CN102168038A - 能够降解二噁烷的黄色杆菌d7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株可降解二噁烷的新菌株一黄色杆菌D7及其在微生物分解处理二噁烷的应用。黄色杆菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2010年9月9日，保藏编号：CCTCC NO：M 2010225。本发明提供的二噁烷降解菌为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能利用二噁烷作为唯一碳源与能源繁殖并将该底物矿化成CO₂和H₂O；在纯培养条件下，该菌于pH4.0～10、25℃～40℃范围内均能将二噁烷降解；该菌株有较强的环境适应能力，可用于污染环境的生物修复，为生物法净化含二噁烷废水及废气的工程应用奠定了基础。

Description

能够降解二噁烷的黄色杆菌D7及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株能够降解二噁烷的新菌株——黄色杆菌D7及其应用。

(二)背景技术

二噁烷(1，4-Dioxane)亦称1，4-二氧六环、双乙酐，是一种具有乙醚味的可燃性液体，毒性较大，被美国环保署列为B2级(可能的)人类致癌物。二噁烷作为一种重要的有机化工溶剂，在医药、化妆品、香料等特殊精细化学品制造以及科学研究中作为溶剂、反应介质、萃取剂使用。另外，许多表面活性剂也含有二噁烷，这些表面活性剂常被用于各种消费产品，如各种家用洗涤剂。二噁烷溶解能力强，而且相关研究表明，二噁烷是一种细胞色素酶P450的抑制剂，可通过呼吸道、消化道、皮肤进入机体。低浓度时对皮肤和粘膜有麻醉和刺激作用；并且会在体内蓄积。如接触大量蒸气将引起眼和上呼吸道刺激，且伴有头晕、头痛、嗜睡、恶心、呕吐等症状。另外，二噁烷可致肝、皮肤损害，甚至发生尿毒症。

二噁烷的广泛应用使其对地下水及大气的污染日益严重，因此急需寻求一种有效的方法对其进行去除。二噁烷是含有两个相对称醚键的环状有机化合物，这种化学结构使其具有高水溶性和高耐生物降解性，因而二噁烷曾一度被认为“不可生物降解”。随着Dmitreko等于1987年从反应器中分离到了能利用二噁烷的混合菌株Arthrobacter sp.、Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，越来越多的研究者开始了生物法处理二噁烷的研究。1993年，Sock等在连续流附着式反应器中，培养出以二噁烷为唯一碳源和能源的混合菌群。Roy研究表明，经过32天的适应期，活性污泥填充反应器可完全降解150mg/L的二噁烷，但高浓度的二噁烷不能被完全降解，可能是由于有毒副产物的抑制作用。另外一些研究者已经证明了纯菌可以降解二噁烷。Bemhardt和Diekman等学者分离的Rhodococcus sp.可矿化高浓度(880mg/L)的二噁烷，但能否持续生长却不得而知。同时，他提出了二噁烷的生物降解途径可能是先经过羟基化，而后再开环。1993年，Burback和Perry分离出了具有降解二噁烷的Mycobacterium vaccae，但该菌株降解二噁烷的能力是有限的，且不能持续生长。1994年，Parales分离的Nocardioform actinomycetes CB1190可以二噁烷为唯一碳源和能源物质，并持续生长，最终将其矿化，其降解速率是0.33mg/(mg蛋白·min)。Nakamiya等分离出的真菌Cordyceps sinensis也能以二噁烷为唯一碳源和能源生长。

目前国内对二噁烷的研究较少。浙江大学陈红研究了厌氧条件下，铁还原菌-Fe(III)-腐殖酸生物/非生物协同作用和在腐殖酸还原菌生物/非生物协同作用两个体系下的二噁烷降解情况。研究表明，铁还原菌-Fe(II)-腐殖酸生物非生物协同作用，40天二噁烷去除率达到了90.47％，加入不同量的氧化铁对二噁烷降解影响不大，但是增加溶解态Fe(III)加入量却对二噁烷的氧化降解效率有一定提高。而腐殖酸还原菌-腐殖酸-Fe(III)生物/非生物协同作用，40天内二噁烷基本降解完全。

