CN101531970A - 一株假单胞菌及其在生物还原和生物吸附中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株假单胞菌及其在生物还原和生物吸附中的用途。本发明假单胞菌Pseudomonas alcaliphila sp.MBR，保藏号为CGMCC No.2318，具有对金属、非金属离子的还原能力和对金属离子吸附能力；菌落白色，菌落边缘不整齐，但光滑湿润，有光泽，黏稠不透明；其培养基成分为：KNO3 0.5－1.0g，KH2PO4 0.1－1.0g，MgSO4·7H2O 0.01－1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，CaCl2·2H2O 0.2g，柠檬酸三钠0.9－6.9g，蒸馏水1000ml。本发明菌种易于培养，其生物还原和生物吸附方法简单，可广泛用于冶金、废水治理及土壤和水体中有害物质的去除。

Description

一株假单胞菌及其在生物还原和生物吸附中的用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株假单胞菌及其在生物还原和生物吸附中的用途。
背景技术
金属和非金属的异化还原是指金属和非金属元素作为微生物呼吸作用的最终电子受体得到还原的过程。金属和非金属的异化还原研究得到了各国学者的广泛重视，通过异化还原不仅可减轻或消除环境中有害金属、非金属离子对人类健康的危害，有效回收多金属矿、尾矿的各种贵重金属，还可通过人为途径生产各种纳米材料、催化剂等，硒、碲等非金属元素的生物还原研究成为国际材料领域的热点。
金属异化还原最早源于微生物对铁(III)和锰(IV)还原的研究，研究发现，微生物能够以有机酸或氢等作为电子供体，把铁(III)和锰(IV)还原为铁(II)和锰(II)。最近十年来，学者们还发现铬(VI)、钒(V)、钴(III)、钯(II)、铑(III)、铕(III)以及放射性元素铀(VI)、钚(VI)、镎(V)、锝(VII)等高价态离子或氧化物能够作为电子受体，通过微生物氧化有机酸或氢等电子供体还原为低价态离子或氧化物，部分离子钯、汞、铑、铕能够被微生物直接还原为单质。
在现有公开专利文献中，2篇美国专利(专利号：US5569596和US5739028)分别描述了一株耐铬(VI)的Shewanella alga在厌氧条件下还原铬(VI)生成不溶性的铬(III)沉淀并从污染物中去除的方法。1篇中国专利(专利号：CN93106616.6)描述了Fusobacteriumnucleatum等厌氧菌株能够还原铬(VI)生成不溶性铬(III)沉淀，并在电镀废水等重金属废水中除铬的应用。2篇美国专利(专利号：US5055130和US5283192)分别描述了一株Bacillus polymyxa处理锰银矿，并通过还原锰(IV)氧化物为可溶性的锰(II)离子，促进回收锰和银的方法。1篇美国专利(专利号：US6218171)描述了2株Shewanelia菌(Shewanelia putrifacians和Shewanelia alga)的非生长细胞在厌氧条件下还原放射性元素锝(VII)为锝(IV)的方法。此外，还有2篇美国专利(专利号：US5352608和US5804424)分别描述了光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)在厌氧条件下能够还原铑(III)和铕(III)的氧化物为单质并在细胞膜上沉积的方法。1篇中国专利(专利号：CN1281524C)描述了脱硫弧菌、假单胞菌、西瓦氏菌等还原菌处理含有重金属废水的方法，其中铁(III)和锰(IV)可还原为低价态。
