CN114395505A - 一种低温反硝化菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低温反硝化菌及其应用，所述菌株分类命名为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)FXH‑5，已于2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.23935。所述低温反硝化菌在农药废水处理中的应用，首先根据农药废水的特性在进水前进行pH及污染物浓度调节和溶解氧浓度调节，使进水负荷符合微生物降解的要求，然后加入菌株FXH‑5，在15℃以下的条件下进行反硝化工艺。对于冬季水体低温条件下反硝化去除硝酸盐氮和TN的降低有良好的应用前景。

Description

一种低温反硝化菌及其应用
技术领域
本发明的目的是探究低温反硝化菌的发酵工艺运行的最优条件，解决低温反硝化菌发酵过程中出现的问题，并成功发酵低温反硝化菌。
背景技术
氮素在水体中的过度积累造成了水体富营养化现象，严重危害生态系统安全。一般采用生物法进行废水脱氮。硝化反硝化工艺是应用最普遍的生物脱氮工艺。其中，反硝化效率的高低是废水生物脱氮效果优劣的关键。微生物反硝化是一系列酶催化下的脱氮反应，受多种因素的影响，包括废水的温度、溶解氧、pH值、外部碳源、微量元素等，其中，溶解氧、pH值等都可以通过工艺调节，使其达到反硝化的适宜条件。而水的比热容很高，温度对微生物反硝化的影响很难消除。有研究发现，在不提高水温的情况下，仅改变其他操作参数，在一定时间内系统的脱氮性能并没有显著提高，该研究甚至得出结论认为低温下反硝化过程受到抑制虽然可能存在其他因素，但主要还是受温度限制。
生物反应对环境条件敏感，容易受温度变化影响，温度是影响细菌生长和代谢的重要环境条件。绝大多数微生物正常生长温度为20～35℃。温度主要是通过影响微生物细胞内某些酶的活性而影响微生物的生长和代谢速率，进而影响污泥产率、污染物的去除效率和速率；温度还会影响污染物降解途径、中间产物的形成以及各种物质在溶液中的溶解度，以及有可能影响到产气量和成分等。低温减弱了微生物体内细胞质的流动性，进而影响了物质传输等代谢过程，并且普遍认为低温将会导致活性污泥的吸附性能和沉降性能下降，以及使微生物群落发生变化。低温对微生物活性的抑制，不同于高温带来的毁灭性影响，其抑制作用通常是可恢复的。在一定温度范围内，温度每降低10℃，微生物活性将降低1倍，从而降低了对污水的处理效果。工艺投入运行后，由于四季的交替和所处的地理位置影响，若不加以人工调控，温度很难保持适宜。而温度调控则会耗费大量的能源。解决这一难题的最佳途径就是开发高效稳定的低温生物处理工艺。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种低温反硝化菌，以及其在废水脱氮中的应用。该菌株可有效应对低温反硝化菌发酵过程中出现的各种效率下降现象，具有节约成本，简单易操作的等特点，解决低温反硝化菌发酵过程中的问题。本发明根据国内市场需求，自主开发研制一种低温反硝化菌的发酵工艺。
本发明所采用的技术方案为：
一种低温反硝化菌，其分类命名为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)FXH-5，已于2021年11月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23935。
所述低温反硝化菌在废水脱氮中的应用。
将施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)FXH-5进行菌株培养后，加入到10-15℃废水中脱氮。
施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)FXH-5进行菌株培养，包括活化、转接、扩培步骤，具体如下：
1)活化：从固体平板中挑取低温反硝化菌的单菌落，转接至LB液体培养基中，摇床转速为130-160rpm，35-38℃摇床培养3-4h直至对数期；
2)转接：将处在对数期的低温反硝化菌液按照4-7％的接入量转接至种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在10-15℃、转速保持在220-250rpm，溶氧DO控制在4-6mg/L，培养24-48h；
3)扩培：将种子罐培养的菌液按照2％-5％的接种量转接至发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度13-16℃、转速230-260rpm，溶氧7-10mg/L、发酵时间48-60h。
所述的LB液体培养基组分：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH保持在7.2-7.5之间。
种子罐的培养基成分为：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，硝酸钾1.5303g/L、葡萄糖3.6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，碳酸钙2g，微量元素溶液1mL/L(每毫升微量元素溶液中包含氯化锌80mg，无水硫酸铜20mg，硼酸20mg，七水硫酸亚铁100mg)、水1000mL，pH7-7.5。
菌株经过培养后菌液有效活菌数可达109个/ml以上，发酵培养液出罐后包装即可得到高效低温反硝化菌剂。
