CN103923856A - 一株嗜碱假单胞菌ad-28及其在水体脱氮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够用于养殖水体快速脱氮的嗜碱假单胞菌（Pseudomonasalcaliphila）AD-28，其保藏号CGMCCNo.8991。本发明发现的嗜碱假单胞菌可快速去除水体中的硝态氮，亚硝态氮，氨氮，从而改善水体环境，减少含氮污染物对水体中生物的危害，提供一种高效、安全、实用的生物脱氮技术。
Description
技术领域
本发明属于生物菌制剂技术领域和环境微生物应用技术领域。涉及一株嗜碱假单胞菌AD-28 及其在水体脱氮中的应用。
背景技术
据国家环保总局 2010年中国环境状况公报, 我国主要湖泊氮、磷污染较重, 养殖水体由于养殖密度提高，饲料投放量过高，导致富营养化问题突出。高浓度的氨氮和（亚）硝态氮不仅对许多水生动物有直接的毒害作用，还会降低其免疫力，导致水产病害频发，给水产养殖业带来巨大损失。因此，更快更好地解决水体富营养化问题已成为亟待解决的环境问题之一，也是目前研究的热点。
近年来，国内外对氮污染的治理日益重视，生物脱氮技术因其迅速安全而被广泛应用。在生物脱氮过程中，最重要的也是具有较大的优势的是好氧反硝化过程。而菌株的好氧反硝化特性决定了水体脱氮的效果。近年来越来越多的好氧反硝化菌被发现，已报道的有产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）、红球菌属（Rhodococcus）、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、戴尔福特属（Delftia）等多个属存在好氧反硝化现象。但是目前国内市场尚无可有效进行水体脱氮的微生物制剂产品，其主要原因是没能开发出高效的脱氮菌种，脱氮效果不明显，制约了生物脱氮技术在生产上的大面积应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有污染水体生物脱氮技术的缺陷，旨在开发一种脱氮细菌，为广大养殖户提供一种高效、安全、实用的生物脱氮技术。
为实现上述目的，本发明人从自然环境中分离得到一株嗜碱假单胞菌AD-28，具有快速、高效脱氮功能；
本发明通过以下技术方案实现：
一株嗜碱假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila）AD-28，分离自天津市西青区水产养殖池中，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8991。
本发明进一步公开了嗜碱假单胞菌AD-28保藏号CGMCC No.8991在制备养殖水体、污染水体快速脱氮菌剂方面的应用。其中的快速脱氮指的是在单一含氮污染物条件下，24 h对初始浓度160 mg/L的氨氮去除率在95%以上，对初始浓度120 mg/L亚硝态氮和初始浓度100 mg/L的硝态氮去除率均达99%以上；在初始浓度为硝态氮183.72 mg/l，亚硝态氮 44.67 mg/l，氨氮40.20 mg/l的混合含氮污染物条件下，AD-28对氨氮、亚硝态氮和硝态氮24 h的去除率均达到96%以上。
本发明更加详细的技术内容如下：
（1）本申请人于2010年12月在天津西青区鱼虾养殖池中分离、筛选到一株高效的异养硝化-好氧反硝化菌AD-28，在好氧条件下具有较强的水体脱氮能力。经过形态观察，生理生化试验和16S rDNA鉴定，属于嗜碱假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila）。申请人于2014年4月3日将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8991。保藏日期：2014年4月3日；单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。
（2）嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)AD-28的细菌学特征及生理生化指标：
AD-28为革兰氏阴性菌，杆状，菌落淡黄色，边缘整齐，表面光滑。接触酶阳性，氧化酶阳性，淀粉水解阳性，MP阴性，VP阴性，吲哚反应阴性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化阳性，产硫化氢阳性。
（3）嗜碱假单胞菌AD-28的脱氮效果：
其中的快速脱氮指的是指在单一含氮污染物条件下，24 h对初始浓度160 mg/L的氨氮去除率在95%以上，对初始浓度120 mg/L亚硝态氮和初始浓度100 mg/L的硝态氮去除率均达99%以上；在初始浓度为硝态氮183.72mg/l，亚硝态氮 44.67mg/l，氨氮40.20mg/l的混合含氮污染物条件下，24h氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除率均达到96%以上。其在15℃单一含氮污染物条件下，48 h对初始浓度17 mg/L的氨氮和13 mg/L亚硝态氮去除率分别为91.2%和99%，72h对初始浓度128 mg/L的硝态氮去除率均达99%。可以制备快速脱氮菌剂，应用于养殖水体和污染水体，并可在15℃的低温环境中应用。