除专利文献外，还有许多文献报道了利用微生物还原金属的研究结果。其中以发现最早的铁(III)和锰(IV)的生物还原研究报道较多。Derek在该领域中作出了杰出的贡献，他在Nature发表了3篇有关铁(III)的生物还原方面的文章。另外，还有大量文章涉及Shewanella sp.和Geobacter sp.菌株在金属还原领域中的应用。铬(VI)作为环境中的有害物质，其生物还原也得到了学者们的重视，多篇文献报道了硫酸盐还原菌对铬(VI)的还原并形成不溶性的铬(III)化合物，其中包括我国学者李福德和顾继东等。Hillol和Sarah分别报道了Shewanella alga和Shewanella oneidensis MR-1对铬(VI)的还原。钒(V)是近年来研究较多的高价金属离子还原对象，已经发现Geobacter sp.、Shewanella sp.以及Pseudomonas sp.等细菌都具有还原钒(V)为不溶性钒(IV)化合物的能力。此外，对于放射性元素铀(VI)来说，由于其在环境中的危害性，生物还原已经成为消除其危害的重要手段。在Nature杂志中有2篇关于铀(VI)生物还原的研究报道。早在1991年，Derek在Nature上发表文章报道了利用铁(III)还原菌(Alteromonas putrefaciens)可还原铀(VI)成为不溶性的铀(IV)，且还原速率明显快于非生物还原过程。还有部分学者报道了利用Shewanella sp.以及Geobacter sp.等细菌还原其它金属元素如钴(III)、镎(V)、锝(VII)等高价金属离子的研究，其还原产物分别为低价态的钴(II)、镎(IV)、锝(IV)。
除上述金属元素以外，贵金属如金、银、铂、钯等元素的生物还原早已得到了学者们的重视，某些研究成果已应用于贵金属的冶炼和金属催化剂的加工过程。与其他金属元素不同的是，由于贵金属的惰性，生物还原产物多为单质，且参与还原的微生物呈现出多样性，其中，既有硫酸盐还原菌、Shewanella、还有Bacillus、Pseudomonas、Enterobacteria、Corynebacterium等微生物参与还原过程。我国学者刘月英等在金、铂、钯等贵金属离子还原为单质以及钯催化剂等领域也作了大量研究工作。Wiatrowski HA利用Shewanella sp.和Geobacter sp.进行了汞(II)的还原研究，结果发现，通过微生物还原作用，可直接将汞(II)还原为单质汞(0)。
综上所述，除少数惰性贵金属元素以外，绝大多数金属元素的生物还原还仅限于高价态向低价态的转化，而直接将金属离子还原为单质的报道还不多见，并且大多数是在厌氧条件下完成的。
从金属元素电极反应的标准电极电位(酸性溶液中)也可看出，贵金属元素金(I)、银(I)、钯(II)还原为单质的电极电位都较高，分别为1.68(v)、0.80(v)、0.99(v)。此外，贵金属元素铂(IV)可通过微生物还原为低价铂(II)或单质铂(0)。两个还原反应的电极电位分别为0.68(v)，0.73(v)。除贵金属以外，汞同样能够被微生物还原为单质，从电极电位可看出，但汞(II)还原的电极电位仍然较高，达到0.85(v)。而对于铁(III)、锰(IV)、铬(VI)、钒(V)、钴(III)、铀(VI)、钚(VI)等一般金属元素来说，从高价态还原到相应的低价态的铁(II)、锰(II)、铬(III)、钒(IV)、钴(II)、铀(IV)、钚(IV)电极电位分别为0.77(v)、1.23(v)、1.33(v)、1.00(v)、1.82(v)、0.62(v)、0.97(v)。
微生物参与还原的金属元素电极电位分析表明，现有生物还原过程电极电位都较高，介于0.6(v)-1.8(v)之间。而低价态金属元素铁(II)、锰(II)、铬(III)、钒(II)、钴(II)、铀(III)、钚(IV)进一步还原为单质，其电极反应的电极电位分别为-0.44(v)、-1.18(v)、-0.74(v)、-1.18(v)、-0.28(v)、-1.8(v)、-2.42(v)，到目前为止，还没有通过微生物还原如此低电极电位金属元素的电极反应现象的报道。
在非金属还原研究方面，常见非金属元素的氧化态如硫酸盐、硝酸盐通过硫酸盐还原菌或硝酸盐还原菌(反硝化菌)还原为硫化物或氮气、氧化亚氮等产物。在硫酸盐还原以及硝酸盐还原领域已有太多的文献和专著发表，自然界中大量的微生物都参与了氧化态氮、氧化态硫的生物还原过程。
此外，环境中过量的砷、硒、碲等元素带来的健康风险使得学者们对砷、硒、碲等非金属元素的生物还原给予了足够的重视。2篇美国专利(专利号：US5352608，US5804424)描述了2株光合细菌(Rhodobacter sphaeroides和Rhodobacter capsulatus)在光合异养和化能异养条件下，能够还原亚硒酸盐和亚碲酸盐为单质硒和碲。2篇美国专利(专利号：US5009786，US5271831)描述了利用缺氧系统处理含硒酸盐的废水，微生物能够利用有机酸和氢作为电子供体直接还原硒酸盐为单质硒，残留的部分亚硒酸盐可通过微生物产生的硫化氢还原为单质硒。
