CN115266280B - 一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氮污染溯源技术领域，尤其涉及一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。所述方法包括：在pH<1.5的条件下，将待测样品和磺胺‑磷酸溶液反应去除亚硝酸盐得到硝酸盐溶液；调节pH为5~9之后针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测；所述磺胺‑磷酸溶液包括：以体积百分比计为5~20%的磷酸、浓度为2~10 g/100mL的磺胺。本发明提供的方法需要的试剂少，且试剂毒性低，测试成本低廉，对人体危害小；同时仍具有较高的稳定性，检测结果可靠且稳定，有效提高了硝酸盐氮氧同位素测定的准确度和精确度。

Description

一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法
技术领域
本发明涉及氮污染溯源技术领域，尤其涉及一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。
背景技术
硝态氮是地球大气圈、生物圈、土壤圈、水圈之间氮素循环过程的关键化学形态，是植物吸收利用的主要氮化合物之一，也是水体富营养化的主要污染物，因此水体硝态氮来源及转化过程的测定，对生态环境监测和研究具有重要意义。稳定同位素技术是识别氮污染来源和研究迁移转化过程的重要手段。硝酸盐氮、氧同位素的测定方法主要有离子交换法、蒸馏法、扩散法、反硝化细菌法和化学转化法等，采用质谱仪的固体或气体模式进行分析。反硝化细菌法前处理简单、所需样品量低、省时省力、测量精度高、准确度好、安全无毒，而且可以同时测定氮、氧同位素，已成为目前主流的测定方法。但是反硝化细菌法以及许多其它分析方法，都不能区分硝酸盐和亚硝酸盐的氮氧同位素。亚硝酸盐是氮循环过程的中间产物，因此在许多环境中往往硝酸盐和亚硝酸盐同时存在，这对于通过目前大多数的可以利用的方法正确分析硝酸盐的氮氧同位素组成提出了挑战。另外，对于采用示踪技术的硝酸盐的同位素分析，也必须去除亚硝酸盐干扰，才能得到准确的氮氧同位素值。
目前硝酸盐正确的同位素分析去除亚硝酸盐干扰的方法主要有两种，一种是采用抗坏血酸去除亚硝酸盐，另一种是扣除混合同位素信号中的亚硝酸盐贡献的差减法。抗坏血酸法是将1M的无氧抗坏血酸加入到样品中，达到终浓度为10mM，抗坏血酸不与硝酸盐反应，而仅与亚硝酸盐选择性反应，使其转换为NO气体并被惰性气体吹扫出去。差减法是，采用叠氮化钠还原法先分析得到亚硝酸盐的氮氧同位素值，然后从混合同位素信号中减去亚硝酸盐的贡献，通过校正方程得到硝酸盐氮氧同位素值。
但是，抗坏血酸法需要严格无氧，试验操作繁琐、持续时间长，且反应要求苛刻：（1）每天准备1.0M的抗坏血酸溶液，要检测抗坏血酸是否被硝酸盐或者亚硝酸盐污染，要吹扫2个小时以去除其中的溶解氧和顶空的O2；（2）样品要吹扫2h，以除去样品中的O2；（3）无氧抗坏血酸被加入到样品中，达到终浓度为10mM，用酸洗过的气密性注射器转移抗坏血酸时，吹扫的惰性气体始终保持吹入，防止氧气进入溶液；（4）抗坏血酸被加入样品后，根据样品中亚硝酸盐的初始浓度要吹扫三小时至过夜。持续吹扫将产生的NO气体被完全吹扫出去，阻止NO形成亚硝酸盐和硝酸盐。
差减法首先需要用叠氮化钠-醋酸缓冲液将亚硝酸盐还原为N2O，叠氮化钠是一种剧毒易爆试剂，具有较高的危险性；其次是还原过程中易出现氧同位素分馏，轻的氧同位素（16O）倾向于以水损失，在后续的反应中产生的氮氧化物就富集重氧（18O），这种现象导致硝酸盐的氧同位素需要复杂的校正，影响了氧同位素结果的准确性和精确性。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。
第一方面，本发明提供一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法，包括：