（4）菌株AD-28的发酵培养方法：
微生物菌株：选用嗜碱假单胞菌Pseudomonas alcaliphila AD-28 CGMCC No.8991
活化培养：将低温保存的嗜碱假单胞菌AD-28斜面菌种接种到含有固体培养基的平板中，25-35 ℃条件下，静置培养24-48 h。
种子培养：在步骤（2）中活化的嗜碱假单胞菌AD-28，在无菌条件下用接种环接种于装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，25-35 ℃条件下，150转/min的摇床中震荡培养24-48 h。
发酵罐培养：将步骤（3）中培养的液体菌种以2%接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，25-35 ℃条件下，通气量0.6 m3/min，转速为100 r/min，培养24-48 h。
培养基成分为：柠檬酸钠2-5 g，(NH4)2SO4 1-2g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH7-8。
本发明公开的高效的嗜碱假单胞菌AD-28菌株与本发明人申请的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）菌株DB-33相比，可去除较高浓度（200 mg/L）的氨氮，且在低温条件下（15℃）脱氮效果较好的特点。其所具有的积极效果在于：
（1）能够快速同步去除水体中的硝态氮、亚硝态氮和氨氮，具有较好的脱氮效果。
（2）对养殖生物无毒性，可以在环境污水处理，养殖池脱氮等多个领域使用。
（3）能够在高浓度氨氮废水中应用。
（4）能够在15℃左右的低温环境中应用。
附图说明：
图1为AD-28对硝态氮的去除效果；
图2为AD-28对亚硝态氮的去除效果；
图3为AD-28对氨氮的去除效果；
图4为AD-28对混合含氮污染物的去除效果。
图5为AD-28在不同温度下对硝态氮的去除效果。
图6为AD-28在不同温度下对亚硝态氮的去除效果；
图7为AD-28在不同温度下对氨氮的去除效果；
具体实施方式：
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下面通过实例来进一步阐明高效水体脱氮嗜碱假单胞菌AD-28的制备方法。本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。
实施例1
菌株的分离，筛选和鉴定
（1）菌株分离：
样品采集：2012年12月采集天津市西青区鱼虾养殖池底泥样品。
样品富集：配置液体富集培养基:
DM培养基：柠檬酸钠5 g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH7.2。将底泥样品取3-5g加入富集培养基中，30℃培养5d。
分离培养基：DM氨氮培养基加入12-15g琼脂粉，倒平板分离。
将富集后的菌液在分离培养基上进行划线分离，经过4-5次纯化后获得单菌株。
（2）优良菌株的筛选：
筛选培养基：柠檬酸钠5 g， KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去离子水1L，pH7.2
DM硝酸盐培养基： 加入KNO3 0.721 8 g/L（硝态氮的含量为100 mg/L）；
DM亚硝酸盐培养基：加入NaNO2 0.025 g/L（亚硝态氮的含量为5 mg/L）；
DM氨氮培养基：加入 (NH4)2SO4 0.2g/L（氨氮的含量为20mg/L）；
将多株单菌株接种到筛选培养基，定期测定其中的污染物含量，选择出去除能力强，去除速度快的菌株AD-28。
（3）菌株的鉴定：
利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物做PCR扩增，并测序，将AD-28 16S rDNA序列到NCBI网站进行BLAST 序列比对，发现其与多株假单胞菌的序列同源性达到99%，经鉴定，确定为嗜碱假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila）AD-28。
AD-28 16S rDNA序列：
AATGCAGTCGAGCGGATGATGGGAGCTTGCTCCCTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTAGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGA。
其中的原核生物16S rDNA通用引物指的是27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA (5'-3')；
PCR扩增的条件：2.5μL10×PCR缓冲液，3.5μLMgCl2，0.5μL模板DNA，0.5μL PF和PR，1μL dNTP，0.5μL Taq DNA 聚合酶，16μL超纯水。PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸10 min。
实施例2
AD-28菌株在模拟养殖废水中的脱氮效果
AD-28菌株对硝态氮的去除效果