涉及硒和碲还原的一般文献较多，早期的研究主要针对微生物对硒、碲等化合物的抗性。上世纪90年代中期，开始出现利用光合细菌还原亚碲酸盐和亚硒酸盐为单质碲和硒的研究文献。VLADIMIR YURKOV和A.Yamada分别报道了光合细菌(Roseococcusthiosulfatophilus，Erythromicrobium ezovicum，Rhodobacter sphaeroides)能够在好氧和厌氧条件下还原亚碲酸盐和亚硒酸盐为单质碲和硒。此外，我国学者王东亮和Janine Kessi分别报道了还原亚硒酸盐的光合细菌Rhodobacter azotoformans的筛选以及Rhodospirillumrubrum和Rhodobacter capsulatus参与亚硒酸盐还原为单质的酶系统。除光合细菌以外，学者们利用反硝化菌还原硝酸盐的机理研究了亚硒酸盐和亚碲酸盐的还原，SridharViamajala利用反硝化培养物通过批式和反应器探讨了亚硒酸盐的还原。MONIQUESABATY利用反硝化菌的周质、膜结合反硝化酶研究了亚硒酸盐和亚碲酸盐的还原。MICHIHIKO IKE和J.M.Rajwade分别利用假单胞菌(Pseudomonas stutzeri，Pseudomonasuorescens和Pseudomonas mendocina)还原硒酸盐、亚硒酸盐和亚碲酸盐为单质硒、碲。Agnieszka Klonowska利用金属元素还原菌(Shewanella oneidensis)研究厌氧条件下，亚硒酸盐和碲酸盐的还原，发现大量的单质硒、碲以纳米粒子形态沉积于细胞膜外。我国学者顾继东、李瑞萍分别利用芽孢杆菌还原亚硒酸盐，同样能够获得单质硒。有关砷还原的研究相对较少，已发现在厌氧环境中，砷(V)会被SR菌和pseudomonas还原为溶解性和毒性更强的砷(III)。
非金属硅作为非常重要的光电转换元素，在太阳能电池以及半导体材料以及其他光电材料领域占据着极其重要的地位。至今没有发现任何有关硅生物还原的文献报道。
综上所述，除传统氮、硫等非金属元素的生物还原及其普遍应用以外，随着材料科学的发展，硒、碲等稀有非金属元素的生物还原已经成为国际热点，这一领域的研究也取得长足的进步。从现有文献来看，非金属元素的还原还仅限于上述元素，还没有发现其他元素生物还原的报道。
从非金属元素电极反应的标准电极电位(酸性溶液中)可看出，氮、硫氧化态(氮(V)、硫(VI))还原为较低价态氮(II)、硫(IV)的电极电位分别为0.96(v)、0.20(v)，而氮(II)通过氮(I)还原为氮(0)的电极电位都较高，分别达到1.59(v)、1.77(v)。硫(IV)还原为硫(0)的电极电位为0.45(v)。从近年来取得重要进展的硒、碲生物还原来看，高价态硒(IV)、碲(IV)还原为硒(0)、碲(0)的电极电位分别为0.74(v)、0.56(v)。即便是砷(v)还原为砷(III)，其电极电位也达到0.56(v)。
从上述元素来看，除硫(VI)还原为硫(IV)的电极电位0.20(v)相对较低外，其它价态元素还原为单质的电极电位都普遍较高，介于0.40(v)-1.77(v)之间。而对于硅(IV)来说，其还原为硅(0)的电极电位达到-0.86(v)，这可能是高价态硅难于生物还原的重要原因。
近年来对重金属污染的治理成为一个极其重要的环境问题。重金属污染的传统治理技术包括化学沉淀、电解、离子交换、物理吸附等。与传统方法相比，生物吸附是近10多年来迅速发展的新兴重金属处理技术。生物吸附是利用活细胞或死细胞通过离子交换、表面络合、氧化还原以及静电吸附等原理对金属离子吸附并回收的有效途径，具有低浓度处理效率高、吸附容量大、选择性好、易操作等优点。有关重金属离子的生物吸附研究一直是国际环境领域的热点。细菌、藻类和真菌以及它们的某些组分作为生物吸附剂已被成功地应用于水体中重金属离子的吸附与去除.在这些微生物中，细菌由于其较高的比表面积而引起广泛的关注。
