CN114591853B

CN114591853B - 一株兼具双酚a和氮去除的耐重金属好氧反硝化菌株及其应用

Info

Publication number: CN114591853B
Application number: CN202210173296.1A
Authority: CN
Inventors: 洪培; 高宇昕; 顾雅丽; 代月; 疏义林; 汪建中
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2022-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2042-02-24
Also published as: CN114591853A

Abstract

本发明提供一株好氧反硝化的施氏假单胞菌，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M20211101，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明提供的施氏假单胞菌株可同时实现脱氮和BPA去除的功能，使用方便，操作简单，降低了污水处理成本。该菌株可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。

Description

一株兼具双酚A和氮去除的耐重金属好氧反硝化菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株兼具双酚A和氮去除的耐重金属好氧反硝化菌株及其应用。

背景技术

水生生态系统的氮素污染导致了许多环境问题，包括水体酸化、富营养化、有毒藻类大量繁殖和对水生动物的直接毒性。目前，环境水体无机氮污染负荷过高，因此，迫切需要采取有效措施来消除无机氮污染。

常规的生物脱氮涉及好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，分别通过硝化菌群和反硝化菌群进行。由于不同菌群具有不同的溶解氧和有机碳需求，这两个过程始终在不同的反应器中或在一个具有不同时间顺序的反应器中分别运行，从而导致工艺操作复杂，运行能耗和成本高。

双酚A(BPA)是一种内分泌干扰化学品，用于食品接触材料的生产，年产量超过380万吨，在水体中广泛存在。BPA能够在动物身上表现出多方位的毒性作用，也可能对人类产生影响引发肝脏毒性、免疫毒性、致癌等。人类接触BPA会提高肥胖、糖尿病和心脏病的风险。大量的研究已用于去除BPA，如吸附、膜过滤、离子交换、高级氧化和混凝-絮凝，而微生物降解BPA与其他方法相比具有运行成本低、生态友好、适用性广等优点。由于对重金属的需求日益增长，重金属污染也备受关注。重金属大多是不能降解的有毒物质，因为其本身不具有任何的自然净化能力，所以一旦流入生态环境便难以消除。其中锌是生物反应所必需的金属，但它在高浓度下会引起皮肤刺激、贫血、恶心和胃痉挛等健康问题。锌也是严重污染水生动物的主要重金属之一。水中的游离锌离子对植物、无脊椎动物，脊椎鱼类都有严重的毒性。锌通常在纺织、木材、金属涂层、采矿、陶瓷、电池生产、药物、饲料、防晒霜和除臭剂等多个行业废水中检出，浓度高达234.1mg/L。这些高浓度的锌离子进入水生环境后，在生物体内的累积，对环境和公众健康构成严重威胁。在贻贝中锌的浓度高达到202.7-300.8mg/kg干重。锌的存在也会影响微生物除氮过程。10mg/L以上的锌离子浓度会抑制厌氧氨氧化。长期暴露会导致脱氮菌群活性和多样性下降。氧化锌会抑制关键反硝化酶的基因表达和催化活性。纳米氧化锌对氨氮、总氮的去除率和氧化亚氮的排放产生剂量依赖性的抑制作用，也会对微生物反硝化作用产生负面影响导致硝酸盐去除率降低和较高的氧化亚氮排放，加剧水体富营养化和全球变暖。因此，获得耐受高浓度锌离子的功能微生物对于水体生态修复具有重要的环境意义。

好氧反硝化技术提供了一种克服常规反硝化技术缺点的方法，因为它只需要一个单一的反应器进行硝化/反硝化，使用较少的化学品来调整系统的pH值，而且好氧反硝化菌在处理过程中很容易被控制。在好氧条件下将硝酸盐转化为氮气。常见的好氧反硝化菌剂强化应用虽然短期内就可以有效增加污水处理系统的脱氮效能，然而仍存在强化菌群流失严重，无法长期稳定地维持在系统中。微生物聚集是生物膜发育和维持的关键步骤，兼具高效成膜和反硝化能力的菌株强化可以实现功能菌驻留和高效脱氮。同时，生物聚合体的形成也为重金属吸附或聚集提供了附着位点。迄今为止，还没有关于兼具高效脱氮和BPA降解的重金属耐受好氧反硝化菌的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株兼具双酚A和氮去除的耐重金属好氧反硝化菌株及其应用，所述菌株具有耐受高浓度锌离子，兼具高效脱氮和BPA去除的性能。在处理复合污染废水中该菌株表现优异的性能，其制备方法和应用工艺操作简单，能耗和成本低。