在pH<1.5的条件下，将待测样品和磺胺-磷酸溶液反应去除亚硝酸盐得到硝酸盐溶液；调节pH为5~9之后针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测；所述磺胺-磷酸溶液包括：
以体积百分比计为5~20%的磷酸、浓度为2~10 g/100mL的磺胺。
进一步地，所述磺胺-磷酸溶液和所述待测样品的体积比为1：（5~20）；和/或，所述待测样品和磺胺-磷酸溶液反应的时间为5~10分钟。
进一步地，所述针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测包括：
采用缺乏N2O还原酶的反硝化细菌将所述硝酸盐溶液中的硝酸盐转化为N2O之后对氮氧同位素进行检测。
进一步地，所述缺乏N2O还原酶的反硝化细菌为致金色假单胞菌；优选为致金色假单胞菌ATCC 13985。
进一步地，所述针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测包括：
将所述致金色假单胞菌置于密闭装置的培养基中培养，去除所述密闭装置和菌液中的空气，加入所述硝酸盐溶液反应2~24小时，加入碱液终止反应后检测氮氧同位素值。
进一步地，还包括：
在加入所述硝酸盐溶液的同时，另外设置多组加入标准样品的平行实验，根据标准样品的氮氧同位素值的检测结果建立校正方程；采用所述校正方程对所述硝酸盐溶液的氮氧同位素值的检测结果进行校正。
所述校正方程如下：
δ15N的标准采用δ15N USGS34=-1.8‰,δ15N USGS32=+180‰;
δ18O的标准采用δ18O USGS34=-27.9‰, δ18O USGS35=+57.5‰;
氮同位素校正方程如下：+180‰=m×δ15NUSGS32-meas +b ①
-1.8‰=m×δ15NUSGS34-meas +b ②，
氧同位素校正方程如下：-27.9‰= m×δ18OUSGS34-meas +b ③
+57.5‰=m×δ18OUSGS35-meas +b ④，
根据标准样品的真实值和测定值，得到m和b，从而得到样品硝酸盐的δ15N和δ18O值。
进一步地，所述标准样品包括：USGS32、USGS34或USGS35中的一种或多种。
进一步地，所述标准样品的加样量为0.1~1.0μg NO3 --N，优选为0.2-0.5 μg NO3 --N。
进一步地，所述碱液包括KOH或NaOH中的一种或多种，优选为5~10M NaOH。
进一步地，所述培养基为去除了NO3 -的TSB培养基。
进一步地，所述去除了NO3 -的TSB培养基包括：
20~40g/L胰蛋白胨大豆肉汤，含有5~10 mM （NH4）2SO4，20~40mM K2HPO4。
本发明具备如下有益效果：
本发明提供的一种快速去除硝酸盐氮氧同位素（δ15N和δ18O）测试中亚硝酸盐干扰的方法，通过磺胺和亚硝酸盐的反应去除样品中的亚硝酸盐之后，再对样品中的硝酸盐进行检测，适应性广，对温度、反应时间没有严格要求，反应之后样品可稳定保存1个月以上。
本发明提供的方法需要极少的试剂，且试剂毒性低，测试成本低廉，对人体危害小；但是方法结果可靠稳定，提高了硝酸盐中氮氧同位素测定的准确度和精确度。
本发明提供的方法针对了目前水体硝酸盐污染严重亟需治理的现状，具有科学性、简便性、可操作性强的优势；同时，对于生态系统中氮同位素标记试验、自然条件下氮循环过程研究均适用，推广前景广阔。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂、细菌等，如无特殊说明，均可从商业途经得到。反硝化细菌致金色假单胞菌（Pseudomonas aureofaciens，ATCC13985）购于ATCC，三种标准物质USGS32，USGS34，USGS35购自USGS。
实施例1
本实施例提供一种快速去除硝酸盐氮氧同位素测试中亚硝酸盐干扰的方法，包括以下步骤：
1、确定样品中硝酸盐和亚硝酸盐浓度
称取USGS32 1.67mg，RSIL-N7373 80μg，定容到100mL，配制硝酸盐和亚硝酸盐混合标样，硝酸盐和亚硝酸盐浓度分别为：16.5μmoL/L和1.16μmoL/L；