生物吸附技术的重要进展首先在硫酸盐还原菌的研究及其在重金属废水生物治理技术方面的应用，硫酸盐还原菌及其代谢产物(可溶性硫化物)在吸附重金属离子如铬、镉、镍、锌等方面发挥了重要作用。在该领域，我国学者李福德作出了较为重要的贡献，其发表的3篇专利(专利号：CN93106616.6、CN96117479.X、WO9733837)都涉及利用硫酸盐还原菌以及其他厌氧菌的功能菌吸附、还原重金属，并在电镀废水以及其他金属离子废水方面的应用。除硫酸盐还原菌以外，近年来学者们还广泛应用细菌、酵母、霉菌、藻类等作为金属离子吸附剂，如US5055402提出了利用干燥后的死藻吸附从废水中吸附金属离子，US5538645以及US4701261采用处理后的酵母从废水中吸附金属离子并回收的方法，US4690894推出了利用碱液处理后的微生物细胞能够促进金属离子的吸附。还有部分专利推出了利用亲水性材料包埋微生物细胞或菌丝来促进金属离子吸附的方法(US5976847，CN02131031.9)。除上述专利文献外，还有大量一般文献涉及微生物细胞吸附金属离子的研究。
需要指出的是，上述这些专利与一般文献都是利用微生物的非生长细胞作为吸附材料对金属离子进行吸附，非生长细胞的前处理过程比较烦琐，吸附效率有限。而涉及生长细胞吸附金属离子的文献相对较少。
某些微生物在生长细胞代谢过程中，同样对金属离子具有显著的吸附功能，US6383388描述了耐金属离子的啤酒酵母在生长过程中，可吸附并还原低浓度铬(VI)(2mg/l)为铬(III)，还可吸附废水中的钼、镍、锌、钙、钴等离子。但专利中除铬外，没有提及其他有关离子的去除效率。US6355172、CN1281524C和CN1086366C提出了利用附着于沙滤床的生长的微生物吸附金属离子，废水连续经过滤床去除、洗出滤床部分微生物并回收金属离子的工艺。工艺中采用西瓦氏菌、脱硫弧菌、脱硫球菌等大量厌氧微生物，利用微生物代谢产物(硫化物等)或形成金属氧化物、氢氧化物的形式沉积金属离子并回收的方法，专利中没有提及有关金属离子的去除效率。
除电镀行业等废水金属离子浓度高、水量少适合采用外加生物吸附剂，在厌氧或缺氧环境中去除金属离子外，还有大量含金属废水具有金属离子种类多、浓度低、水量大的特点，厌氧条件难以控制，因此好氧条件下的生物吸附显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila sp.MBR)。该细菌在好氧条件下，既能还原硝酸盐产生氨，也能吸附金属离子，还能够还原溶液中金属离子、非金属离子为单质。
本发明的另一个目的是提供该假单胞菌的用途，其用途在于能够将溶液中金属离子包括Fe(III)，Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)还原为金属单质。此外，该菌株还能够将溶液中Si(IV)，Se(IV)，Te(IV)非金属离子还原为单质，从而去除水体、土壤以及废弃物中的有害Se(IV)，Te(IV)非金属离子。利用生物还原途径生产硅、硒、碲等单质元素，用于半导体、光电材料以及食品添加剂等领域。
本发明的另一个目的还在于该假单胞菌还能够利用活菌体吸附金属离子包括Cu(II)，Zn(II)，Ni(II)，Cd(II)，Fe(III)，Mn(II)，Co(II)，Pb(II)，Al(III)，从而去除低浓度溶液中金属离子。
本发明提供的生物还原细菌是一株假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila sp.)MBR，已于2008年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(简称CGMCC)。保藏号为CGMCC No.2318。
假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila sp.)MBR菌落白色，菌落边缘不整齐，但光滑、湿润，有光泽，黏稠不透明，该菌的扫描电镜照片见图1。该菌株经形态、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性分析，鉴定为假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)，该菌株生理生化特征如表1，其16S rRNA基因序列已提交美国NCBI数据库注册(AccessionNo：EU307111)，同源性分析如表2所示。
表1 Pseudomonas alcaliphila sp.MBR的生理生化特征
Figure A200810044958D00091