迄今尚未有黄色杆菌降解二噁烷的报道。

(三)发明内容

本发明一株能够降解二噁烷的新菌株——黄色杆菌D7及其应用。

本发明采用的技术方案是：

能够降解二噁烷的黄色杆菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2010年09月09日，保藏编号：CCTCC NO：M 2010225。

本发明所提供的二噁烷降解菌D7来源于浙江某化工厂污水处理池的活性污泥，经人工驯化、富集、分离得到。该菌是一株革兰氏阴性菌，菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为(0.5～0.7)μm×(0.8～1.0)μm，无芽孢；菌落呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、柠檬酸盐为阳性；接触酶、V.P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。

本发明还涉及所述的黄色杆菌D7在微生物降解二噁烷中的应用。可按照本领域常规方法，将黄色杆菌D7接种至含二噁烷的废水中，或者将含二噁烷的废气通入黄色杆菌D7菌液中，对废水或废气进行处理。

优选的，所述降解在pH 4.0～10、25℃～40℃下进行。

Xanthobacter sp.D7能利用二噁烷作为唯一碳源和能源生长繁殖，将二噁烷矿化成CO₂和H₂O。在纯培养条件下，该菌在48h内能将无机盐培养基中100mg/L的二噁烷完全降解。

所述无机盐培养基(BSM)每1000mL含有：Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～6.0g/L、KH₂PO₄ 0.1～4.0g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.1～3.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.05～0.6g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01～0.1g/L，微量元素母液0.5～5mL，二噁烷0.01～5mM，pH 4.0～10.0。微量元素母液浓度组成：FeSO₄·7H₂O 1.0g/L、CuSO₄·5H₂O0.02g/L、H₃BO₃ 0.014g/L、MnSO₄·4H₂O 0.10g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 0.02g/L，溶剂为水。

所述黄色杆菌D7降解二噁烷不需要经过诱导阶段，即可稳定有效地降解二噁烷。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株二噁烷的高效降解菌，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以二噁烷为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物；并且该菌株不需要经过诱导阶段，可稳定的降解底物二噁烷。本发明为生物法净化含二噁烷废水及废气的工程应用奠定了基础。

(四)附图说明

图1为黄色杆菌D7的透射电镜照片；

图2上为黄色杆菌D7的菌体生长、二噁烷降解和有机碳含量曲线图；

图3为不同pH下黄色杆菌D7对二噁烷降解率的影响；

图4为不同温度下，黄色杆菌D7菌体生长和二噁烷浓度的变化情况；

图5为黄色杆菌D7经过不同培养基预培养后转接入含二噁烷的新鲜BSM培养基中，菌体对二噁烷的降解情况；-■-R2A/BSM表示在R2A溶液中预培养菌体接种至新鲜BSM中的二噁烷降解情况；-●-BSM/BSM表示在BSM培养基上培养后收集菌体接种至新鲜BSM中的二噁烷降解情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

Xanthobacter sp.D7的分离与鉴定

(1)样品采集及驯化

现场采集浙江某化工厂污水处理池的活性污泥，以二噁烷为唯一碳源和能源，进行驯化、富集。数月后，将活性污泥接种到含50mL BSM培养基的250mL密封盐水瓶中，以二噁烷作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30±1℃)，并保持在好氧条件下进行。

BSM按如下组成配制：4.5g Na₂HPO₄·12H₂O、1.0g KH₂PO₄、1.5g NH₄Cl、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.023g CaCl₂，1mL微量元素母液，水补足至1000mL。

微量元素母液浓度组成：FeSO₄·7H₂O 1.0g/L、CuSO₄·5H₂O 0.02g/L、H₃BO₃ 0.014g/L、MnSO₄·4H₂O 0.10g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.10g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 0.02g/L，溶剂为水。

(2)菌株分离与鉴定

将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以二噁烷为唯一碳源和能源的BSM中，测试降解活性。选择具有二噁烷降解能力的纯菌，进一步分离纯化，获得有二噁烷降解活性的菌株D7。

菌株D7细胞呈短杆状，大小为(0.5～0.7)μm×(0.g～1.0)μm，无芽孢；菌落呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。

D7的生理生化特征为：好氧，氧化酶反应为阳性，柠檬酸盐为阳性；接触酶、V.P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。