2、用酸调节样品pH
取步骤1中的样品5mL放入20mL顶空瓶中，加入6MHCl 20µl后调节样品pH为1.48；
3、加入磺胺-磷酸溶液0.5mL，与样品反应5min；
磺胺-磷酸溶液的配置方法如下：
600mL去离子水中加入100mL 85%磷酸，溶解40g磺胺定容到1L并保存在棕色瓶中。
4、加入碱调节样品pH为5~9
在步骤3所得反应液的基础上，加入5M KOH调节pH值为6.7；
5、培养反硝化细菌及测定样品硝酸盐氮氧同位素值
培养致金色假单胞菌7天（摇床，26℃，160rpm）后收获，4000rpm离心20min，弃去上清留沉淀，利用无NO3 -的TSB液体改良培养基悬浮沉淀，分装到20mL的顶空瓶中，高纯氮气吹扫1h去除菌液以及顶空瓶上空的空气，然后分别加入标准样品和待测样品（加入量为0.1-0.8µg NO3 --N）反应过夜，次日早上加入0.10~0.2mL 10M NaOH终止反应并吸收产生的CO2，然后经PreCon-IRMS测定顶空瓶中的N2O的氮氧同位素值。根据标准样品值，得到的N校正方程：y=1.0244x-0.3489，R=1；O校正方程y=1.0278x–38.736，R=0.9999，说明校正曲线线性良好，根据校正方程得到混标样品的真实值。如表1所示，如果不去除NO2 -，aUSGS32的δ15N和δ18O校正值与真实值差距较大，尤其是δ15N相差+14‰，差距非常大；而去除NO2 -后，混标中bUSGS32的δ15N和δ18O的校正值和真实值非常接近，说明本方法NO2 -去除效果较好，可以得到准确的硝酸盐氮氧同位素值。
表1 标准样品及混标氮氧同位素值（δ15N、δ18O/‰）
Figure 797599DEST_PATH_IMAGE001
注：a未去除NaNO2，b去除NaNO2
实施例2
本实施例提供一种快速去除硝酸盐氮氧同位素测试中亚硝酸盐干扰的方法，包括以下步骤：
1、确定样品中硝酸盐和亚硝酸盐浓度
采用流动注射分析仪测定土壤浸提液中硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，分别为2.86mMol/L，亚硝酸盐0.13mMol/L。
2、用酸调节样品pH
取步骤1样品3mL放入20mL顶空瓶中，加入6MHCl 10µl后调节样品pH为1.35；
3、加入磺胺-磷酸溶液0.15mL，与样品反应10min；
磺胺-磷酸溶液的配置方法如下：
600mL去离子水中加入100mL 85%磷酸，溶解40g磺胺定容到1L并保存在棕色瓶中。
4、加入碱调节样品pH为5~9
在步骤3反应物溶液的基础上，加入10M NaOH调节pH为5.9；
步骤5和实施例1中的步骤5相同。
得到的校正方程为：y=1.0046x-0.6478，R=1，y=0.9909x-37.071，R=0.9999，说明校正曲线线性良好，根据校正方程得到该土壤浸提液中δ15NNO3-为10.57‰，δ18ONO3-为0.45‰，说明该土壤中硝酸盐主要来自于畜禽粪便有机肥。
实施例3
本实施例提供一种快速去除硝酸盐氮氧同位素测试中亚硝酸盐干扰的方法，包括以下步骤：
1、确定样品中硝酸盐和亚硝酸盐浓度
采用流动注射分析仪测定地下水中硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，分别为3.41mMol/L，亚硝酸盐0.06mMol/L。
2、用酸调节样品pH
取步骤1样品5mL放入20mL顶空瓶中，加入6MHCl 30µl后调节样品pH为1.25；
3、加入磺胺-磷酸溶液0.5mL，与样品反应10min；
磺胺-磷酸溶液的配置方法如下：
600mL去离子水中加入100mL 85%磷酸，溶解40g磺胺定容到1L并保存在棕色瓶中。
4、加入碱调节样品pH为5~9
在步骤3反应物溶液的基础上，加入10M NaOH调节pH为7.8；
步骤5和实施例1中的步骤5相同。
得到的校正方程为：y=1.0046x-0.6478，R=1，y=0.9909x-37.071，R=0.9999，说明校正曲线线性良好，根据校正方程得到该土壤浸提液中δ15NNO3-为10.57‰，δ18ONO3-为0.45‰，说明该土壤中硝酸盐主要来自于畜禽粪便有机肥。
