CN109401997A - 一株寡养单胞菌及其应用和微生物菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株寡养单胞菌，所述菌株为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)DB‑2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16355。DB‑2菌株经过短暂的适应期后能够在菌浓度较低的情况下快速降解硝酸盐氮，表明该菌株在产业化应用时微生物菌剂制备成本降低，而不影响污水处理效果；C/N比为4的情况下就能达到良好的脱氮效果，所用碳源少，节省污水脱氮处理的外加碳源成本；DB‑2菌株反硝化过程彻底，没有中间有害气体如NO、N₂O等产生，对环境污染小。

Description

一株寡养单胞菌及其应用和微生物菌剂

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，涉及一株寡养单胞菌及其应用和微生物菌剂。

背景技术

氮是不可缺少的生命元素之一，对人类生存和发展有着重要的影响，但近年来，随着工农业污染和水土流失加剧，氮素污染日益严重。不仅会造成水体富营养化，也可能对人体和动物产生危害。氮素的大量排放可通过硝化作用引起水体缺氧，使水体发黑发臭；会刺激水体中藻类过度繁殖而导致富营养化；氮素循环中除了分子态的氮气以外，所有氮循环中间产物的积累例如硝酸盐和亚硝酸盐均会对人类和环境产生严重的影响。

目前可以通过物理化学法和生物脱氮法来控制污水水体中的氮素含量。物理化学法脱氮技术适用范围广泛，对各种浓度的含氮废水都有相应的作用，但是一些传统的物理化学方法并不能保证稳定良好的污染物去除效果，还存在成本高、运行复杂、易产生二次污染等缺点。

相比之下，微生物处理是通过微生物群体的新陈代谢活动来去除水中的污染物，能去除传统工艺难以去除的污染物，且有利于后续工艺的进行。其中，原位投菌技术更是以其价格低廉、高效节能等优点已被广泛应用。生物脱氮技术较好的克服了物理化学法的缺点，具有工艺简单，成本较低，容易推广等优点，是目前污水脱氮处理中最经济、最有效的方法之一。该方法的核心是硝化反应和反硝化反应，由于参与反应的菌群不同和污水处理工艺参数不同，硝化和反硝化反应在两个隔离的反应器中进行，或者是在时间和空间上造成交替缺氧和好氧环境的同一反应器中进行。传统生物脱氮工艺也存在一些弊端：一是普通反硝化菌群增殖速度慢，很难维持高浓度进行脱氮，二是由于硝化作用过程产生酸度，使得污水pH值降低，因而对反硝化反应产生不利影响；三是工艺处理低C/N比污水时，需要投加大量含碳有机物保证脱氮效果，增加了成本；四是传统反硝化反应不彻底，其产生的中间产物NO、N₂O等气体长期积累加重温室效应对环境的破坏。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株寡养单胞菌及其应用，和由该寡养单胞菌制备的微生物菌剂。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一株寡养单胞菌，所述菌株为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)DB-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16355。

本发明的寡养单胞菌DB-2 16SrRNA基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的寡养单胞菌，菌落为圆形、边缘清晰，菌落颜色为白色，湿润，光亮，菌落背面无色素，菌落在平板上易挑取；是杆状、革兰氏阴性菌。

2.提供寡养单胞菌DB-2在污水处理中的应用。

进一步，所述应用为利用寡养单胞菌DB-2菌株脱去污水中的硝酸盐氮。

进一步，所述处理中寡养单胞菌的菌落数为8.0×10⁵-8.0×

10⁷cfu/ml。

3.含有寡养单胞菌DB-2的微生物菌剂，所述微生物菌剂的制备方法为：将菌株DB-2的种子液按0.5％-2％v/v接种至培养液中富集培养，发酵过程中向罐中通入无菌的空气，搅拌速度180-250rpm，发酵温度为28-35℃，发酵时间35-45h，收集培养液即寡养单胞菌DB-2的微生物菌剂。

进一步，所述微生物菌剂的制备方法为：将菌株DB-2的种子液按1％v/v接种至培养液中富集培养，发酵过程中向罐中通入无菌的空气，搅拌速度200rpm，发酵温度为30℃，发酵时间40h，收集培养液即寡养单胞菌DB-2的微生物菌剂。

本发明的有益效果在于：本发明经过高氮环境长期厌氧驯化，获得一株新型的寡养单胞菌DB-2菌株，通过16s rDNA测序，与NCBI数据库比对结果证明，这是一个新菌株，有更多的实用性。通过大量的实验证明DB-2菌株具有理想的降解总氮的性能，表现在：DB-2菌株经过短暂的适应期后能够在菌浓度较低的情况下快速降解硝酸盐氮，这表明该菌株在产业化应用时微生物菌剂制备成本降低，而不影响污水处理效果；其次转化硝酸盐时的C/N比更低，在的C/N比为4的情况下就能达到良好的脱氮效果，这样在产业化应用时所用碳源少，从而节省污水脱氮处理的外加碳源成本；而且氨态氮的存在不干扰DB-2菌株反硝化过程，因而该菌株适宜处理的污水的范围更广；DB-2菌株反硝化过程彻底，没有中间有害气体如NO、N₂O等产生，对环境污染小。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为菌株DB-2的16S rDNA序列比对分析结果；