本发明中，“C/N比”是碳氮比。C是指碳，carbon的简称；N是指氮，nitrogen的简称。碳氮比，是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比值。

本发明中，“培养物”是指将菌接种于任何合适的培养基进行制备的产物，培养基的类型可以根据不同的需求进行替换，也包括对常用培养基的成分优化。

本发明中，“制备物”指通过本发明菌株制备的产物，其制备方式可以是任何现有技术中的方式或者未来任何可能的方式，其特点在于通过本发明的菌株进行制备，制备方式可以多样。

本发明中，“富氮废水”指含有较多氮元素的废水，氮元素的形式包括但不限于硝氮、亚硝氮、氨氮。

一方面，本发明提供了一株施氏假单胞菌。

所述的施氏假单胞菌为施氏假单胞菌KY-37，保藏编号为CCTCC NO：M20211101，拉丁学名为Pseudomonas stutzeri KY-37，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。

所述的施氏假单胞菌菌落呈圆形，白色，湿润，表面光滑，菌体呈杆状(约0.1-0.2×1-2.0μm)。

所述的施氏假单胞菌16S rDNA基因的扩增产物为1375bp。

另一方面，本发明提供了一种施氏假单胞菌培养物。

所述的施氏假单胞菌培养物由前述的施氏假单胞菌接种于培养基制备。

所述的培养基可以是液体培养基、固体培养基或者半固体培养基。

所述的培养基的类型包括但不限于：LB培养基，营养肉汤培养基，营养琼脂培养基。

再一方面，本发明提供了一种菌剂。

所述的菌剂中包括前述的施氏假单胞菌和/或其制备物。

所述的制备物包括但不限于前述施氏假单胞菌培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物中的一种或多种。

又一方面，本发明提供了培养前述的施氏假单胞菌的方法。

所述的方法中包括：

S1、将权利要求1所述的施氏假单胞菌接种于培养基获得种子液；

S2、种子液扩大培养。

又一方面，本发明提供了前述的施氏假单胞菌在废水处理中的应用。

所述的施氏假单胞菌直接应用于废水处理，或者通过制备产品用于废水处理。

所述的制备产品为施氏假单胞菌KY 37的制备物。

所述的制备物包括但不限于：施氏假单胞菌KY 37的培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物中的一种或多种。

优选地，所述的制备物为施氏假单胞菌KY 37菌株的菌液。

优选地，所述施氏假单胞菌KY 37菌株菌液的接种量为0.1％-1％。

优选地，所述的废水处理方法需要好氧培养。

优选地，所述的废水为富氮废水。

进一步优选地，所述的富氮废水的pH值为5.0-9.0。

在一些实施例中，所述的废水中硝氮和/或亚硝氮和/或氨氮或总氮的浓度为50-100mg/L。

又一方面，本发明提供了一种废水处理剂。

所述的废水处理剂中包括前述的施氏假单胞菌和/或其制备物。

又一方面，本发明提供了一种废水处理的方法。

所述的方法中包括在废水中加入前述的施氏假单胞菌和/或其制备物。

优选地，所述的制备物为施氏假单胞菌KY 37菌株的菌液。

优选地，所述的废水处理方法需要好氧培养。

优选地，所述的废水为富氮废水。

进一步优选地，所述的富氮废水的pH值为5.0-9.0。

优选地，所述的方法中培养温度为25-40℃，培养时间为6-72h，C/N比为5-25。

本发明的有益效果：

本发明所提供的KY-37菌株具有好氧反硝化的功能，可直接将硝氮转化为气体产物，亚硝氮和氨氮氮积累量较少，以硝氮为唯一氮源时，12小时内去除率达到98.38％和4.5mg/L/h，显著高于已报道假单胞菌株LK618(91.4％，3.86mg/L/h；出自文献：Efficacyof inorganic nitrogen removal by a salt tolerant aerobic denitrifyingbacterium,Pseudomonas sihuiensis LK 618,Bioprocess and BiosystemsEngineering,2021,44(6):1227-1235.)。

KY-37菌株可耐受200mg/L高浓度的锌离子，同时可以降解10mg/L的BPA。

本发明提供的施氏假单胞菌株KY-37可同时实现脱氮和BPA去除的功能，使用方便，操作简单，降低了污水处理成本。该菌株KY-37可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。

