的混合液中各取100μL～200μL，分别涂布于提前制作好的BTB固体平板培养基上，标明稀释梯度与日期，在生化培养箱中30℃倒置培养2～3天；
(5)分离纯化：使用接种环挑取上述BTB平板上不同形态的菌落，采用平板划线分离法于BTB固体平板培养基上划线进行分离纯化，划线后将平板倒置于恒温生化培养箱内30℃培养2～3天；重复此步骤，挑取单菌落反复划线纯化3～4次；最后一次划线后，观察平板上的菌落形态，选取菌落形态单一、无明显杂菌落的平板(如图1所示)，挑取单菌落进行结晶紫单染色镜检(如图3A所示)，使用100倍油镜进行镜检验纯；
(6)点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养2～3天，根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，接种于斜面30℃恒温培养2～3天后试管置于4℃保藏；通常蓝色晕圈越大，菌株的反硝化能力越强；
(7)硝化与反硝化性能复筛：用接种环取上述得到的菌株1环活化斜面接种于营养肉汤中，摇床30℃，180r/min培养24h，测定其OD600，再以1％的接种量分别接种至以NH4Cl、NaNO3以及NaNO2作为唯一无机氮源的高浓度的DMⅠ、DMⅡ以及DMⅢ发酵培养基中，30℃，180r/min震荡培养，0h、24h、48h取培养液测其OD600；5000r/min，5min低速离心后取上清液，分别测定
Figure BDA0003479440780000071
三种氮元素含量；
4、菌株鉴定
(1)形态学鉴定：参见附图1，所述菌株ZY-3在营养琼脂培养基上培养24h后菌落呈现淡黄色、半透明，边缘完整隆起呈现圆形，菌落表面湿润光滑，100倍油镜下菌体呈长杆状，两端圆滑，分散排列；革兰氏染色为阴性(如图3B所示)，菌体呈现长杆状；参见附图2，在扫描电镜下，菌体呈现直杆状，菌体两端圆滑，呈现分散排布(图2A)；菌体体长(L)为1.44±2.78μm，菌体体宽为0.50±0.02μm，无鞭毛结构(图2B、图2C和图2D)。
(2)分子生物学鉴定：采用Takara Lysis Buffer for Microorganism to DirectPCR裂解酶进行菌株ZY-3的基因组DNA提取；以此为模板采用通用引物(27F-1492R)扩增其16S rDNA，引物序列如下：上游引物(27F)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物(1492R)：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，通用引物由上海生物工程有限公司合成；PCR反应体系(25μL)：2×UniqueTM Taq Master Mix(With Dye)12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL；PCR程序如下：①94℃，5min；②94℃预变性，30s；③55℃退火，30s；④72℃延伸1.5min；⑤72℃，10min；②～④循环30次；1％琼脂糖凝胶电泳分析结果；PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成；通过Blast在线比对分析，菌株ZY-3与变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的典型菌株103162T的16S rDNA基因序列相似度最高，其相似性为99.01％；
(3)菌株生理生化鉴定：根据《Bergey's Manual of Systematic BacteriologySecond Edition》以及《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株ZY-3的生理生化鉴定；生理生化结果见表1；
表1：P.plecoglossicida ZY-3与P.plecoglossicida DC16、典型菌株Pseudomonas plecoglossicida NBRC 103162T的特征区别表
Figure BDA0003479440780000081
注：“+”为阳性；“-”为阴性；“/”为暂无数据。
经过上述筛选步骤后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株ZY-3；综合其16s rDNA、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株ZY-3为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。
实施例2
ZY-3菌株及菌剂的具体应用及环境安全性评价
(1)鱼类毒性试验：选取体长在3±1cm范围内，健康的斑马鱼(Danio rerio)，于持续曝气的大水体中暂养30天，期间正常喂食与定期换水；状态稳定后随机分配到15L玻璃缸中，设置加入ZY-3菌株的菌剂(菌液)的实验组(P.plecoglossicida ZY-3)和加入等体积无菌水的对照组(CRT)，每个实验组30条斑马鱼，每组设置3个重复；取过夜培养的菌液，4000r/min，5min离心后弃上清，用无菌PBS缓冲液重悬，重复1～2次后用灭菌水悬浮，根据测定的标准曲线得到OD600与菌浓度之间的关系，调节实验水体菌浓度约1×106CFU/mL，空白对照组则加入等量的灭菌水；实验期间，实验对象正常喂养且每三天对实验水体进行完全更换，换水后重复上述方法分别加入菌液和灭菌水，记录下每个组斑马鱼存活率，实验持续14d；
参见附图4，在正常条件下养殖14天，对照组斑马鱼存活率为97.78±3.85％，实验组水体中试验菌浓度为106CFU/mL，高于常见病原菌的致病剂量(104CFU/mL)；实验组斑马鱼存活率为100％，与对照组无显著差异(p>0.05)；初步判断变形假单胞菌菌株ZY-3具有较高的水生生物安全性。
(2)常用抗生素耐药性实验：抗生素耐药性实验(抗生素纸片药敏试验)实验方法步骤和评判标准根据《M100抗微生物药敏感性试验执行标准(第三十版)》和《M02-A10抗菌药物敏感试验纸片法执行标准(Vol.32No.1)》；具体步骤如下：
a)配置MHA(广东环凯生物科技有限公司)平板，矫正pH＝7.2～7.4；
b)使用无菌空白药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)制作对应药物含量的纸片；
c)取菌株接种于营养肉汤培养基中，30℃，180r/min培养至对数期，实验前稀释到指定浓度；
d)使用一次性灭菌棉签蘸取稀释后的菌液，在离心管壁挤干水分后在MHA平板上均匀涂布，室温干燥5min；
e)使用无菌镊子将含有抗生素的纸片贴于MHA平板中央，每个实验设置2个平行重复组，另设置3个含有无菌水的纸片贴于MHA平板中央作为空白对照(CRT)；
f)15min内倒置平板，于30℃恒温培养18h；
g)使用IP54金属壳数显游标卡尺(永康市晶思达贸易有限公司)测量抑菌圈直径；
