CN113337413A

CN113337413A - 一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌及其应用

Info

Publication number: CN113337413A
Application number: CN202010133399.6A
Authority: CN
Inventors: 黄津辉; 曾小英
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明公开了一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌及其应用，本发明涉及环境微生物及水处理技术领域。本发明要解决现有普通异养硝化细菌的硝化能力受到高盐度、强酸和强碱环境抑制，无法对废水中的氨氮进行有效去除的技术问题。该菌株命名为Stenotrophomonas sp.MSNA‑1。本发明通过筛选分离得到了一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌，其耐盐范围为0–15％，耐pH范围为3–10，对高盐度、强酸和强碱环境具有良好的耐受能力。该菌株在酸性的制药废水、腌制废水，碱性的石油化工废水、半导体废水等多种高盐废水的氨氮处理具有广阔的应用前景。

Description

一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物及水处理技术领域，具体涉及一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌及其应用。

背景技术

随着我国经济的发展，工业生产及农业活动导致含氮化合物的排放量逐渐增加，严重影响了地表水环境质量。地表水中主要的氮污染物是NH₄ ⁺-N，氨氮对水体的危害具体表现在对水生生物产生毒害作用、引起水体富营养化等。生物处理法因具有对环境负荷小，脱氮更彻底等优点而被广泛使用。目前生物氨氮去除方法有自养硝化和异养硝化两种。传统的自养硝化作用速率低、对环境要求苛刻、细菌生长速度较慢而限制氨氮去除效率的提升。近年来，异养硝化细菌的发现解决了这一问题，与自养硝化细菌相比，异养硝化细菌的生长速率更快，对环境的适应性更强，还能兼顾提高COD的去除率。因此，异养硝化细菌的重要性日益受到关注。

然而，盐度和pH波动是处理废水时常遇到的重要问题，低盐度或偏中性的 pH条件对硝化强度作用不明显。但是，当废水的含盐量过高(>1％)时，会破坏硝化细菌的生物膜和菌体内的酶活性，抑制细菌的生长，导致对氨氮的去除效果不理想，从而增加了高盐废水氨氮处理的难度。当废水的pH低于6或高于 9时，也会影响微生物的生长和氨氮去除效率。因此，为开拓异养硝化细菌在实际废水氨氮处理中的应用，分离出适应多种极端环境的异养反硝化细菌是一项极为迫切的任务，这将为高盐、极端pH环境等废水体的氨氮处理提供候选菌株及技术支持。

发明内容

本发明目的在于提供一株耐盐耐酸碱异养硝化菌株。

本发明另一目的在于提供上述耐盐耐酸碱异养硝化菌株在废水处理中的应用。解决现有普通异养硝化细菌的硝化能力受到高盐度、强酸和强碱环境抑制，无法对废水中的氨氮进行有效去除的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一株耐盐耐酸碱异养硝化菌，来源于天津大沽化工有限公司污水处理厂的活性剩余污泥，分别以氨氮为氮源，以葡萄糖为碳源进行生长繁殖，利用高盐(3％)寡营养培养基进行初筛，通过在异养硝化培养基上划线分离、纯化得到。

本发明公开的耐盐耐酸碱异养硝化菌株通过16S rDNA鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)命名为Stenotrophomonas sp.MSNA-1。

本发明公开的Stenotrophomonas sp.MSNA-1具有以下表型特征：在30℃下，营养琼脂培养基上培养24–72h后，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐，中央略凸起；菌体在扫描电镜下呈短杆状，大小为(0.4–0.6)×(0.9–1.3)μm。

本发明公开的Stenotrophomonas sp.MSNA-1 16S rDNA基因序列特征：如序列表中序列所示，序列长度为1484bp。

本发明公开的Stenotrophomonas sp.MSNA-1能够在盐度0％–15％、pH 3–10 范围内生长和去除氨氮，其中盐度优选3％，pH优选7.5。

本发明公开的Stenotrophomonas sp.MSNA-1对实际高盐化工废水(盐度： 3％，pH:7.5)中的氨氮和COD去除效果较好，去除率分别为51.1％和56.8％，初步探究了该菌株的应用潜力。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明筛选得到了一株寡养单胞菌，命名为Stenotrophomonas sp.MSNA-1。该菌株是一种异养硝化细菌，耐盐性强，其耐盐范围为0％–15％，可以在盐度 0％–10％的范围内对氨氮进行有效处理。同时该菌株具有很好的酸碱耐受性，能耐pH范围为5–11。本发明公开的Stenotrophomonas sp.MSNA-1能耐受高盐及强酸碱的极端环境，可用于酸性的制药废水、腌制废水，碱性的石油化工废水、半导体废水等多种高盐废水的氨氮处理，应用前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为耐盐耐酸碱寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.MSNA-1细胞的扫描电子显微镜(SEM)照片(比例尺为5μm)。

