CN110499270A - 一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用，该菌株命名为假单胞菌HK13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019611，保藏日期为2019年08月07日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。本发明提供的菌株HK13在最优生长条件下，12h对总氮的去除率达92.62％，平均脱氮速率为8.26mg(L·h)^‑1，脱氮速度快速有效。该菌株适应的pH范围为6.5～10，在pH＝10的强碱环境中，该菌株16h对总氧化氮的去除率达98％以上，表明该菌具有耐碱特性，可以用于处理含有硝酸盐的碱性废水。本发明的菌株对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很强的耐受性，适用于含有较高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水，在污水处理领域有广泛的应用前景。

Description

一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，尤其是涉及一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用。

背景技术

随着工农业的猛速发展，未经过处理的含氮废水，大量排放入江河湖泊，造成越来越严重的水体富营养化等问题，危害到了农业、渔业、旅游业等许多行业，对饮水卫生和食品安全也构成了巨大的威胁。随着国家对环境保护的日益重视，废水的总氮排放标准日益严苛，但是，污水二级处理后的排放水含氮量依然很高，导致很多行业不能达标排放，而二级生化处理后出水中的硝态氮是氮的主要存在形式之一，因此，探求能够有效去除废水中硝酸盐的方法迫在眉睫。

生物脱氮以其成本低、能耗小、处理效果好、不产生二次污染等优点成为主流脱氮技术，其通过硝化和反硝化细菌将废水中的氮素逐渐还原成氮气从而实现水体净化。近年来，国内外学者在脱氮微生物菌株的筛选和培育方面非常的活跃，肖晶晶等(肖晶晶,郭萍,霍炜洁,等.反硝化微生物在污水脱氮中的研究及应用进展[J].环境科学与技术,2009,32(12):97-102.)认为反硝化细菌大约有50多个属，130多个种，最常见的反硝化细菌有假单胞菌属、芽孢杆菌、不动杆菌，自从1886年人类首次分离到反硝化细菌以来，又陆续发现了丙酸杆菌属(Propionibacterium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、螺旋菌属(Spirillum)等兼氧反硝化细菌。

路俊玲等人分离出1株低温反硝化菌(路俊玲等.低温反硝化菌—施氏假单胞菌N3的筛选及脱氮性能[J].环境科学,2018,39(12):5612-5619.)，命名为施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri N3，该菌在4℃条件下，36h内可去除15mg/L的硝酸盐，但在30℃等最佳生长条件下，平均脱氮仅为1.87mg/(L.h)^-1，当硝酸盐浓度为100mg/L时，48h的脱氮率仅为80％，脱氮速率及对硝酸盐的耐受性均较低，实际应用上受到一定限制。

Lei Yang等人筛选出一株高效反硝化菌(Lei Yang,Nitrogen removalcharacteristics of a heterotrophic nitrifier Acinetobacter junii YB and itspotential application for the treatment of high-strength nitrogenouswastewater[J].Bioresource Technology,2015,193.)，菌属为不动杆菌Acinetobactersp.，命名为junii YB，当以硝酸盐作为唯一氮源，且初始浓度为100mg/L，在最佳条件生长条件下24h总氮的去除率达到88.88％，最大脱氮速率为7.98mg/(L.h)^-1。但需保持C/N为33，需投加大量碳源，导致污水处理厂的运行成本较大，实际应用价值不高。

Fei Huang等人筛选出一株同步硝化反硝化细菌(Fei Huang,Characterizationof novel Bacillus strain N31 from mariculture water capable of halophilicheterotrophic nitrification–aerobic denitrification[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,2017.)，命名为芽孢杆菌Bacillus sp.N31，当初始氮约为20mg/L时，经过48小时的培养，N31对亚硝酸盐和硝酸盐的去除效率分别为89.3％和89.4％，相应的最大去除率分别为0.73和0.59mg/(L.h)^-1。同样脱氮速率较低，且对硝酸盐的耐受性不高，仅为20mg/L。

综合来看，大多数报道的反硝化细菌都存在硝酸盐的耐受力不高或脱氮效率不高等问题，在实际应用上受到一定制约。因此筛选具有高效脱氮能力的反硝化细菌，后经过化学固定用于处理实际废水，对于控制氮素污染有着极大的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用。