观察抑菌圈大小，参见附图5(A-K分别为CRT、阿莫西林、氯霉素、红霉素、氨苄青霉素、盐酸四环素、头孢哌酮、庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦)，结果发现菌株对多种抗生素如盐酸四环素和庆大霉素呈敏感，结果如表2所示，ZY-3对于多种抗生素呈敏感，这为日后的实际应用时养殖池溏中抗生素的投放提供了参考，为菌株的杀灭提供了防治手段，提高了菌株的生物安全性。
表2抗生素耐药性试验结果
序号 抗生素种类 抑菌环大小(mm) 敏感种类
A (无CRT) 0 /
B 阿莫西林 0 R
C 氯霉素 7.31±0.52 R
D 红霉素 0 R
E 氨苄青霉素 0 R
F 盐酸四环素 23.10±0.10 S
G 头孢哌酮 18.33±2.15 I
H 硫酸庆大霉素 23.30±0.26 S
I 妥布霉素 22.50±0.82 S
J 头孢他啶 23.12±0.71 S
K 哌拉西林-他唑巴坦 27.00±2.34 S
实施例3
菌株ZY-3及菌剂在各种高浓度单一氮源下的生长情况与应用于脱氮的性能测试
以高浓度单一氮源培养基(DM)为基础培养基，分别添加单一无机氮源NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)进行变形假单胞菌ZY-3在高浓度氮源下的降氮能力测试，每升培养基加入量分别为0.6036g、0.9590g、0.7790g，培养条件为28℃、180r/min、pH＝7.0；取ZY-3菌株接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养24h至对数期，再以1％接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、4h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，4000r/min，5min低速离心后取上清分别测定
Figure BDA0003479440780000102
三种氮元素含量；实验设置3个重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。
参见附图6-8，在利用不同单一氮源时，菌株均经历4h迟缓期后进入对数期，生物量OD600在12h达到最大值，同时各种氮的去除率都达到了80％以上；
Figure BDA0003479440780000101
的去除率最高可分别达到93.56％、82.13％、100％；表明该菌株在进行降氮作用时生长速度快、降氮速率高，无明显氮积累现象，具有很好的生产应用潜力。
实施例4
菌株ZY-3及菌剂在不同pH条件下的生长情况及应用于脱氮的性能测试
以低浓度单一氮源培养基为基础培养基，分别添加单一无机氮源NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)进行变形假单胞菌ZY-3在不同pH条件下的降氮能力测试，每升培养基加入量分别为0.1000g、0.1590g、0.1290g；使用浓度为1mol/L的HCL与NaOH调节培养基pH，设置pH梯度为5、5.5、6、7、8、9、10、10.5、11，培养条件为28℃、180r/min；取ZY-3菌株接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养24h至对数期，再以1％接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、48h取培养液测定其OD600，4000r/min，5min低速离心后取上清分别测定
Figure BDA0003479440780000111
三种氮元素含量；实验设置3个重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水；分析在各pH条件下对ZY-3生长情况以及好氧反硝化作用的影响，得出菌株ZY-3的pH耐受范围；
参见附图9-11，此菌株在酸性条件下(pH＝5.5)与碱性条件下(pH＝10.5)，都可以分别利用
Figure BDA0003479440780000112
和
Figure BDA0003479440780000113
作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮，且各种氮的去除率都达到了80％以上；在pH＝5.5～10.5区间，各种氮的去除率未有明显波动，生物量整体随着pH的增大呈现下降趋势。
综合上述实施例及附图可知，本发明所述变形假单胞菌ZY-3对水产养殖对象无不良影响，对水生生物具有较高的生物安全性；并且对多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高，因此适宜在大多数的含氮水产养殖水体应用；该菌株同时具有异养硝化和好氧反硝化功能，其在完全好氧的条件下，能够利用
Figure BDA0003479440780000115
和
Figure BDA0003479440780000114
作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮，且去除速率快，在处理12h后3种无机氮源的去除率均达到了80％以上，无明显氮积累现象；该菌能够在pH＝5.5～10.5的水体中生长，发挥异养硝化-好氧反硝化作用，对于pH的适应范围广，该菌株能适用于多种环境，包括工业酸性、碱性含氮废水的处理，具有广阔的应用范围，具有良好的经济以及环保效益，应用前景广阔。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌，其特征在于，所述好氧反硝化细菌菌株为假单胞菌属变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）ZY-3，于2022年1月4日保藏在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，保藏编号为GDMCC No：62181。
2.一种生物脱氮菌剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的好氧反硝化细菌菌株ZY-3。
3.根据权利要求1所述的一株耐酸耐碱快速脱氮的好氧反硝化细菌或权利要求2所述的生物脱氮菌剂在含氮污水脱氮处理中的应用，分别利用NH4 + -N、NO3 - -N和NO2 - -N作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氮污水包括养殖尾水和/或含氮工业废水。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氮污水的pH值为5.5-10.5。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述好氧反硝化细菌菌株ZY-3的培养温度为30℃。
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