图2为耐盐耐酸碱寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.MSNA-1在高盐度(盐度：3％)条件下的生长曲线图。

图3为耐盐耐酸碱寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.MSNA-1在高盐度(盐度：3％)条件下对氨氮和COD的降解曲线图。

图4为耐盐耐酸碱寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.MSNA-1在不同盐度下的OD₆₀₀及对氨氮的去除率图。

图5为耐盐耐酸碱寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.MSNA-1在不同pH下的OD₆₀₀及对氨氮的去除率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下所列举的具体实施方式。

实施例中NH₄ ⁺-N和COD监测分析方法参考哈希水质分析法中的方法8000 和方法10031由哈希多参数水质分析仪(DR3900)测定。pH通过便捷式多功能水质分析仪(MYRONLULTRAMETER ⅢTM 9P 9302034,USA)测定。OD₆₀₀通过分光光度计(UV5100B)测定。

实施例1

耐盐耐酸碱异养硝化菌株的筛选

具体步骤如下：

1)配制异养硝化细菌富集用培养基：酵母膏0.5g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化钠30g/L、葡萄糖0.5g/L、淀粉0.5g/L、丙酮酸钠0.3g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.05g/L，用去离子水溶解，调pH为7，于121℃下蒸汽灭菌30min。

2)取10mL高盐活性剩余污泥(天津大沽化工化工有限公司污水处理厂)接种于装有100mL上述液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃、140r/min摇床培养5天，共进行三代培养富集得到混合菌液。

3)配制异养硝化细菌分离用培养基HNM：硫酸铵0.94g/L、葡萄糖5g/L、氯化钠30g/L、磷酸氢二钾1.8g/L、磷酸二氢钠0.25g/L、七水硫酸镁0.25g/L、琼脂粉15g/L，用去离子水溶解，调pH为7，于121℃下蒸汽灭菌30min。

4)将富集得到的混合菌液接种到上述异养硝化细菌分离用培养基HNM中，采用稀释涂布平板的方法，从中分离单菌株。将完成涂布的平板置于30℃恒温培养箱中静置培养3～4天，挑取单菌落，平板划线2～3次，得到纯化后的单菌落，测定每个菌株在3％盐度下的硝化性能，挑选性能最优的菌株MSNA-1 斜面保种，送于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

5)MSNA-1菌体形态观察：扫描电子显微镜(SEM)观察(QUANTA 200, USA)。

6)MSNA-1菌株鉴定：16S rDNA基因序列测定。

由此分离出一株异养硝化菌株，根据其形态特征及其基因序列在Genbank 中的检索结果，鉴定该菌株属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，该菌体形态如图1所示，呈短杆状，大小约为(0.4–0.6)×(0.9–1.3)μm。

实施例2

Stenotrophomonas sp.MSNA-1在高盐(盐度:3％，以NaCl计)条件下的生长及异养硝化特性

具体实施步骤如下：

将上述异养硝化细菌菌株MSNA-1接种到装有100mL液体硝化HNM培养基(不加琼脂粉)的250mL锥形瓶中，置于30℃、140r/min摇床中培养，以未接菌的空白培养基作空白对照。接菌后按0h，24h，48h，72h，96h和120 h取少量菌液，其中一部分样品用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，以时间为横坐标， OD₆₀₀值为纵坐标绘制反硝化细菌的生长曲线，观察菌株的生长周期。其余部分菌液经10 000rpm离心2min后，取上清液测氨氮和COD浓度。根据公式(1)计算氨氮和COD降解率。

降解率(％)＝((C₀-C_t)/C₀)×100％ (1)

其中C₀代表初始浓度，C_t代表某时间(t)时的浓度。

菌株MSNA-1的成长曲线图如图2所示，菌株在3％的高盐条件下生长良好，在0–72h内，菌株处于对数生长期，随后在72–120h内菌株处于稳定生长期。菌株MSNA-1对氨氮和COD的去除结果如图3所示，菌株在3％的高盐条件能利用氨氮和葡萄糖，对氨氮和COD有较好的去除效果，培养120h后最终菌株对氨氮的去除率达到67.3％，同时对COD的降解率达到73.5％。因此，该菌株在高盐条件下有效实现了氨氮的去除，同时对COD有很好的降解效果，进一步验证了菌株MSNA-1的异养硝化性能。