所述低温反硝化菌在农药废水处理中的应用，首先根据农药废水的特性在进水前进行pH及污染物浓度调节和溶解氧浓度调节，使进水负荷符合微生物降解的要求(COD浓度为2500mg/L-3500mg/L，pH值为7-7.5，溶氧7-10mg/L)。其次使用实验室筛选的低温反硝化菌株FXH-5，在温度控制在15℃以下的条件下进行反硝化工艺。
微生物FXH-5的投加量为1％-10％。
所述的微生物脱氮工艺中使用的高效低温反硝化菌种FXH-5(Pseudomonasstutzeri)，本实验室通过从泰州某河底泥中，在低温条件下使用高氮污染物筛选、并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23935)。该微生物使用普通培养基扩培，接种浓度为5％。微生物反硝化工艺中的停留时间为48h-36h。
本发明施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)FXH-5菌株是从泰州某河底泥中筛选得到的，具体筛选方法如下：
使用：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L作为富集培养基，添加从泰州某河取的河泥10mL，2d后，抽取1mL放进新配置的富集培养基，如此重复2个周期。将初筛得到的菌落接种至反硝化培养基中(硝酸钾1.530 3g/L、葡萄糖3.6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，碳酸钙2g，微量元素溶液1mL/L(氯化锌80mg，无水硫酸铜20mg，硼酸20mg，七水硫酸亚铁100mg)、水1000mL，pH7-7.5))培养，每隔12h测定NH4 +-N、NO3 --N、总氮含量。根据NH4 +-N、NO3 --N、总氮指标的去除效果，经复筛得到1株具有较高脱氮性能的菌株，命名为FXH-5。
所述菌株是杆状，有荚膜，无芽孢，革兰氏阴性，异氧，严格好氧，硝酸盐还原试验阳性。
菌株的培养条件是：取1mL菌液、均匀涂布于好氧反硝化培养基(牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，硝酸钾1.530 3g/L、葡萄糖3.6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，碳酸钙2g，微量元素溶液1mL/L(氯化锌80mg，无水硫酸铜20mg，硼酸20mg，七水硫酸亚铁100mg)、水1000mL，pH7-7.5)上，将培养基放在恒温培养箱中培养，培养温度为10～15℃，培养时间为48h。
所述菌株在农药废水低温脱氮中的应用。
该菌株能在温度15℃以下的废水生长，倍增周期为36h。
本发明工艺的反应机理如下：
微生物低温脱氮机理：
本发明中筛选出的低温反硝化菌FXH-5细胞体积普遍比一般脱氮细菌小，其细胞膜渗透性低，因此其无效离子循环量及其耗费的能量会更低，从而提供其适应极端环境的优势。
有益效果：
1.本发明反硝化细菌经过一系列酶的作用将硝酸盐氮转化为气态氮，实现了反硝化作用在好氧环境中进行，为同步硝化反硝化工艺奠定了基础。
2.菌株FXH-5有着良好的耐低温高效脱氮性，适用弱碱性生活污水的脱氮处理，可以作为冬季污水处理厂低温反硝化脱氮的优良备选菌株，在15℃条件下，12h氨氮去除率可达90％以上，硝态氮去除率可达50％以上，总氮去除率可达60％以上，48h氨氮去除率可达96％以上，硝态氮去除率可达80％以上，总氮去除率可达85％以上,对于冬季水体低温条件下反硝化去除硝酸盐氮和TN的降低有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明工艺的工艺流程框图。
具体实施方式
本实验中的农药废水来源于江苏盐城某农药厂生产废水，主要污染物为含氮杂环及芳香类化合物。添加的活性污泥为该厂污水处理设施中二沉池的剩余污泥。污泥获取后置于4度冰箱中低温保藏，需要使用时取出，用LB培养基活化后进行实验。
以下实施例中总氮测定方法为：紫外分光光度法；氨氮的测定方法为：纳氏试剂光度法；硝态氮的测定方法为：紫外分光光度法。
实施例1低温反硝化菌株FXH-5的获得
所述菌株是从泰州某河底泥中筛选得到的，具体筛选方法如下：
使用0.5g/L硝酸钠溶液，1g氯化钠作为筛选培养基，添加从泰州某河取的河泥50mL。30d后，硝酸钠降解至0.1g/L。取上清，在无菌环境下接种至牛肉膏蛋白胨液体培养(牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L、水1000mL、pH7.4-7.6)基中培养，使菌液浓度达到1*108个/mL。
所述菌株是杆状，有荚膜，无芽孢，革兰氏阴性，异氧，严格好氧，硝酸盐还原试验阳性。
菌株的培养条件是：取0.1mL菌液、均匀涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平面培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L、琼脂15-20g/L、水1000mL、pH7.4-7.6)上，将培养基放在恒温培养箱中培养，培养温度为15℃，培养时间为24h。
该菌株能在温度15℃以下的废水生长，倍增周期为36h，有效活菌数可达109个/ml以上。
实施例2：反硝化菌种FXH-5在处理农药废水中的应用
使用20％液碱调节农药废水pH至7，用厂区低浓度污水稀释，调节进水温度15℃，硝态氮浓度0.35g/L，氨氮浓度0.15g/L，总氮浓度0.5g/L。将调节后污水加入生物曝气反应器，溶氧保持在8mg/L以上，投加5％本发明筛选的高效降解菌，微生物反硝化停留时间12h。