表2 Pseudomonas alcaliphila sp.MBR16S rRNA基因序列同源性分析
Figure A200810044958D00092
Pseudomonas alcaliphila sp.MBR的16S rRNA基因序列
TTTAGCGGCG  GAAGGGTGAG  TAATGCCTAG  GAATCTGCCT  GGTAGTGGGG
GATAACGTTC  CGAAAGGAAC  GCTAATACCG  CATACGTCCT  ACGGGAGAAA
GCAGGGGACC  TTCGGGCCTT  GCGCTATCAG  ATGAGCCTAG  GTCGGATTAG
CTAGTTGGTG  AGGTAATGGC  TCACCAAGGC  GACGATCCGT  AACTGGTCTG
AGAGGATGAT  CAGTCACACT  GGAACTGAGA  CACGGTCCAG  ACTCCTACGG
GAGGCAGCAG  TGGGGAATAT  TGGACAATGG  GCGAAAGCCT  GATCCAGCCA
TGCCGCGTGT  GTGAAGAAGG  TCTTCGGATT  GTAAAGCACT  TTAAGTTGGG
AGGAAGGGCA  TTAACCTAAT  ACGTTAGTGT  TTTGACGTTA  CCGACAGAAT
AAGCACCGGC  TAACTTCGTG  CCAGCAGCCG  CGGTAATACG  AAGGGTGCAA
GCGTTAATCG  GAATTACTGG  GCGTAAAGCG  CGCGTAGGTG  GTTCGTTAAG
TTGGATGTGA  AAGCCCCGGG  CTCAACCTGG  GAACTGCATC  CAAAACTGGC
GAGCTAGAGT  ACGGTAGAGG  GTGGTGGAAT  TTCCTGTGTA  GCGGTGAAAT
GCGTAGATAT  AGGAAGGAAC  ACCAGTGGCG  AAGGCGACCA  CCTGGACTGA
TACTGACACT  GAGGTGCGAA  AGCGTGGGGA  GCAAACAGGA  TTAGATACCC
TGGTAGTCCA  CGCCGTAAAC  GATGTCAACT  AGCCGTTGGG  TTCCTTGAGA
ACTTAGTGGC  GCAGCTAACG  CATTAAGTTG  ACCGCCTGGG  GAGTACGGCC
GCAAGGTTAA  AACTCAAATG  AATTGACGGG  GGCCCGCACA  AGCGGTGGAG
CATGTGGTTT  AATTCGAAGC  AACGCGAAGA  ACCTTACCTG  GCCTTGACAT
GCTGAGAACT  TTCCAGAGAT  GGATTGGTGC  CTTCGGGAGC  TCAGACACAG
GTGCTGCATG  GCTGTCGTCA  GCTCGTGTCG  TGAGATGTTG  GGTTAAGTCC
CGTAACGAGC  GCAACCCTTG  TCCTTAGTTA  CCAGCACGTA  ATGGTGGGCA
CTCTAAGGAG  ACTGCCGGTG  ACAAACCGGA  GGAAGGTGGG  GATGACGTCA
AGTCATCATG  GCCCTTACGG  CCAGGGCTAC  ACACGTGCTA  CAATGGTCGG
TACAAAGGGT  TGCCAAGCCG  CGAGGTGGAG  CTAATCCCAT  AAAACCGATC
GTAGTCCGGA  TCGCAGTCTG  CAACTCGACT  GCGTGAAGTC  GGAATCGCTA
GTAATCGTGA  ATCAGAATGT  CACGGTGAAT  ACGTTCCCGG  GCCTTGTACA
CACCGCCCGT CACCCCATGG GTGTGGGT
本发明所述假单胞菌(Pseudomonas alcaliphilasp.)MBR的培养基(NCTS)成分为：KNO3 0.5-1.0g，KH2PO4 0.1-1.0g，MgSO4·7H2O 0.01-1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，CaCl2·2H2O0.2g，柠檬酸三钠0.9-6.9g，蒸馏水1000ml。
