CN102634466B - 一株腐殖质还原陶厄氏菌及应用和微生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株Thauerahumireducens CCTCCM2011497及其在硝酸盐还原及腐殖质还原中的应用。本发明从运行良好的污泥微生物燃料电池阳极生物膜中分离纯化得到一株Thauerahumireducens菌株SgZ-1，其具有较强厌氧反硝化能力和腐殖质还原能力，在土壤原位修复方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物系统分类和环境生物技术领域，具体涉及一株腐殖质还原陶厄氏菌（Thauera humireducens）新种的分离鉴定，及其在厌氧条件下还原腐殖质的应用，以及相应的微生物制剂。
背景技术
随着化肥的大量使用，过量的N元素累积在土壤和深层污泥中，对生物的正常生长具有毒害作用。在水体中，N的累积也是水体富营养化的一个重要原因。在土壤和深层污泥中，微生物可利用氨态氮供能，将N氧化为硝酸盐或亚硝酸盐（一般统称为硝酸盐）。硝酸盐或亚硝酸盐的大量累积，，不仅对作物的生长有毒害作用，而且可能引起亚硝酸盐在作物，特别是蔬菜中的累积，直接危害人类的食品安全。消除土壤或污泥中累积的硝酸盐或亚硝酸盐，具有重要的实际意义。
反硝化作用也称为脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，利用NO2-和NO3-为呼吸作用的电子受体，把硝酸还原成氮（N2），并从中获得能量供菌体生长。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为碳源和能源，进行无氧呼吸。
腐殖质是富含醌基的、非均相的天然有机混合物，是土壤有机质的主体，约占土壤有机碳的60～80%。研究表明，腐殖质可在厌氧条件下作为电子受体，为微生物供能来支持微生物的生长，这种微生物代谢类型成为腐殖质呼吸，具有腐殖质呼吸活性的微生物称为腐殖质还原菌。腐殖质呼吸在元素的生物地球化学循环、水体自净、污染土壤原位修复及污水处理等方面具有积极作用。
反硝化作用和腐殖质呼吸都是厌氧环境中普遍存在的微生物呼吸代谢模式，土壤中一般这两种呼吸作用同时存在，作用于有机物的生物降解，当环境中的氧化还原体系不同时，两种呼吸代谢途径在有机物降解中的贡献也不尽相同。正是由于两种呼吸方式的共同作用才提高了有机物的可利用谱，增加了彻底清除环境中多种有机物复合污染的可能性。
陶厄氏属细菌是Betaproteobacteria纲下的一类革兰氏阴性细菌。已知的陶厄氏属细菌共有9个种，其中有8个种的代表菌株已被证明是反硝化菌。对已经分离的陶厄氏属菌株的研究表明，很多菌株都能在反硝化条件下利用苯酚、多酚、卤代苯甲酸盐及甲苯等作为碳源，具有广泛的芳香族化合物降解能力。因此，它被认为是一类广泛存在于各种类型的废水处理装置中并具有多种污染物降解能力的重要功能类群。然而，目前为止，尚没有证明陶厄氏细菌具有腐殖质还原能力的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有厌氧反硝化和腐殖质还原能力的新菌种：陶厄氏菌（Thauera humireducens）SgZ-1。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在硝酸盐还原和腐殖质还原中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种腐殖质还原和硝酸盐还原微生物制剂。
申请人于2011年10月28日将菌株保藏在位于湖北武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2011年12月31日收到申请人提供的菌株陶厄氏菌（Thauera humireducens）SgZ-1。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC M2011497，建议的分类命名为Thauera humireducens SgZ-1，已于2012年1月10日鉴定保藏的菌株是存活的。
将本发明的菌株SgZ-1与可接受的辅料混合在一起，即可得到可以进行腐殖质还原和硝酸盐还原的微生物制剂。
本发明的菌株陶厄氏菌（Thauera humireducens）SgZ-1，可利用多种底物进行硝酸盐和腐殖质的还原，可以有效地去除硝酸盐积累，还原腐殖质，加速有机污染物的降解，在环境修复方面具有广泛的应用前景。
本发明的微生物制剂，可以很好的还原硝酸盐和腐殖质。
附图说明：
图1：本发明菌株的3000×透射电镜照片；
图2：本发明菌株的16S rRNA基因系统发育树；