保藏说明

保藏编号：CCTCC NO：M20211101；

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏机构简称：CCTCC；

保藏地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号；

保藏时间：2021年8月30日；

中文学名：施氏假单胞KY-37；

拉丁学名：Pseudomonas stutzeri KY-37。

附图说明

图1为施氏假单胞菌在扫描电子显微镜下的细胞形态。

图2为施氏假单胞菌株16S r DNA基因构建的系统发育树。

图3为施氏假单胞菌株KY-37氮通路相关基因的扩增图。

图4为好氧培养下，菌株KY-37以硝氮为唯一氮源时的生长及总氮、氨氮、硝氮和亚硝氮的变化图。

图5为好氧培养下，施氏假单胞菌株KY-37的胞外聚合物含量变化。

图6为好氧培养下，施氏假单胞菌株KY-37的自聚集指数变化。

图7为好氧培养下，不同锌离子浓度对施氏假单胞菌株KY-37硝氮去除率的影响。

图8为好氧培养下，BPA的降解浓度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中，所述富氮废水培养基成分如下：16.67g/L六水合丁二酸钠，1.5g/L磷酸二氢钾，5.27g/L磷酸氢二钠，0.361g/L硝酸钾，0.1g/L七水合硫酸镁。含有2mL/L亚铁离子，钴离子，铜离子，钼离子，锰离子，锌离子，硒离子的微量元素。

基础实验例菌株KY-37的筛选与分离

样品采集：取自合肥污水处理厂污泥。

菌株的富集培养与分离：取5g污泥加入100mL的富氮废水培养基中，置于30℃、120r/min摇床中培养1周。取10mL富集液涂布于富氮废水固体培养基(添加1％的溴百里香酚蓝和2％的琼脂粉)平板上，倒置于30℃恒温培养箱中培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取不同的单菌落进行分离纯化并编号。

菌株筛选：将分离纯化的菌种分别接种于富氮废水培养基中，于30℃、120r/min培养。24h后，测定硝氮浓度变化。筛选得到一株硝氮去除率最高的分离菌株KY-37。

实施例1菌株KY-37形态学和分子生物学鉴定

本发明施氏假单胞菌的菌落形态：菌落呈圆形，白色，湿润，表面光滑，菌体呈杆状(约0.1-0.2×1-2.0μm)。图1为施氏假单胞菌株在扫描电子显微镜下的细胞形态。

分子生物学鉴定：利用16S rDNA基因的扩增通用引物，以KY-37菌液作为模板进行PCR扩增，得到PCR产物共有1375bp(SEQ ID NO.1)；所述序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)的16S rDNA基因序列相似度为100％。图2为施氏假单胞菌株16S r DNA基因构建的系统发育树。

根据本发明所述KY-37菌株的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定KY-37菌株属于施氏假单胞菌，并命名施氏假单胞菌KY-37(Pseudomonas stutzeri KY-37)。

实施例2施氏假单胞菌KY-37的培养方法

将菌株KY-37接种于富氮废水培养基中，在25-35℃，120-200r/min恒温振荡培养，得到种子液。

实施例3KY-37氮通路相关基因的扩增

对KY-37中氮通路相关基因进行扩增，包括：nirS、norR、nosZ和napA基因，扩增引物分别为：

nirS(F:SEQ ID NO.2，R:SEQ ID NO.3)；

norR(F:SEQ ID NO.4，R:SEQ ID NO.5)；

nosZ(F:SEQ ID NO.6，R:SEQ ID NO.7)；

napA(F:SEQ ID NO.8，R:SEQ ID NO.9)；

扩增体系为25μL体系，其中包括：2×ES Taq Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1.0μL，模板0.5μL，double-distilled water 10μL；

扩增条件为：95℃预变性5min，然后进行35个循环：94℃，30s；退火1min(57℃，59℃，58℃，69℃)；72℃延伸10min。

扩增结果见图3，其中M为Marker。表明，菌株KY-37呈现完整的反硝化通路，成功扩增出周质硝酸盐硝酸盐还原酶基因、亚硝酸盐还原酶基因，一氧化氮还原酶基因，氧化亚氮还原酶基因。