本发明中Pseudomonasalc aliphila sp.MBR的筛选和驯化及其特性：
(1)菌种的富集和筛选
Pseudomonas alcaliphila sp.MBR分离自成都固体废弃物卫生处置场垃圾渗滤液。富集培养基成分：
A液：KNO3 1.0g，1％BTB酒精溶液5.0ml，蒸馏水500ml
B液：柠檬酸钠8.5g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05gCaCl2·2H2O 0.2g，蒸馏水500ml。
混合A、B溶液调节pH7.0，115℃灭菌15min。富集培养10d后，按1％的接种量转接到新鲜培养基中，期间定性检测溶液中氨氮，直到氨氮出现，按照常规微生物分离纯化方法，分离得到多株纯菌株。
将得到的多株纯菌株分别接种于NCTS液体培养基中进行好氧培养，获得一株具有高效硝酸盐还原能力的细菌MBR。经生理生化特征及分子鉴定，该菌为假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila sp.)MBR。
(2)还原硝酸盐产氨性能
MBR能在Giltay琼脂平板上利用硝酸盐为氮源，柠檬酸钠为碳源进行生长，将硝酸盐还原为氨。将发酵48h的培养液置4℃条件下，存放7d后观察到针状晶体析出。通过纳氏试剂、格里斯试剂和二苯胺分别滴加在晶体上的颜色变化，确定晶体中含有氨盐。柠檬酸钠作为电子供体，硝酸盐为电子受体，实现了氮的还原。
(3)MBR的还原特性
在利用假单胞菌MBR进行重金属吸附过程中，发现该菌具有很强的金属还原特性。MBR能以柠檬酸钠为电子供体，金属离子包括Fe(III)，Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)等。浓度测试表明MBR在0.5-10mM金属离子浓度下都具有较好的还原性。
此外，MBR菌还能够将Si(IV)，Se(IV)，Te(IV)等非金属还原为单质。
本发明生物还原过程中金属还原的步骤和方法如下：
1、将斜面保存菌株接种于经灭菌的100ml LB液体培养基中，置于28℃，110rpm摇床振荡培养3d进行菌种的活化，然后按0.2％接种量转接到NCTS液体培养基中培养48h，重复2次备用。
2、配制本发明中所述培养基(NCTS)800ml，分别装入250ml三角瓶中，每个三角瓶的装液量为100ml，塞上棉塞，121℃高温灭菌20min，待培养基冷却后，接种步骤1中新培养的MBR菌种50-200μl。
3、在步骤2所述培养基中分别加入金属盐FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、NiCl2·6H2O、3CdSO4·8H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O、Pb(NO3)2。在pH 6.0-10.0，温度28-38℃，100-150rpm摇床振荡培养3-5d后经离心、去离子水洗(重复2-3次)、再离心，回收沉淀物，冷冻干燥后进行金属氧化物和金属单质的检测。
金属盐Ti(SO4)2中钛离子也能够被还原为单质，但硫酸钛仅溶解于强酸不溶于水，因此需要经过预处理形成鳌和钛溶液后才能进行还原，具体步骤如下：
1、取Ti(SO4)2溶液(15-18％)按1：0.25-3加入氨水(25-28％)形成偏钛酸，偏钛酸溶解于乳酸(85-90％)，其加入量为Ti(SO4)2溶液的7-10倍，加水，并逐渐水浴加热至70℃，待混浊变澄清即获得可溶性鳌合钛溶液。
2、配制的150ml2mM Ti(SO4)2溶液中加入KH2PO4300mg，MgSO4 150mg，FeCl3·6H2O7.5mg，CaCO3 1.5mg，混合均匀，调节pH7.0，塞上棉塞，于121℃高温灭菌20min，冷却后接种200μl-500μl Pseudomonas alcaliphila sp.MBR菌种，置于110rpm，28℃摇床振荡培养，3-5d后经离心、去离子水洗(重复2-3次)、再离心，收集沉淀物，沉淀物冷冻干燥后进行钛金属氧化物和单质的检测。
本发明中非金属硅、硒、碲的还原步骤和方法同上。其中非金属盐分别为Na2SiO3·9H2O，Na2SeO3·5H2O，Na2TeO3。