实施例3

Stenotrophomonas sp.MSNA-1在不同盐度下的氨氮去除实验

具体实施步骤如下：

将菌株Stenotrophomonas sp.MSNA-1接种于盐度(以NaCl计)为3％的硝化HNM培养基中，于30℃、140r/min的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后，取30mL菌液接入到新鲜的盐度(以NaCl计)为0％、3％、5％、 7％、10％、15％和20％的硝化HNM培养基中，初始pH设为7，于30℃、140r/min 的摇床中进行振荡培养。未接种菌液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。接菌后于0h和96h取少量菌液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10 000rpm下离心2min，取上清液测定氨氮浓度。

结果如图4所示，该菌株在盐度0–15％范围内，均可生长且有效去除氨氮，其中在盐度为3％时其生长情况及对氨氮的去除性能最好，此时OD₆₀₀为1.333，氨氮的去除率达到63.3％。即使在10％的盐度条件下，对氨氮也能达到46.3％去除率。由此可见，该菌株为对高盐度具有良好的耐受能力，能耐受的盐度范围较宽，同时有效实现氨氮的去除。

实施例4

Stenotrophomonas sp.MSNA-1在不同初始pH条件下的氨氮去除实验

具体实施步骤如下：

将菌株Stenotrophomonas sp.MSNA-1接种于盐度(以NaCl计)为3％、pH 为7的硝化HNM培养基中，于30℃、140r/min的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后，取30mL菌液接入到新鲜的pH已调为2、3、4、6、7.5、 9、10和11的硝化HNM培养基中，初始盐度设为3％，于30℃、140r/min的摇床中进行振荡培养。未接种菌液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。接菌后于0h和96h取少量菌液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10 000rpm下离心2min，取上清液测定氨氮浓度。

结果如图5所示，Stenotrophomonas sp.MSNA-1在3–10pH范围内，均可生长且有效去除氨氮，其中在pH为7.5和9时，菌株的生长情况及对氨氮的去除性能较好，最终OD₆₀₀分别为1.293和0.816，氨氮的去除率分别达到61.2％和61.5％，综合考虑，该菌株耐受的最优pH为7.5。本实验表明了 Stenotrophomonas sp.MSNA-1对酸性和碱性环境具有良好的耐受能力。

实施例5

菌株对实际高盐化工废水的氨氮去除实验

以天津大沽化工有限公司产生的高盐化工废水为例，经测得该废水原始盐度约为3％，pH为9。将菌株Stenotrophomonas sp.MSNA-1按照10％的接种量接种到该废水中，其中以不接菌的废水作为空白对照。30℃、140r/min的摇床培养120h，接菌后按0h和120h取少量样品，在10 000rpm下离心2min，取上清液测定氨氮浓度和COD浓度。

具体结果见下表1所示。

表1.接菌与未接菌对废水的处理情况

由表1结果所示，该菌株Stenotrophomonas sp.MSNA-1对实际高盐化工废水的处理效果优异，对其中的氨氮去除率可达到51.1％，同时对废水中的COD也有较好的降解效果，降解率达到56.8％，由此可见，菌株MSD4具有很好的应用潜力。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌及其应用

<141> 2020-02-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1484

<212> DNA

<213> 寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)

<400> 1

tggctcagag tgaacgctgg cggtaggcct aacacatgca agtcgaacgg cagcacagga 60

gagcttgctc tctgggtggc gagtggcgga cgggtgagga atacatcgga atctactttt 120

tcgtggggga taacgtaggg aaacttacgc taataccgca tacgacctac gggtgaaagc 180

aggggatctt cggaccttgc gcgattgaat gagccgatgt cggattagct agttggcggg 240

gtaaaggccc accaaggcga cgatccgtag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 300

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gcaagcctga tccagccata ccgcgtgggt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagcccttt 420

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Claims

1.一株耐盐耐酸碱异养硝化细菌，其特征在于：所述细菌为寡养单胞菌，分类命名为Stenotrophomonas sp.MSNA-1。

2.根据权利要求1所述的异养硝化细菌，其特征在于：所述寡养单胞菌菌株的基因序列长度为1484bp。

3.根据权利要求1所述的异养硝化细菌，其特征在于：在营养琼脂培养基上30℃培养24–72h后，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐，中央略凸起；菌体在扫描电镜下呈短杆状，大小为(0.4–0.6)×(0.9–1.3)μm。

4.一种如权利要求1所述的耐盐耐酸碱异养硝化细菌在高盐废水处理中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述异养硝化细菌对高盐废水进行异养硝化作用。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述异养硝化细菌菌株耐盐度为0％–15％。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述异养硝化细菌菌株耐盐度为3％。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述异养硝化细菌菌株耐pH为3–10。

9.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述异养硝化细菌菌株耐pH为为7.5。

10.根据权利要求4所述应用，其特征在于：应用于酸性的制药废水、腌制废水，碱性的石油化工废水或半导体废水的氨氮处理。