CN107201328B - 一株耐受磺胺类抗生素毒性的无色杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株耐受磺胺类抗生素毒性的无色杆菌(Achromobacter sp.)及其在污水处理中的应用。本发明提供一株具有磺胺类抗生素耐受性的高效好氧反硝化菌株无色杆菌(Achromobacter sp.)，其保藏号为CGMCC №2964。当水体中存在磺胺类抗生素时，该无色杆菌依然能够保持完整的细胞结构和高效的好氧反硝化性能。该菌株能够以硝酸盐氮为唯一氮源，在好氧条件下，对硝酸盐氮去除率可达100％，总氮的去除率也可达90‑100％。本发明具有操作便捷，脱氮效率高等优点，对优化污水生物处理系统和减弱磺胺类抗生素对污水脱氮系统的影响具有重要意义。

Description

一株耐受磺胺类抗生素毒性的无色杆菌及其应用
技术领域
本发明属于污水生物处理技术领域，具体涉及一种在好氧条件下能够耐受磺胺类抗生素毒性且能够将水体中的硝酸盐氮同步脱除的无色杆菌及其在污水处理中的应用。
背景技术
随着抗生素在畜牧业和水产养殖业中的广泛使用，多种抗生素，如磺胺类、四环素类、大环内脂类、喹诺酮类等，在中国的城镇污水处理厂进水中被频繁检出，其中磺胺类抗生素的浓度范围在20ng/L至10μg/L之间。研究表明，大多数抗生素都有很广的抗菌谱，会杀死环境中某些种属的微生物或抑制某些微生物的生长、繁衍，破坏生态环境多样性。长期暴露于低剂量抗生素环境中的微生物将产生大量耐药菌，直接危害人类健康。磺胺类抗生素作为抗生素中重要的一类药物，具有对氨基苯磺酰胺结构，广泛应用于兽医临床预防和治疗细菌感染性疾病。有报道指出，在污水生物处理系统中，磺胺类抗生素的存在对传统厌氧反硝化作用产生明显的负面效应，不仅能够抑制反硝化菌的生长和它们的反硝化速率，降低反硝化酶活性，而且可以改变反硝化微生物群落结构以及降低反硝化微生物群落丰度，进而影响污水处理系统的正常运行。
好氧反硝化作用是上世纪80年代提出的一种新型生物脱氮技术，该技术基于好氧反硝化菌可以同时进行氧气和硝酸盐呼吸的特性，为实现在单一好氧反应器中达到脱氮目的提供了理论基础。自从第一株好氧反硝化菌T.pantotropha被成功分离后，近年来更多的高效好氧反硝化菌株得到分离，并被应用于实际污水处理系统中。好氧反硝化作用作为一种新型生物脱氮技术，因其工艺简单、脱氮效果好、不需补加酸碱等优势近年来得到了快速发展。
鉴于好氧反硝化菌在污水处理厂中大规模的应用前景以及磺胺类抗生素在城镇污水处理系统进水中的普遍存在性，因此，发掘能够耐受磺胺类抗生素毒性的好氧反硝化细菌，并将其应用于污水处理中，将会有效削磺胺类抗生素对污水生物脱氮过程的潜在风险，为保障城镇污水处理系统的正常运行具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐受磺胺类抗生素毒性的高效好氧脱氮菌株，通过该菌株强化污水处理系统的生物脱氮效果，以削减磺胺类抗生素的存在对污水处理生物脱氮过程的影响。
本发明所提供的无色杆菌(Achromobacter sp.)是一株具有在单一好氧环境中实现硝酸盐氮去除能力的好氧反硝化细菌。
本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供的耐受磺胺类抗生素毒性的高效好氧脱氮菌株为无色杆菌(Achromobacter sp.)，其保藏号为CGMCC№2964。
如上所述的无色杆菌(Achromobacter sp.)，其特征在于：在0～20μg/L磺胺类抗生素浓度条件下，菌株依然能够保持完整的细胞结构，细胞膜不被破坏；
优选的，所述磺胺类抗生素浓度为0～8μg/L；
如上所述的无色杆菌(Achromobacter sp.)，其特征在于：该菌株能够在0～8μg/L磺胺类抗生素浓度水平下以硝酸盐氮为氮源，以有机物为碳源进行好氧反硝化作用，从而将硝酸盐氮去除。
如上所述的无色杆菌(Achromobacter sp.)在污水处理中的应用，其特征在于：在含磺胺类抗生素污水中加入无色杆菌(Achromobacter sp.)，并且添加适量碳源进行曝气，即可实现污水中硝酸盐氮的去除。
以上所述的方法，其特征在于：控制所述含磺胺类抗生素污水中的温度为30℃，pH值为7.5，溶解氧为6mg/L，初始C/N比为4。
以上所述的方法，其特征在于：污水所含的磺胺类抗生素为磺胺甲恶唑(SMX)，浓度范围为0～8μg/L，在好氧环境下硝酸盐氮的去除率高达100％，总氮的去除率可达90％以上。
本发明的有益效果是：
(1)本方法采用的无色杆菌具有高效好氧反硝化能力，为单一反应器中实现同步硝化反硝化提供了一条可靠的途径。
(2)本方法具有脱氮效率高、操作便捷等优点，与传统生物脱氮相比具有巨大的经济效益。
(3)将该菌株接种到含磺胺类抗生素污水的生物处理中，在0～8μg/L SMX存在条件下，硝酸盐氮的去除率可达100％，说明菌株具有较强的耐受磺胺类抗生素毒性和好氧反硝化能力。这种特性使得该菌株在城镇污水处理系统的实用性大大增强。
附图说明
图1为无色杆菌在磺胺类抗生素存在条件下的扫描电镜图像。