本发明提供的嗜碱兼氧反硝化细菌，脱氮能力高，可以用于处理含高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一株嗜碱兼氧反硝化细菌，该菌株命名为假单胞菌HK13，分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2019611，保藏日期为2019年08月07日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。

本发明还提供了所述嗜碱兼氧反硝化细菌HK13的获得方式：从湖北某煤气化废水处理的缺氧池中采集活性污泥样品，利用反硝化培养基反复富集驯化后，经系列稀释，均匀涂布于BTB平板上，倒置于厌氧罐中，于30℃培养箱中静置培养。反复分离纯化后挑取蓝色单菌落，进行硝酸盐还原产气实验，并加入二苯胺和格里斯显色试剂，挑选出产气多，产气快，反硝化彻底的菌株。提取菌株DNA，经PCR扩增并电脉检测后进行基因测序，测序结果为测得长度为1379bp的序列，如序列表SEQ ID NO：1所示，GenBank登录号为(MN294682)，经16SrRNA基因比对，与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)PaKu14相似度最高，同源性为100％，命名为HK13。

本发明所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株划线于LB平板上，培养2d后，菌落呈圆形，浅黄色，边缘不整齐，中凸，不光滑，表面磨砂，油镜下观察所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株为短棒状，革兰氏染色阴性，扫描电子显微镜观察，所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株呈直棒状，大小为(0.6～0.9)μm×(1.5～3.5)μm。

本发明所述嗜碱兼氧反硝化细菌能够利用包括乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠在内的多种碳源，其中柠檬酸钠为最适碳源，最适pH范围为7.0～10，最适温度为30～40℃，最佳C/N为8，最适转速为100rpm，在最适生长条件下，所述嗜碱兼氧反硝化细菌16h的脱氮率达98％以上。

本发明还提供所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用。

本发明中的脱氮是指水体中无机氮的去除，总氧化氮等于硝态氮与亚硝态氮的和，即NO_x ^--N＝NO₂ ^--N+NO₂ ^--N。

所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的脱氮条件为：碳氮比≥8，温度为20～40℃，pH为6.5～10，溶解氧为微溶氧条件。

所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的脱氮条件优选为：碳氮比为8，温度为35℃，pH为7～10，pH进一步优选为8，溶解氧为微溶氧条件。

其中微溶氧条件是指对废水进行搅拌，转速为100rpm。

所述嗜碱兼氧反硝化细菌尤其适用于针对含高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水进行处理。

高浓度硝酸盐指NO₃ ^--N浓度可达到500mg/L的废水，本发明实施例中提供了NO₃ ^--N浓度控制为450mg/L情况下，菌株HK13能够耐受。

高浓度亚硝酸盐指NO₂ ^--N浓度可达到250mg/L的废水，本发明实施例中提供了NO₂ ^--N浓度控制为211.35mg/L情况下，菌株HK13能够耐受。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明菌株对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很强脱氮能力，尤其对硝酸盐氮，该菌株的反硝化能力非常高，平均脱氮速率为8.26mg·(L·h)^-1，最高反硝化速率可达20.03mg(L·h)^-1，是一般反硝化菌的1.46～4.45倍，脱氮速度快速有效。

(2)本发明菌株对硝酸盐氮的耐受性很高，在初始硝态氮为455.03mg/L的条件下，菌株HK13在48h脱氮率达到92.75％，平均反硝化速率为8.79mg·(L·h)^-1，培养到56h，TN降至10.6mg/L，去除率达97.68％，亚硝酸盐在24h积累量达到最大211.35mg/L，随后逐渐被完全去除，表明该菌对硝酸盐和亚硝酸盐均具有较高的耐受性，可以用于处理含有较高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水，具有一定的潜在实用价值。

(3)本发明菌株在pH＝10的废水中，16h对总氧化氮的去除率达98％以上，说明该菌具有嗜碱特性，在强碱环境中具有很强的脱氮能力，可以用于处理高浓度硝酸盐碱性废水。