图2为挑选菌株DB-2的平板菌落图。

生物材料保藏

本发明中的菌株DB-2，于2018年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.16355，分类命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

DB菌株分离用培养基：

1、液体反硝化培养基配方(g/L)：无水乙酸钠：2g；磷酸氢二钾：0.4g；硫酸镁：0.6g；氯化铁：0.5g；氯化钙：0.1g；磷酸氢二钾：0.2g；硝酸钠：1g；微量元素：2ml；pH＝7.0-7.2。

2、固体反硝化鉴别培养基(g/L)：1％BTB：10g；无水乙酸钠：2g；磷酸氢二钾：0.4g；硫酸镁：0.6g；氯化铁：0.5g；氯化钙：0.1g；磷酸氢二钾：0.2g；硝酸钠：1g；微量元素：2ml；pH＝7.0-7.2；琼脂：2％。

3、斜面保藏培养基配方(g/L)：牛肉膏：1g；蛋白胨：10g；氯化钠：5g；pH＝7.2-7.4；琼脂：2％；灭菌条件：121℃，30min。

实施例1菌株筛选

DB菌株分离过程：取某污水厂池塘底泥混合液1ml，接于液体反硝化培养基进行高氮环境长期厌氧驯化，接种于培养基后加石蜡封口，与空气隔绝保持厌氧环境，初期筛选试验为生长6-8天，后期的特性试验是种子培养液里驯化培养3-4天，生长至OD600＝1左右的量。驯化结束后，用无菌水进行10倍梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6涂布在固体反硝化鉴别培养基上，每个稀释度3个平行，直至平板上有清晰菌落，观察菌落大小及颜色，挑取菌落大且周边有蓝色晕圈的单菌落，如图2所示，其中圈出的即为本发明的11号菌株DB-2。接种于斜面培养基，4℃冰箱保藏，一共筛选到11株菌株，编号1-11。再将初筛得到的菌株分别接种液体反硝化培养基，静止培养3天，以5％的接种量接种至10ml灭菌后的液体培养液，室温条件下生长6天，进行实验结果的比较，如表1所示。可以看出，在初筛得到的11株菌株中，其中3号、8号和11号菌株完全转化，且其反硝化效果具有一致的水平。将这三株菌株进行鉴定，其中8号菌株(命名为DB-3)经鉴定为假单胞菌，其序列如SEQ ID No.3所示，为传统意义上的反硝化菌，以此菌株作为参照。

表1初筛菌株6天降解硝酸盐氮指标结果

将以上挑选的3号菌株命名DB-1，并于2018年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.16354，分类命名为丛毛单胞菌(Comamonas sp.)。

将以上挑选的11号菌株命名DB-2，并于2018年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.16355，分类命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。

实施例2

菌株DB-2的测序及分类鉴定：

提取16s rDNA进行PCR扩增：16s rDNA利用引物27F/1492R进行PCR扩增；PCR产物纯化：对单一条带PCR产物进行ExoSApP-IT纯化、对有非特异条的PCR产物进行切胶纯化；Sanger测序法，双向测序。DB-2双向测序拼接序列，序列如SEQ ID No.2所示，菌株DB-2的16S rDNA序列及比对分析结果如图1所示。由图1可知，DB-2与数据库里的Stenotrophomonas sp.有两个同源相似性是100％，但这两个100％的cover是99，所以仍然鉴定为新菌种并保藏且存活。

菌株DB-2通过生物学特性观察，进行形态鉴定，结果如下：

将DB-2划线接种于特异性固体培养基上，室温培养1-2天，即出现圆形、边缘清晰的寡养单胞菌菌落，菌落颜色为白色，湿润，光亮，菌落背面无色素，菌落在平板上易挑取；DB-2是杆状、革兰氏阴性菌。

实施例3

DB-2菌株转化硝酸盐的时间进程：

将DB-1、DB-2菌株与参照菌株DB-3同样条件5％接种量接种至液体反硝化培养基，每隔24小时取样检测培养液硝酸盐的含量，结果如表2所示，由表2可以看出在高浓度硝酸盐氮体系中，DB-2菌株与参照菌株DB-3都存在一个适应期，经过前两天适应期后，第三天DB-2开始展现出高效的反硝化性能，硝酸盐氮指标每天以50％速率降低，直到第五天体系内的硝酸盐氮全部降解完毕，参照菌株则体现出较慢的反硝化进程。