图3：本发明菌株使用不同电子供体还原AQDS的实验结果图。
具体实施方式
菌株SgZ-1的富集和分离
1）从污泥微生物燃料电池中撕取阳极碳毡浸泡于50 mL液体富集培养基中，液体富集培养基的组成是：0.25 g NH4Cl、0.678 g NaH2PO4·2H2O、0.1 g KCl、2.94 g NaHCO3、1.59 g Na2CO3，10.0 mL维生素溶液、10.0 mL微量元素溶液，其中，维生素溶液是每升去离子水中含2.0 mg生物素、2.0 mg叶酸、VB6 10.0 mg维生素、5.0 mg硫胺素、5.0 mg核黄素、5.0 mg烟酸、5.0 mg泛酸钙、0.1 mg维生素B12、5.0 mg对氨基苯甲酸、5.0 mg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中含1.5 g氨三乙酸、3.0 g MgSO4·7H2O、0.5 g MnSO4·H2O、1.0 g NaCl、0.1 g FeSO4·7H2O、0.1 g CoCl2·6H2O、0.1 g CaCl2、0.1 g ZnSO4·7H2O、0.01 g CuSO4·5H2O、0.01 g AlK(SO4)2·12H2O、0.01 g H3BO3、0.01 g Na2MoO4·2H2O；灭菌后添加1 g葡萄糖和16 g AQDS分别作为电子供体和电子受体。
2）往已接种的富集培养基中充混合气（N2/CO2=80/20）30分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况；
3）当培养液颜色从无色变为橙黄色时，以10%的接种量将培养液转接至另一新鲜的液体富集培养基，厌氧操作及厌氧培养条件同２），如此富集培养三次；
4）将第四代反应后的培养液采用稀释平板法进行梯度稀释，将稀释后的培养液0.1 mL均匀涂布于TSA培养基上，置于厌氧工作站，30℃培养48 h，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化，其中，所述TSA培养基的组成是：胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，D（＋）-葡萄糖2.5 g，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 2.5 g，琼脂粉20 g/L，pH调节至7.2。
筛选得到腐殖质还原陶厄氏菌（Thauera humireducens）SgZ-1。
菌株SgZ-1的形态特征
1）菌体形态特性
菌株SgZ-1为革兰氏阴性菌；透射电子显微镜结果（图1）显示菌株为杆状，菌体大小为0.6-0.8×1.8-2.5 μm，单鞭毛，端生。
）菌落形态特性
有氧、30 ℃的条件下，将菌株SgZ-1在TSA上培养24 h后，菌落表面光滑不透明，边缘整齐，菌落直径约0.8～1.2 mm。
菌株SgZ-1的生理生化特征
根据《伯杰细菌鉴定鉴定手册》第九版所述的标准程序测试菌株的生理生化特征，以及利用API ID32GN、20E、ZYM实验条检测其他的理化性质，菌株为非发酵型兼性厌氧菌，结果见下表：
菌株SgZ-1的化学分类学特征
为确定发明菌株的分类地位，测定了菌株SgZ-1细胞的脂肪酸含量，结果如表2所示。
*Summed feature 3 包括 C16:1 ω6c 和/或 C16:1 ω7c; Summed feature 7 包括 18.846, C19:1 ω6c 和 C19:0 cyclo ω6c三种组分的一种或几种;Summed feature 8 包括 C18:1 ω6c 和/或 C18:1 ω7c。
菌株SgZ-1的分子分类地位
提取发明菌株的总DNA。以提取的DNA为模板，以通用引物27F和1492R扩增细菌的16S rRNA基因，将PCR扩增产物回收纯化后进行测序，所得序列在GenBank中的基因登录号为JQ038037。
通过EzTaxon server 2.1网站的在线比对工具进行比对，结果显示，与菌株SgZ-1同源性相近的菌株都属于陶厄氏菌，分别是T. aminoaromatica（相似性96.7%，1441 bp），T. selenatis（相似性96.7%，1435 bp），T. phenylacetica（相似性96.6%，1443 bp），T. chlorobenzoica（相似性96.5%，1439 bp），T. mechernichensis（相似性96.3%，1435 bp），T. terpenica（相似性96.2%，1441 bp），T. aromatic（相似性96.0%，1440 bp）， T. butanivorans（相似性95.4%，1433 bp），T. linaloolentis（相似性94.9%，1438 bp）。根据系统发育理论，菌株间相似性只有大于97%，才能认为是相同菌株，目标菌株与其最相近菌株T. aminoaromatica的相似性也只有96.7%，因此，该菌株被界定为新种。