附图说明

图1为施氏假单胞菌HK13的扫描电子显微镜照片；

图2为施氏假单胞菌HK13基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树；

图3为C/N对施氏假单胞菌HK13 24h时脱氮去除率的影响；

图4为pH对施氏假单胞菌HK13 24h时脱氮去除率的影响；

图5为温度对施氏假单胞菌HK13 24h时脱氮去除率的影响；

图6为施氏假单胞菌HK13在最优条件下的生长曲线及反硝化效果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中实验测定方法

总氮(TN)：碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；

硝态氮(NO₃ ^--N)：紫外分光光度法；

亚硝态氮(NO₂ ^--N)：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；

pH值：玻璃电极法；

OD₆₀₀值：采用UV1900紫外分光光度计，在波长600nm下测定反硝化培养基的吸光度。

实施例1

兼性厌氧反硝化菌株(施氏假单胞菌HK13)的分离及鉴定

1.1实验材料

1.1.1菌株来源

菌株分离自湖北某煤气化废水反硝化缺氧池中的活性污泥。

1.1.2培养基

反硝化培养基(g·L^-1)：柠檬酸三钠5；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；KNO₃ 2；MgSO₄·7H₂O0.2；pH 7.0～7.2；

溴百里酚蓝培养基(BTB)(g·L^-1)：L-天冬酰胺1；柠檬酸三钠2；KNO₃ 1；KH₂PO₄ 1；FeCl₂·4H₂O 0.05；CaCl₂ 0.15；MgSO₄·7H₂O 1；BTB(1％乙醇溶液)1mL；琼脂16；pH 7.0；

LB活化保藏培养基(g·L^-1)：蛋白胨10；酵母粉5；NaCl 10；所有的培养基均经121℃灭菌20min。

1.2实验方法

将从湖北某煤气化废水缺氧池中采集的活性污泥沉淀后制成污泥悬液，转接于反硝化培养基中，采用灭菌后的液体石蜡密封，于30℃恒温培养箱中静置培养。待液体培养基表面产生大量气泡后取部分菌液离心、洗涤后转移到新的反硝化培养基中。经多次富集，取100μL菌液系列稀释后，均匀涂布到BTB平板上，将平板倒置于厌氧罐中，于30℃培养箱中静置培养。反复分离纯化后挑取蓝色单菌落，进行硝酸盐还原产气实验，并加入二苯胺和格里斯显色试剂，挑选出一株产气多，产气快，反硝化彻底的菌株，将所得菌株命名为HK13。

HK13，分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2019611，保藏日期为2019年08月07日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。

将分离得到的菌株HK13 30℃，100rpm试管活化培养24h后，LB平板划线，待长出单个菌落后进行形态观察；对菌株进行革兰氏染色并通过光学显微镜观察结果；菌体形态鉴定采用S-3400N型扫描电子显微镜观察。

菌体总DNA参照Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit(生工生物工程(上海)股份有限公司)的方法进行提取。采用细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应体系(25μL)：Taq buffer 2.5μL，MgCl₂ 2.0μL，dNTPs 0.5μL，上游引物和下游引物各1.0μL，超纯水16.5μL，离心混匀后加入Taq酶0.5μL，模板1.0μL。PCR反应条件：①95℃预变性4min；②94℃变性20s；③58℃退火20s；④72℃延伸1min；⑤72℃，7min；②～④步骤循环35次。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电脉检测，回收特异条带后交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3实验结果

菌株HK13在LB平板上呈圆形，浅黄色，边缘不整齐，中凸，表面磨砂。油镜下观察HK13为短棒状，革兰氏染色阴性。参考图1，扫描电子显微镜观察，所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株呈直棒状，大小为(0.6～0.9)μm×(1.5～3.5)μm。

测序结果为测得长度为1379bp的序列，如序列表SEQ ID NO：1所示，将测序结果提交到NCBI，利用Blast进行比对，并结合已有研究中得到验证的相关反硝化细菌序列，进行同源性比较。经16S rRNA基因比对，与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)PaKu14相似度最高，同源性为100％，命名为HK13。利用MEGA7.0软件进行多序列比对分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树，施氏假单胞菌HK13基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树如图2所示。