图2为无色杆菌在空白对照组中(0μg/L SMX)的好氧反硝化特性。
图3为无色杆菌在2μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性。
图4为无色杆菌在4μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性。
图5为无色杆菌在8μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1.利用扫描电镜观察无色杆菌在磺胺类抗生素存在时的表观形态
本方法所用高效好氧反硝化菌株为无色杆菌(Achromobacter sp.)，其分离自垃圾填埋场渗滤液处理系统。
将无色杆菌(Achromobacter sp.)接种于1L的LB培养基中(每升含NaCl 5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.5％的NaCl洗涤三次，制成光密度OD600为1-2的菌悬液。然后再将菌悬液按10％的接种量分别接种于含有0和8μg/L SMX的LB培养基中，8h后取样在8000rpm和4℃条件下离心5min去除上清液，并用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗两次。用2.5％戊二醛固定1h，乙醇梯度洗脱后分散在无水乙醇中，取少量滴在硅片上晾干，在扫描电镜(SEM)下观察细胞形态。
结果如图1所示，当SMX浓度为8μg/L时，无色杆菌(Achromobacter sp.)呈现完整和光滑的表面，说明该菌株的细胞形态对磺胺类抗生素具有较强耐受性。
实施例2.无色杆菌在空白对照组中(0μg/L SMX)的好氧反硝化特性
反硝化性能测试培养基(BM)配方为每升水中：8.45g CH3COONa,0.63g NH4Cl,0.61g NaNO3,1.76g K2HPO4·3H2O,0.20g MgSO4·7H2O,0.02g CaCl2,0.005g FeSO4·7H2O,0.1mL微量元素溶液。将培养基pH值调至7.5，在121℃灭菌30min。
将菌株Achromobacter sp.接种于BM培养基中，在30℃和150rpm条件下进行震荡培养，每隔5h用具阀进样针分别抽取100μL顶空气体用于测定N2O，用无菌注射器抽取2mL气体注入到2L纯氦气袋中用于测定NO。与此同时，用无菌注射器抽取2mL菌悬液，菌液在4℃下8000rpm离心5min，取上清液用于分析氨氮，硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度。
结果如图2所示，在空白对照组中(0μg/L SMX)，100mg/L硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在10h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为10.0mg/L/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮快速积累，并在5h达到最高值43.0mg/L，然后在10h被还原。反硝化过程的中间产物NO和N2O积累量的最高值为7.5μg/L和0.62mg/L，只占硝酸盐氮去除量的0.0075％和0.62％，说明该无色杆菌菌株具有高效好氧反硝化能力。
实施例3.无色杆菌在2μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性
将菌株Achromobacter sp.接种于含有2μg/L SMX的BM培养基中测试其好氧反硝化性能。结果如图3所示，100mg/L硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在20h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为5.0mg/L/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮逐渐积累，并在10h达到最高值46.7mg/L，然后在20h被还原。同时，N2O也逐渐积累，在20h达到最高值10.6mg/L，然后在35h被全部还原。必须指出，此时反硝化过程的中间产物NO积累量的最高值为9.6μg/L，只占硝酸盐氮去除量的0.0096％。由此可以看出，该无色杆菌能够在2μg/LSMX的条件下顺利完成好氧反硝化全过程。
实施例4.无色杆菌在4μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性