以DM液体培养基为基础，调整硝态氮的初始浓度为100-400mg/L，实验容器为250mL锥形瓶，每瓶装培养基100mL培养基，于高压灭菌锅121℃灭菌20 min，接种量为1%。定时测定硝态氮含量。结果如图1。
由图1可以看出，在硝态氮初始浓度为100-400 mg/L的浓度范围内，培养24 h后各个处理的硝态氮浓度均显著降低。其中初始浓度100 mg/L时，硝态氮去除率达到99%，基本被完全去除；而在初始浓度为200，300，400 mg/L时，其硝态氮去除率在48h分别为80.8%，60.4%，62.6%，说明较好的去除硝态氮的能力。
AD-28菌株对亚硝态氮的去除效果
以DM液体培养基为基础，调整亚硝态氮的初始浓度为20-200 mg/L，实验方法同上。定时测定亚硝态氮含量，结果如图2。
由图2可以看出，在亚硝态氮初始浓度为20-200 mg/L的浓度范围内，培养24 h后各个处理的亚硝态氮浓度均显著降低。其中初始浓度20-120 mg/l的范围内，培养24 h后各个处理的亚硝态氮去除率均达到99%以上，基本被完全去除；而在初始浓度为160 mg/l，200 mg/l时，其亚硝态氮去除率在24 h分别为76.3%，66.3%，而到48 h其亚硝态氮去除率均达到99%以上，被完全去除。
AD-28菌株对氨氮的去除效果
以DM液体培养基为基础，调整氨氮的初始浓度为20-200 mg/L，实验方法同上，定时测定氨氮含量，结果如图3。
由图3可以看出，在氨氮初始浓度为20-160 mg/l的范围内，AD-28菌株对氨氮的去除不受初始氨氮浓度的影响，去除率较高，达到95%以上。
AD-28菌株对混合含氮污染物的去除效果
以DM液体培养基为基础，调整硝态氮183.72mg/l，亚硝态氮 44.67mg/l，氨氮40.20mg/l，实验方法同上，定时测定硝态氮、亚硝态氮和氨氮含量，结果如图4。
由图4可以看出，接菌24h, AD-28对氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除率均达到96%以上。
实施例3
AD-28菌株在低温下的脱氮效果
以DM液体培养基为基础，调整硝态氮的初始浓度为128 mg/L，实验容器为250mL锥形瓶，每瓶装培养基100mL培养基，于高压灭菌锅121℃灭菌20 min，接种量为1%，分别在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃下培养，定时测定硝态氮含量。结果如图5。
由图5可以看出，20-35 ℃AD-28菌株在48 h内对初始浓度128 mg/L的硝态氮去除率达99%，15 ℃下AD-28菌株在72 h内对初始浓度128 mg/L的硝态氮去除率达99%。
以DM液体培养基为基础，调整亚硝态氮的初始浓度为13 mg/L，实验方法同上。定时测定亚硝态氮含量，结果如图6。
由图6可以看出，25-35 ℃AD-28菌株在24 h内对初始浓度13 mg/L的亚硝态氮去除率达99%，15-20 ℃下AD-28菌株在48 h内对初始浓度13mg/L的亚硝态氮去除率达99%。
以DM液体培养基为基础，调整氨氮的初始浓度为18.5 mg/L，实验方法同上，定时测定氨氮含量，结果如图7。
由图7可以看出，20-35 ℃AD-28菌株在24 h内对初始浓度13 mg/L的氨氮去除率达90%以上，15 ℃下AD-28菌株在48 h内对初始浓度18.5 mg/L的氨氮去除率达91%。
实施例4
AD-28的安全性评价
试验设对照、AD-28接种2个处理。每缸装水50 L，放养10条大小基本一致的鲫鱼（长约6～8 cm），平均每条鱼重12.34g，投AD-28菌液1 L（菌液浓度为3*108 cfu·mL-1）。养鱼管理按日常管理，7 d投一次菌，试验周期30 d。
试验期间鱼苗进食正常，非常活跃，无浮头现象，所有处理未出现死亡现象。鱼的成活率均为100%，说明AD-28制剂对鱼苗是安全的。
实施例5
菌株AD-28的发酵培养：
（1）微生物菌株：选用嗜碱假单胞菌Pseudomonas alcaliphila AD-28 CGMCC No.8991
（2）活化培养：将低温保存的嗜碱假单胞菌AD-28斜面菌种接种到含有固体培养基的平板中，25-35 ℃条件下，静置培养24-48 h。
（3）种子培养：在步骤（2）中活化的嗜碱假单胞菌AD-28，在无菌条件下用接种环接种于装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，25-35 ℃条件下，150转/min的摇床中震荡培养24-48 h。
（4）发酵罐培养：将步骤（3）中培养的液体菌种以2%接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，25-35 ℃条件下，通气量0.6 m3/min，转速为100 r/min，培养24-48 h。
培养基成分为：柠檬酸钠2-5 g，(NH4)2SO4 1-2g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH7-8。
最终得到的菌液浓度经过稀释涂板法测定可以达到108 cfu/ml。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业生物技术研究中心