实施例2

假单胞菌HK13的生长条件优化

(1)本实施例1所得菌株HK13最适C/N比的研究

本实施例中控制初始硝态氮浓度为100mg/L，pH为7.0，使C/N分别为2、4、6、8、10配制相应的反硝化培养基，以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1)，置于30℃，100rpm的恒温振荡培养箱中培养24h，取样，经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。

图3显示了菌株HK13在不同C/N条件下培养24h后NO_x ^--N的去除率，本发明的菌株HK13在C/N＝8时去除效果最佳，在24h内总氧化氮的去除率达99％以上。当C/N进一步增加到10和12时，去除率并没有太大变化，甚至出现轻微下降。

(2)本实施例1所得菌株HK13最适pH的研究

本实施例选取C/N＝8，初始硝酸态氮浓度为100mg/L，使pH分别为5、6、7、8、9、10、11配制相应的反硝化培养基，以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1)，置于30℃，100rpm的恒温振荡培养箱中培养24h，取样，经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。

图4为菌株HK13在不同pH下培养24h后NO_x ^--N去除率，从中可以看出，pH对反硝化作用影响明显，菌株HK13生长的pH范围为7～10，当pH为5时，菌体不能生长；pH为6时有大量亚硝酸积累；pH＝7～10时，24h总氧化氮的去除率均达97％以上。特别指出，在pH＝10的碱性环境中，HK13菌株24h对氮的去除率即可达99％以上，反硝化快速有效。而目前分离出的大多数反硝化菌脱氮适宜pH为中性或偏碱，在pH为10条件下几乎没有太大的反硝化力。说明该菌具有嗜碱特性，可以用于处理含有硝酸盐的碱性废水。

(3)本实施例1所得菌株HK13最适温度的研究

本实施例选取C/N＝8，pH＝8，初始硝态氮浓度为100mg/L配制反硝化培养基，以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1)，分别置于15、20、25、30、35、40、45、50℃的恒温振荡培养箱，100rpm连续培养24h，取样，经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。

图5为菌株HK13在不同温度下培养24h后NO_x ^--N去除率，从中可以看出，温度对反硝化菌株HK13脱氮能力也有较明显的影响。在15℃的低温下，培养至24h，菌株HK13仍处在适应期，脱氮率仅为3％；当温度为20℃，24h菌体处在对数期，快速生长，脱氮率达到59.97％。当温度为25～40℃时，24h的脱氮率均达到96以上，除25℃存在少量的亚硝酸盐积累，其余硝酸盐均被彻底还原。当温度达到45℃时，由于亚硝酸盐的大量积累，脱氮率仅为30％左右，表明高温严重抑制菌株HK13亚硝酸盐还原酶的活性。

(4)菌株HK13最优条件下的生长曲线及反硝化效果的研究

本实施例保持菌株HK13生长在最优条件下，即C/N＝8，pH＝8，初始硝态氮浓度为100mg/L配制反硝化培养基，以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1)，置于35℃，100rpm的恒温振荡培养箱中培养24h，每隔3h取样，测定OD₆₀₀值，并经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液TN、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。

图6为菌株HK13在最优条件下的生长曲线及反硝效果，结果表明菌株HK13在0～6h为适应期，6～15h为对数期，15～24h为稳定期。在对数期内，菌体培养9h总氮由初始浓度107mg/L降至68mg/L，12h降至7.9mg/L，平均脱氮速率为8.26mg·(L·h)^-1，最大脱氮速率为20.03mg·(L·h)^-1，15h的脱氮率为98.22％，存在0.65mg/L的亚硝态氮的积累，培养至24h亚硝酸盐被彻底还原，总氮去除率达99.16％。脱氮速度快速有效，具有很强的脱氮能力。

实施例3

菌株HK13对硝酸盐氮的耐受性研究

本实施例探求菌株HK13处理高浓度硝酸盐废水的能力，实验过程中保持C/N＝8，pH＝8，初始NO₃ ^--N浓度控制为450mg/L配制相应的反硝化培养基。以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1)，置于35℃，100rpm的恒温振荡培养箱中培养3d，每隔8h取样，经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。测定结果如表1所示。