将与发明菌株同属的所有菌株序列下载保存并使用CLUSTALX.1.8进行多序列比对分析。然后采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega,Version2.1)软件作进化分析，采用Neighbor-joining方法构建系统发育树，进化树用1200次重复取样的bootstrap方法验证。所构建的系统发育树如图2所示。
综合上述的形态学特征、生理生化特性及系统发育分析，本发明菌株应归于陶厄氏属（Thauera），且界定为新种，将其命名为腐殖质还原陶厄氏菌（Thauera humireducens）
菌株SgZ-1在不同电子供体下的反硝化作用
1) 反硝化培养基配方：每升去离子水中0.5 g MgSO4·7H2O, 0.5 g NH4Cl, 0.5 g KH2PO4, 0.1 g CaCl2, 0.85 g NaNO3, 1 ml 维生素溶液和2 ml 微量元素溶液（维生素溶液和微量元素溶液成分同分离培养基），用HCl或NaOH调节培养基pH至7.2±0.2，于121℃灭菌20分钟，灭菌后分别添加灭菌的下列物质作为唯一碳氮源：乙酸钠（终浓度10 mM），己二酸（10 mM），丙氨酸（10），天冬氨酸 (2.5), 苯甲酸盐(2.5), 丁酸盐 (10), 酪蛋白 (10), 柠檬酸钠 (10), 乙醇(5), 甲酸盐(10), 葡萄糖 (10), 乳酸 (10), 苹果酸 (10), 甲醇 (5), 苯酚 (15), 脯氨酸 (10), 丙酸钠 (10), 丙酮酸盐 (10), 丝氨酸 (10), 琥珀酸钠 (10), 可溶性淀粉 (10), 甲苯 (20), 吐温 80 (10), 酪氨酸 (2.5) ；
2) 从保存菌株SgZ-1的斜面挑取菌苔接种至TSB培养基中，于30℃，180 rpm摇床活化菌体18小时，使细菌数量达到指数生长期；
3) 4℃，6 000 rpm离心10 min，去上清液，用0.85%的生理盐水重新悬浮。重复上述操作2次，最终悬浮液的浓度达到OD600约1.0，加入1 ml 菌体悬浮液作为处理，同时设置不加菌的对照；
4) 充N2 30 min以排尽氧气，然后厌氧条件下培养7天，检测菌体生长情况。
5) 实验结果如表3所示，菌株SgZ-1可以利用大部分的供试物质特作为电子供体进行反硝化作用，并从中获得能量进行生长。
菌株SgZ-1利用不同电子供体还原AQDS的试验
1) 采用上述液体富集培养基，灭菌后添加终浓度为1 mM的AQDS作为电子受体，分别添加终浓度为5 mmol/L灭菌的乙酸钠、葡萄糖、乳酸、丙酸钠、丙酮酸钠等作为不同的电子供体；
2) 从保存菌株SgZ-1的斜面挑取菌苔接种至TSB培养基中，于30℃，180 rpm摇床活化菌体18小时，使细菌数量达到指数生长期；
3) 4℃，6 000 rpm离心10 min，去上清液，富集培养基重新悬浮；
4) 重复上述操作2次，最终悬浮液的浓度达到OD600约1.0，加入1 ml 菌体悬浮液作为处理，同时设置不加菌的对照；
5) 每隔约2 d取4 mL培养液，采用紫外-可见分光光度计在450 nm处测定AHQDS含量，以AHQDS浓度为指标，验证菌株利用不同电子供体还原AQDS的能力。
试验结果如图3所示。从图3可知，菌株SgZ-1可以乙酸钠、葡萄糖、乳酸和丙酮酸钠为电子供体，还原AQDS；其中，以葡萄糖为底物时，还原效率最高。
将本发明的菌株SgZ-1与可以维持其活力的辅料混合在一起，即可以得到一种微生物制剂，该微生物制剂可以用于腐殖质的还原和硝酸盐的还原。
Claims (5)
1.一种腐殖质还原陶厄氏菌（Thauera humireducens）SgZ-1，其特征在于：所述菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2011497。
2.权利要求1所述腐殖质还原陶厄氏菌SgZ-1在腐殖质还原中的应用。
3.一种腐殖质还原微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂中含有权利要求1所述的陶厄氏菌SgZ-1。
4.权利要求1所述腐殖质还原陶厄氏菌SgZ-1在硝酸盐还原中的应用。
5.一种硝酸盐还原微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂中含有权利要求1所述的陶厄氏菌SgZ-1。
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