上述特征与文献(《常见细菌鉴定手册》)编录的黄色杆菌的生理生化性状相吻合。该菌株经16S rDNA同源性分析，结合以上生理生化的菌学特征，将其鉴定为黄色杆菌属(Xanthobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2010225。

实施例2：Xanthobacter sp.D7(CCTCC NO：M 2010225)降解二噁烷的性能

种子液制备：D7接种于R2A斜面中培养3天，再从斜面接种至含100mg/L二噁烷的BSM培养基中培养2天，1200rpm/min离心5min，弃去上清液，用生理盐水润洗菌体2次，配成菌悬液，即为实验的种子液。

以二噁烷作为Xanthobacter sp.D7的唯一碳源，从种子液中接菌体至50mL BSM培养基，使初始菌体浓度(以OD计)为0.01；加入二噁烷使初始二噁烷浓度为100mg/L。放入温度为30℃、转数为160r/min的摇床中培养，每隔一段时间取一次样，结果见图2。随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，至48h时，菌体浓度达到0.178(以OD计)。本实施例说明降解菌Xanthobacter sp.D7可利用二噁烷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解二噁烷的能力。

用1mol/L NaOH或HCl溶液调节BSM培养基为不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)，在初始二噁烷浓度为100mg/L的条件下，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度(以OD计)为0.01。将样品于30℃、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养40h后取样，测菌体及反应液中残余二噁烷的浓度。实验过程中，设计3个平行样和一个空白对照(下同)，结果见图3。

可见，在pH4.0～10.0，微生物均能降解二噁烷并伴随细胞浓度的增加；随着pH从4.0增大到10.0，菌体浓度及二噁烷降解率均先增大后减小，Xanthobacter sp.D7降解二噁烷的较适宜的pH值为7.0。本研究表明菌株D7在pH4.0～10.0均能不同程度地降解二噁烷，为其在不同pH环境的应用提供了保证。

在初始二噁烷浓度为100mg/L的BSM培养基中，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0.01(以OD计)。将各个样品分别置于温度为25℃、30℃、37℃、40℃摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，定时取样，测菌体及反应液中残余二噁烷的浓度。由图4可知，在25℃～40℃温度范围内，Xanthobacter sp.D7均能生长，但温度在37℃以上时，D7的生长明显较低温的缓慢。当温度为37℃，细胞生长速率最快，36h即达稳定期，菌体浓度(以OD计)达0.180，体系中的二噁烷被完全降解，去除率达到100％。随着温度的进一步下降，菌株的生长和降解能力开始下降。

将Xanthobacter sp.D7分别接种于R2A液体培养基和BSM培养基中进行预培养后收集菌体制成悬浊液作为种子液。于50mL BSM培养基中加入100mg/L底物二噁烷，分别接入Xanthobacter sp.D7种子液使初始浓度达到0.4(以OD计)，于30℃、160r/min的摇床中进行降解实验。结果如图2所示，在高浓度菌液下，经过R2A液体培养基预培养的Xanthobacter sp.D7较BSM培养基稍慢，但在降解底物二噁烷的初期没有明显的停滞期。可初步判定Xanthobacter sp.D7不需要经过诱导阶段，即可达到降解二噁烷的目的。该研究有利于进一步扩大生产，使其应用于生物法净化含二噁烷废水及废气的工程。

实施例3：Xanthobacter sp.D7净化二噁烷废水

在生物滴滤塔中接种Xanthobacter sp.D7菌液连续处理浓度为100mg/m³的二噁烷废气。经过25天的挂膜启动后，生物滴滤塔二噁烷废气的净化效率达93％以上，此后系统能一直稳定运行。

Claims (4)

1.能够降解二噁烷的黄色杆菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2010年09月09日，保藏编号：CCTCC NO：M 2010225。

2.如权利要求1所述的黄色杆菌D7，其特征在于所述黄色杆菌D7菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为(0.5～0.7)μm×(0.8～1.0)μm，无芽孢；菌落呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、柠檬酸盐为阳性；接触酶、V.P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。

3.如权利要求1或2所述的黄色杆菌D7在微生物降解二噁烷中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在pH 4.0～10、25℃～40℃下进行。

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