y=1.0251x-0.6703，R=1；y=0.9967x-38.721，R=0.9999，说明校正曲线线性良好，根据校正方程得到该地下水中δ15NNO3-为-2.78‰，δ18ONO3-为2.34‰，说明该地下水中硝酸盐主要来自于化肥。
试验例1
本发明进一步对比本申请实施例1的方法，在实施例1的方法的基础上取消酸化流程（即不包括第2步调节pH为1.25），以及现有常规的抗坏血酸法的检测结果，如下表所示：
表2. 抗坏血酸处理及本发明处理标准样品的硝酸盐氮同位素值对比（δ15N/‰）
Figure 292166DEST_PATH_IMAGE002
表3. 抗坏血酸处理及本发明处理标准样品的硝酸盐氧同位素值对比（δ18O/‰）
Figure 496882DEST_PATH_IMAGE003
如表2、表3所示，在加入磺胺-磷酸溶液之前先将样品进行酸化，与不提前酸化及抗坏血酸处理方法相比，得到的硝酸盐氮氧同位素结果均更接近于真实值。
2、亚硝酸盐去除效果
本试验例进一步配制纯亚硝酸盐浓度500µmol/L的样品，分别按照实施例1的步骤1-5及步骤1、5进行氮氧同位素测定（为方便计算，采用加样量为0.3µg NO3 --N），仪器显示的峰面积对应为样品反应产生的N2O的量，根据峰面积可以计算出亚硝酸盐去除效率。如表4所示，对比去除亚硝酸盐前后的峰面积可以发现，去除亚硝酸盐之后的峰面积占未去除峰面积的1%-1.6%，还有的去除之后未检测出峰，说明亚硝酸盐去除率可以达到98.4%以上。
相比之下，采用抗坏血酸方法，抗坏血酸、样品及抗坏血酸加入样品之后分别吹扫2h后，即吹扫6h后，亚硝酸盐去除率只有90%。本发明方法效率大大提高。
表4. 亚硝酸盐去除效果
Figure 633465DEST_PATH_IMAGE004
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法，其特征在于，包括：
在pH<1.5的条件下，将待测样品和磺胺-磷酸溶液反应去除亚硝酸盐得到硝酸盐溶液；调节pH为5~9之后针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测；
所述磺胺-磷酸溶液包括：
以体积百分比计为5~20%的磷酸、浓度为2~10 g/100mL的磺胺；
所述针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素进行检测包括：
将致金色假单胞菌ATCC 13985置于密闭装置的培养基中培养，去除所述密闭装置和菌液中的空气，加入所述硝酸盐溶液反应2~24小时，将所述硝酸盐溶液中的硝酸盐转化为N2O，之后加入碱液终止反应后检测氮氧同位素值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磺胺-磷酸溶液和所述待测样品的体积比为1：（5~20）；和/或，所述待测样品和磺胺-磷酸溶液反应的时间为5~10分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
在加入所述硝酸盐溶液的同时，另外设置多组加入标准样品的平行实验，根据标准样品的氮氧同位素值的检测结果建立校正方程；采用所述校正方程对所述硝酸盐溶液的氮氧同位素值的检测结果进行校正。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述标准样品包括：USGS32、USGS34或USGS35中的一种或多种。
5.根据权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，所述碱液包括KOH或NaOH中的一种或多种。
6.根据权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，所述培养基为去除了NO3 -的TSB培养基。
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