废水进水温度：15℃；
废水进水硝态氮浓度 0.350g/L；
废水进水氨氮浓度 0.150g/L；
废水进水总氮浓度 0.500g/L；
高效低温反硝化菌种FXH-5投加量：5％；
微生物反硝化停留时间：12h；
生物反硝化后硝态氮浓度：0.155g/L；
生物反硝化后氨氮浓度：0.010g/L；
生物反硝化后总氮浓度：0.180g/L。
实施例3：反硝化菌种FXH-5在处理农药废水中的应用
使用20％液碱调节农药废水pH至7，用厂区低浓度污水稀释，调节进水温度20℃，硝态氮浓度0.35g/L，氨氮浓度0.15g/L，总氮浓度0.5g/L。将调节后污水加入生物曝气反应器，溶氧保持在8mg/L以上，投加5％本发明筛选的高效降解菌，微生物反硝化停留时间24h。
废水进水温度：20℃；
废水进水硝态氮浓度0.350g/L；
废水进水氨氮浓度0.150g/L；
废水进水总氮浓度0.500g/L；
高效低温反硝化菌种FXH-5投加量：5％；
微生物反硝化停留时间：24h；
生物反硝化后硝态氮浓度：0.035g/L；
生物反硝化后氨氮浓度：0.002g/L；
生物反硝化后总氮浓度：0.040g/L。
实施例4：反硝化菌种FXH-5在处理农药废水中的应用
使用20％液碱调节农药废水pH至7，用厂区低浓度污水稀释，调节进水温度15℃，硝态氮浓度0.35g/L，氨氮浓度0.15g/L，总氮浓度0.5g/L。将调节后污水加入生物曝气反应器，溶氧保持在8mg/L以上，投加5％本发明筛选的高效降解菌，微生物反硝化停留时间48h。
废水进水温度：15℃；
废水进水硝态氮浓度 0.350g/L；
废水进水氨氮浓度 0.150g/L；
废水进水总氮浓度 0.500g/L；
高效低温反硝化菌种FXH-5投加量：5％；
微生物反硝化停留时间：48h；
生物反硝化后硝态氮浓度：0.060g/L；
生物反硝化后氨氮浓度：0.006g/L；
生物反硝化后总氮浓度：0.070g/L。
对比例1：
使用20％液碱调节农药废水pH至7，用厂区低浓度污水稀释，调节进水温度15℃，硝态氮浓度0.35g/L，氨氮浓度0.15g/L，总氮浓度0.5g/L。将调节后污水加入生物曝气反应器，溶氧保持在8mg/L以上，不使用本发明筛选的高效降解菌，而使用农药厂普通活性污泥进行微生物反硝化反应。
废水进水温度：15℃；
废水进水硝态氮浓度0.350g/L；
废水进水氨氮浓度0.150g/L；
废水进水总氮浓度0.500g/L；
微生物反硝化停留时间：48h；
生物反硝化后硝态氮浓度：0.320g/L；
生物反硝化后氨氮浓度：0.002g/L；
生物反硝化后总氮浓度：0.40g/L。

Claims (8)

1.一种低温反硝化菌，其分类命名为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)FXH-5，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 23935。
2.权利要求1所述低温反硝化菌在废水脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)FXH-5进行菌株培养后，加入到10-15℃废水中脱氮。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)FXH-5进行菌株培养包括活化、转接、扩培步骤，
活化：从固体平板中挑取低温反硝化菌的单菌落，转接至LB液体培养基中，摇床转速为130-160 rpm，35-38℃摇床培养3-4 h直至对数期；
转接：将处在对数期的低温反硝化菌液转接至种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在10-15℃、转速保持在220-250 rpm，溶氧DO控制在4-6 mg/L，培养24h-48h；
扩培：将种子罐培养的低温反硝化菌液按照2%-5%的接种量转接至发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度13-16℃、转速230-260rpm，溶氧7-10 mg/L、发酵时间48-60h。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的LB液体培养基组分：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH保持在7.2-7.5之间。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：种子罐的培养基成分为：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，硝酸钾3g/L、葡萄糖3.6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，碳酸钙2g，微量元素溶液1mL/L、水1000mL，pH7-7.5。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：菌株经过培养后菌液有效活菌数可达109个/ml以上，发酵培养液出罐后包装即可得到高效低温反硝化菌剂。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述1mL微量元素溶液中包含氯化锌80mg，无水硫酸铜20mg，硼酸20mg，七水硫酸亚铁100mg。
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