<120> 一株嗜碱假单胞菌AD-28及其在水体脱氮中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 784
<212> DNA
<213> 嗜碱假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila）
<400> 1
aatgcagtcg agcggatgat gggagcttgc tccctgattt agcggcggac gggtgagtaa 60
tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat aacgttccga aaggaacgct aataccgcat 120
acgtcctacg ggagaaagca ggggacctta gggccttgcg ctatcagatg agcctaggtc 180
ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatccgtaac tggtctgaga 240
ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggtct 360
tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggcatta acctaatacg ttagtgtttt 420
gacgttaccg acagaataag caccggctaa cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag 480
ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggtt cgttaagttg 540
gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatccaa aactggcgag ctagagtacg 600
gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatagg aaggaacacc 660
agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag tgcgaaagcg tggggagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcaactagcc gttgggttcc 780
ttga 784
Claims (5)
1.一种嗜碱假单胞菌，其特征在于拉丁名：Pseudomonas alcaliphila，AD-28，分离自天津市西青区水产养殖池中，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8991。
2.权利要求1所述嗜碱假单胞菌AD-28保藏号CGMCC No.8991在制备养殖水体、污染水体快速脱氮菌剂方面的应用。
3.权利要求2所述的应用，其中的快速脱氮指的是在单一含氮污染物条件下，24 h对初始浓度160 mg/L的氨氮去除率在95%，对初始浓度120 mg/L亚硝态氮和初始浓度100 mg/L的硝态氮去除率均达99%；在初始浓度为硝态氮183.72 mg/l，亚硝态氮 44.67 mg/l，氨氮40.20mg/l的混合含氮污染物条件下，接菌24h，AD-28对氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除率均达到96%。
4.权利要求2所述的应用，其快速脱氮还指在15℃的低温环境下的应用，其在15℃单一含氮污染物条件下，48 h对初始浓度17 mg/L的氨氮和13 mg/L亚硝态氮去除率分别为91.2%和99%，72h对初始浓度128 mg/L的硝态氮去除率均达99%。
5.权利要求1所述嗜碱假单胞菌AD-28保藏号CGMCC No.8991 的发酵培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）微生物菌株：嗜碱假单胞菌Pseudomonas alcaliphila AD-28 CGMCC No.8991；
（2）活化培养：将低温保存的嗜碱假单胞菌AD-28斜面菌种接种到含有固体培养基的平板中，25-35 ℃条件下，静置培养24-48 h；
（3）种子培养：在步骤（2）中活化的嗜碱假单胞菌AD-28，在无菌条件下用接种环接种于装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，25-35 ℃条件下，150转/min的摇床中震荡培养24-48 h；
（4）发酵罐培养：将步骤（3）中培养的液体菌种以2%接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，25-35 ℃条件下，通气量0.6 m3/min，转速为100 r/min，培养24-48 h；
培养基成分为：柠檬酸钠2-5 g，(NH4)2SO4 1-2g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH7-8。
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