表2.DB-2及DB-3菌株6天内降解总氮曲线测定结果

实施例4

菌株DB-2转化培养液中菌数测定：将实施例3中培养3天的培养液进行平板活菌计数，经计算得到DB-2培养物中菌数为8.0×10⁶cfu/ml。

实施例5

DB-2脱氮特性的研究

①氨态氮对菌株DB-2脱氮的影响

在与1g/L硝酸钠等量的氨态氮(NH₄)₂SO₄存在的情况下，分别将菌株DB-1、DB-2和DB-3进行好氧振荡和厌氧静止培养，脱氮结果见表3。由结果可知DB-2为兼性菌，氨态氮的存在不影响其厌氧反硝化进程。

表3氨态氮对菌株反硝化指标的影响

②分别将菌株DB-2和DB-3在不同种类碳源环境下进行测试，利用实验数据见表4。由结果可知，DB-2菌株可以利用更多种类的碳源达到理想的降解效果。

表4不同种类碳源环境下菌株生长6天指标降解结果

③同种碳源不同C/N比环境下，DB-2和DB-3降解硝酸盐的数据见表5。由结果可知，DB-2可以在C/N为4就能达到理想的脱氮效果。

表5不同C/N环境下菌株生长6天指标降解结果

实施例6

DB-2菌剂的制备：将10ml培养三天的种子液接种至1L培养液中富集培养，作为发酵用种子液，接种至灭菌后的发酵罐中发酵，发酵控制温度为30℃，发酵过程中向罐中通入无菌的空气；搅拌速度200rpm，培养时间约40h，收集培养液即寡养单胞菌DB-2菌剂。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中原环保股份有限公司

<120> 一株寡养单胞菌及其应用和微生物菌剂

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1358

<212> DNA

<213> Comamonas sp.

<400> 1

gcgcacttcg gatgctgacg agtggcgaac gggtgagtaa tacatcggaa cgtgcctagt 60

agtgggggat aactactcga aagagtggct aataccgcat gagatctacg gatgaaagca 120

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caacgagcgc aacccttgcc attagttgct acgaaagggc actctaatgg gactgccggt 1080

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agtaatcgtg gatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac accccgcccg 1320

tcacaccatg ggaacgggtc tcgccagaag taggtaga 1358

<210> 2

<211> 1393

<212> DNA

<213> Stenotrophomonas sp.

<400> 2

tgcagtcgac ggtagcacag aggagcttgc tccttgggtg acgagtggcg gacgggtgag 60

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tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc agatcagcac tgctgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga 1380

agcaggtagc tta 1393

<210> 3

<211> 1391

<212> DNA

<213> Pseudomonas sp.

<400> 3

ccatgcagtc gagcggatga ggggtgcttg cactctgatt cagcggcgga cgggtgagta 60

atgcctaaga atctgcccga tagtggggga caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca 120

tacgtcctac gggagaaagt gggggatctt cggacctcac gctatcggat gagcctaggt 180

cggattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag 240

aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 300

gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc 360

ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggctgt cggctaatac cctgcagttt 420

tgacgttacc aacagaataa gcaccggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa 480

gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt tcagcaagtt 540

ggatgtgaaa gccccgggct caacctggga actgcatcca aaactactga gctagagtac 600

ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtatatatag gaaggaacac 660

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ccttgagaac ttagtagcga agctaacgcg ataagttgac cgcctgggga gtacggccgc 840

aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatgc tgagaacttt ccagagatgg 960

attggtgcct tcgggaactc agacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020

agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacgttat 1080

ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140

tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggttg 1200

ccaagccgcg aggtggagct aatctcacaa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca 1260

actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgtgaat cagaatgtca cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgct ccagaagtag 1380

ctagtctaac c 1391

Claims (8)

1.一株寡养单胞菌，其特征在于，所述菌株为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)DB-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16355。

2.根据权利要求1所述的寡养单胞菌，其特征在于，所述细菌16SrRNA基因序列如SEQID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的寡养单胞菌，其特征在于，所述菌株DB-2菌落颜色为白色，杆状，革兰氏阴性菌。

4.权利要求1所述的寡养单胞菌在污水处理中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其应用是用所述菌株脱去污水中的硝酸盐氮。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述处理中寡养单胞菌的菌落数为8.0×10⁵-8.0×10⁷cfu/ml。

7.含有权利要求1所述的寡养单胞菌的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法为：将菌株DB-2的种子液按0.5％-2％v/v接种至培养液中富集培养，发酵过程中向罐中通入无菌的空气，搅拌速度180-250rpm，发酵温度为28-35℃，发酵时间35-45h，收集培养液即寡养单胞菌DB-2的微生物菌剂。

8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法为：将菌株DB-2的种子液按1％v/v接种至培养液中富集培养，发酵过程中向罐中通入无菌的空气，搅拌速度200rpm，发酵温度为30℃，发酵时间40h，收集培养液即寡养单胞菌DB-2的微生物菌剂。