表1

通过表1可以看出，48h硝态氮由455.04mg/L降至9.71mg/L，存在23.26mg/L亚硝态氮积累量，脱氮率达到92.75％，平均反硝化速率为8.79mg·(L·h)^-1，培养到56h，TN降至9.5mg/L，总氮的去除率为97.92％，达到上海市《污水综合排放标准》(DB31/199-2018)中的一级标准。在培养过程中亚硝酸盐的积累量先增后减，在24h积累量达到最大211.35mg/L，随后逐渐被去除，到64h被彻底还原，由此表明菌株HK13也可以以亚硝酸盐作为底物进行反硝化作用，可以用于处理含有较高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水，具有重要的实用价值。

实施例4

菌株HK13对实际废水的脱氮效果

取某污水处理厂二沉池出水，其NO₃ ^--N、NO₂ ^--N、TN和COD的浓度分别为10.15、0.009、9.5、40mg/L，加入一定量的KNO₃，使得硝态氮的初始浓度为100mg/L，另外添加适量的柠檬酸钠使碳氮比为8，调节pH＝8。以体积分数5％接种菌液(经LB培养基富集活化至菌液的OD₆₀₀＝1.0)，置于35℃，100rpm的恒温振荡培养箱中培养2d，每隔4h取样，经高速离心(12000rpm，4℃，5min)，0.22μm滤膜过滤后，测定滤液的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度。实验设置空白对照和平行样，每个实验重复2次。测定结果如表2所示。

表2

由表2可知，菌株HK13在36h内可将初始NO_x ^--N由105.20mg/L降至0.41mg/L，脱氮率为99.61％，且最终无亚硝酸盐积累，脱氮效果明显。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一株嗜碱兼氧反硝化细菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1379

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

caagtcgagc ggatgagtgg agcttgctcc atgattcagc ggcggacggg tgagtaatgc 60

ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat accgcatacg 120

tcctacggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga 180

ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga 240

tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300

atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg 360

gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac 420

gttaccaaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt 480

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat 540

gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcgagcta gagtatggca 600

gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt 660

ggcgaaggcg accacctggg ctaatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt 780

gagatcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900

aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatgcagag aactttccag agatggattg 960

gtgccttcgg gaactctgac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttaaggtg 1080

ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1140

catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa 1200

gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc 1260

gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagcta 1379

Claims (10)

1.一株嗜碱兼氧反硝化细菌，其特征在于，该菌株命名为假单胞菌HK13，分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019611，保藏日期为2019年08月07日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。

2.根据权利要求1所述嗜碱兼氧反硝化细菌，其特征在于，提取所述嗜碱兼氧反硝化细菌的DNA，经基因测序，所述嗜碱兼氧反硝化细菌的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述嗜碱兼氧反硝化细菌，其特征在于，所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株划线于LB平板上，培养2d后，菌落呈圆形，浅黄色，边缘不整齐，中凸，不光滑，表面磨砂，油镜下观察所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株为短棒状，革兰氏染色阴性，扫描电子显微镜观察，所述嗜碱兼氧反硝化细菌的菌株呈直棒状，大小为(0.6～0.9)μm×(1.5～3.5)μm。

4.根据权利要求1所述嗜碱兼氧反硝化细菌，其特征在于，所述嗜碱兼氧反硝化细菌在柠檬酸钠作为碳源、pH范围为7.0～10、温度为30～40℃、C/N为8、转速为100rpm的条件下16h的脱氮率达98％以上。

5.如权利要求1所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用。

6.根据权利要求要求5所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用，其特征在于，脱氮条件为：碳氮比≥8，温度为20～40℃，pH为6.5～10，溶解氧为微溶氧条件。

7.根据权利要求要求6所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用，其特征在于，脱氮条件为：碳氮比为8，温度为35℃，pH为7～10，溶解氧为微溶氧条件。

8.根据权利要求要求7所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用，其特征在于，所述微溶氧条件是指对废水进行搅拌，转速为100rpm。

9.根据权利要求要求5所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用，其特征在于，所述废水为含高浓度硝酸盐和亚硝酸盐的废水。

10.根据权利要求要求9所述嗜碱兼氧反硝化细菌在废水脱氮中的应用，其特征在于，高浓度硝酸盐指NO₃ ^--N浓度可达到500mg/L的废水；高浓度亚硝酸盐指NO₂ ^--N浓度可达到250mg/L的废水。