实施例4菌株KY-37在富氮废水中的除氮及胞外聚合物产生情况

将菌株KY-37培养至对数期，按2％的接种量接种于富氮废水培养基中，在温度25℃，摇床转速120r/min，培养72小时，测定处理前后总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮的含量变化，同时设置一组培养基曝氧气后接种，同等条件下密封培养，抽取顶空气体，测定氧化亚氮和氮气的浓度，用于氮平衡分析。经过12小时的培养，废水中硝氮的去除率为98.38％，氨氮和亚硝氮的积累量少。培养24小时，总氮的去除率达到66％(见图4)。氮平衡分析显示大部分硝氮通过好氧反硝化作用直接转化为气体产物，氨氮和亚硝氮积累量较少。

在12h、24h、36h、48h、60h分别检测培养基中胞外聚合物(蛋白、多糖)的含量，结果表明胞外聚合物在36小时达到最大值(见图5)。表明菌株KY-37产生大量的胞外聚合物，自聚集指数达到65.8％(自聚集指数变化见图6)。

实施例5菌株KY-37对锌离子的耐受情况

将菌株KY-37培养至对数期，按2％的接种量接种至富氮废水培养基(分别加入20，40，60，80和200mg/L的锌离子)中，在温度25℃，摇床转速120r/min，培养72小时，测定处理前后硝氮的含量变化，200mg/L的锌离子浓度胁迫下，硝氮的去除率仍然高达76.4％(见图7)。

实施例6菌株KY-37对BPA的去除情况

将上述菌株KY-37培养至对数期，按2％的接种量接种至富氮废水培养基(BPA的浓度分别为1mg/L，5mg/L，10mg/L)中，在温度25℃，摇床转速120r/min，培养72小时，测定处理前后BPA的含量变化，培养48小时，初始浓度为10mg/L的BPA去除率达到88.2％(见图8)。

序列表

<110> 安徽师范大学

<120> 一株兼具双酚A和氮去除的耐重金属好氧反硝化菌株及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgctccat gattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg 60

gggacaacgt ttcgaaagga acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagtggggga 120

tcttcggacc tcacgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaaag 180

gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga 240

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 300

ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg 360

ggaggaaggg cagtaagtta ataccttgct gttttgacgt taccaacaga ataagcaccg 420

gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc aagcgttaat cggaattact 480

gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct 540

gggaactgca tccaaaactg gcgagctaga gtatggcaga gggtggtgga atttcctgtg 600

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aatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 720

cacgccgtaa acgatgtcga ctagccgttg ggatccttga gatcttagtg gcgcagctaa 780

cgcattaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg 840

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 900

aggccttgac atgcagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actctgacac 960

aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga 1020

gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg ttaaggtggg cactctaagg agactgccgg 1080

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct 1140

acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1200

ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc 1260

tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1320

gtcacaccat gggagtgggt tgctccagaa gtagctagtc taaccttcgg gggga 1375

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaacctcaag accactacca tc 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccttccagtt gtgctcctt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaaatgacc aagaacgagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctggaccat gggcttcaac ca 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgacgaccg gccagcgcag 20

Claims

1.一株好氧反硝化的施氏假单胞菌，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M20211101，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种施氏假单胞菌培养物，其特征在于，由权利要求1所述的施氏假单胞菌接种于培养基制备。

3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或其制备物；所述的制备物为活菌体制备物。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的制备物为培养物、冻干粉、发酵液中的一种或多种。

5.培养权利要求1所述的施氏假单胞菌的方法，其特征在于，包括：

S2、种子液扩大培养。

6.权利要求1所述的施氏假单胞菌在废水处理中的应用，其特征在于，所述的废水为包含硝氮的富氮废水。

7.一种废水处理剂，其特征在于，包括权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或其制备物；所述的制备物为活菌体制备物；所述的废水为包含硝氮的富氮废水。

8.一种废水处理的方法，其特征在于，包括在废水中加入权利要求1所述的施氏假单胞菌和/或其制备物进行好氧培养；其中，所述的制备物为活菌体制备物；所述的废水为包含硝氮的富氮废水。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的制备物为施氏假单胞菌的菌液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述施氏假单胞菌和/或其制备物的接种量为0.1％-1％。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的富氮废水的pH值为5.0-9.0。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的富氮废水中硝氮的浓度为50-100mg/L。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的方法为：培养温度为25-40℃，培养时间为6-72h，C/N比为5-25。