将菌株Achromobacter sp.接种于含有4μg/L SMX的BM培养基中测试其好氧反硝化性能。结果如图4所示，当菌株暴露于4μg/L SMX时，100mg/L硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在25h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为4.0mg/L/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮逐渐积累，并在15h达到最高值50.8mg/L，然后在30h被还原。同时，N2O也逐渐积累，在30h达到最高值18.8mg/L，然后在45h被全部还原。必须指出，此时反硝化过程的中间产物NO积累量的最高值为8.3μg/L，只占硝酸盐氮去除量的0.0083％。由此可以看出，菌株能够在4μg/L SMX的条件下顺利完成好氧反硝化全过程。
实施5.无色杆菌在8μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性。
将菌株Achromobacter sp.接种于含有8μg/L SMX的BM培养基中测试其好氧反硝化性能。结果如图5所示，当菌株暴露于8μg/L SMX时，100mg/L硝酸盐氮在接种后逐渐被菌株利用，并在40h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为2.5mg/L/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮逐渐积累，并在30h达到最高值69.5mg/L，然后在50h被还原。同时，N2O也逐渐积累，在40h达到最高值52.0mg/L，随后逐渐降低。必须指出，此时反硝化过程的中间产物NO积累量的最高值为6.9μg/L，只占硝酸盐氮去除量的0.0069％。由此可以看出，在8μg/LSMX条件下，该无色杆菌依然能够进行好氧反硝化作用。
由实施例1-5中可以看出，本申请所涉及到的该菌株接种到含磺胺类抗生素污水的生物处理中，在0～8μg/L SMX存在条件下，硝酸盐氮的去除率可达100％(见表1)，说明菌株具有较强的耐受磺胺类抗生素毒性和好氧反硝化能力。这种特性使得该菌株在城镇污水处理系统的实用性大大增强。
表1无色杆菌在不同浓度SMX存在条件下的脱氮特性
SMX(μg/L) 50h硝酸盐氮去除率 50h总氮去除率
0 100％ 100％
2 100％ 100％
4 100％ 100％
8 100％ 100％
实施例6.无色杆菌在20μg/L SMX存在条件下的好氧反硝化特性
将无色杆菌(Achromobacter sp.)接种于含有20μg/L SMX的BM培养基中测试其好氧反硝化性能。菌株的生长受到明显的抑制，且硝酸盐氮几乎不被去除，由此可以看出，20μg/L SMX是该菌株的上限浓度，菌株在该条件下不具备好氧反硝化的能力。
实施例7.无色杆菌在含磺胺类抗生素废水中的应用
将无色杆菌投加入活性污泥系统处理含磺胺类抗生素废水，续曝气保持体系溶解氧为6mg/L，废水水质如下：pH为7.5，硝酸盐氮含量100mg/L，SMX 6μg/L。结果如表2所示，在普通活性污泥系统内，脱氮效果在SMX存在条件下受到了较大的影响。然而，经无色杆菌强化后的系统，24h的硝酸盐氮去除率为75.2％，总氮去除率为56.8％；36h的硝酸盐氮去除率为92.5％，总氮去除率为91.1％(见表2)。
表2.无色杆菌应用于活性污泥体系中的生物脱氮结果
Figure BDA0001327911670000051
Figure BDA0001327911670000061
由此可见，鉴于好氧反硝化菌在污水处理厂中大规模的应用前景以及磺胺类抗生素在城镇污水处理系统进水中的普遍存在性，本发明所涉及到的这种无色杆菌可以广泛的应用于污水处理中，会有效削磺胺类抗生素对污水生物脱氮过程的潜在风险，为保障城镇污水处理系统的正常运行具有重要意义。
应当说明的是，以上实施例只是为了对本发明作进一步详细的描述，不是用来对本发明进行限定的，在不脱离本发明的构思和精神的范围内，本领域普通技术人员，可以进行各种改进或变化，仍然属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一株耐受磺胺类抗生素毒性的无色杆菌的应用，其特征在于：通过一株高效好氧反硝化细菌无色杆菌(Achromobacter sp.)强化污水处理系统的生物脱氮效果，可削减磺胺类抗生素的存在对污水处理生物脱氮过程的影响,其中所述的无色杆菌(Achromobactersp.)，其保藏号为CGMCC№2964；其中所述的无色杆菌(Achromobacter sp.)对0～20μg/L浓度范围内的磺胺类抗生素具有较好的耐受能力，能够在0～8μg/L磺胺类抗生素浓度水平下以硝酸盐氮为氮源，以有机物为碳源进行好氧反硝化作用，从而将硝酸盐氮去除；所述的应用，将该无色杆菌(Achromobacter sp.)投加至活性污泥系统，含磺胺类抗生素污水中加入，并且添加适量碳源进行曝气，即可实现污水中硝酸盐氮的去除；控制所述污水中的温度为30℃；控制所述污水中的pH值为7.5；控制所述污水中的溶解氧为6mg/L；控制所述污水中的初始C/N比为4；所述的磺胺类抗生素为磺胺甲恶唑(SMX)。
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