金属和非金属氧化物和单质的测定采用X射线光电子能谱分析(XPS)技术，通过各元素不同价态的XPS特征峰面积的大小，并利用灵敏度因子计算菌体沉淀物中金属和非金属元素氧化物和单质的含量。
XPS结果表明Pseudomonas alcaliphila sp.MBR能分别将溶液中金属离子，包括Fe(III)，Pb(II)，Co(II)，Ni(II)，Cu(II)，Mn(II)，Cd(II)，Mo(VI)、Ti(IV)还原为金属单质。非金属离子Si(IV)Se(IV)，Te(IV)也能被还原为单质。
本发明用MBR吸附金属的操作和分析方法如下：
首先是菌种的活化，方法和步骤同上。
然后配制150mlNCTS培养基，装入250ml三角瓶中，塞上棉塞，121℃高温灭菌，冷却后接种新培养的Pseudomonas alcaliphila sp.MBR菌种50-200μl，分别加入金属离子溶液20-450mg/L，设定吸附温度28-38℃，摇床50-150rpm，振荡3-5d后将培养液离心收集的沉淀物水洗2-3次，再离心后烘干称重，上清液采用电感耦合等离子发射光谱法(ICP)进行剩余金属离子浓度的检测。通过离子浓度的减少计算出吸附金属量，折算出每克干菌体吸附容量。
Figure A200810044958D00121
本发明所述MBR菌株能够吸附的金属离子有Cu(II)，Zn(II)，Ni(II)，Cd(II)，Fe(III)，Mn(II)，Co(II)，Pb(II)，Al(III)，吸附的方法和步骤同上。其中MBR菌体吸附金属镍离子中镍离子浓度的检测采用丁二酮肟光度法测定，锰离子含量采用高碘酸氧化光度法测定。
金属离子的浓度对菌体的吸附能力有很大的影响，如镍离子浓度在5mM以下，菌体对镍离子具有很好的吸附效果，当镍离子浓度大于5mM，则对菌体产生毒害，影响菌体生长。
本发明也可通过不同投加方式完成对金属离子的吸附(以Ni(II)为例)，具体操作如下：
将活化菌种接种入灭菌NCTS液体培养基中，设定培养条件28-38℃，摇床50-150rpm，振荡培养3d后再加入不同浓度的NiCl2·6H2O，分别经过2h、24h、48h、72h的吸附，通过丁二酮肟光度法检测金属离子的含量，结果表明，经过2h的吸附，吸附率为66％-81％，24h后吸附率达到91％-96％，见表3。
表3 不同吸附时间对金属离子吸附效果的影响
Figure A200810044958D00131
由于能够通过生长细胞好氧吸附，是活菌体吸附，因此本发明可在上述培养液中继续添加金属离子连续吸附。
本发明的优点在于：
1、由于金属离子Fe(III)，Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)还原为单质的电极电位很低，到目前为止，还没有发现通过微生物还原低电极电位金属元素电极反应现象的报道。而本发明所述Pseudomonas alcaliphila sp.MBR却能直接还原溶液中金属离子Fe(III)，Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)为金属单质，处理成本大大降低且可以回收金属资源。
2、特别是在非金属硅的生物还原中，到目前为止，国内外还没有任何相关报道。这对于利用生物还原途径生产硅，用于半导体、光电材料以及食品添加剂等领域具有重要意义。
3、本发明的另一优点是所述菌株还原金属离子为单质是在好氧条件下完成的，条件容易控制。而公开文献中大多数高价态金属离子还原为低价态是在严格厌氧条件下进行的。
4、本发明采用的MBR菌株是在好氧条件下活菌体吸附，较死细胞材料金属吸附容量增大，且可循环使用，处理成本大大降低。
本发明可适用于含金属离子废水的处理(包括电镀废水、金属冶炼、金属加工等)以及土壤和水体中有害金属离子、非金属离子的去除。
附图说明
图1为MBR菌的扫描电镜图；图2为MBR菌的生长曲线；
图3为MBR菌还原Mn(II)的XPS图；图4为MBR菌还原Mn(II)的透射电镜图；
图5为MBR菌还原Cu(II)的XPS图；图6为MBR菌还原Cd(II)的XPS图；
图7为MBR菌以含Se(IV)生长培养基的菌落图；图8为MBR菌还原Te(IV)的XPS图；
图9为MBR菌还原Si(IV)的XPS图；图10为MBR菌还原Si(IV)的透射电镜图；
图11为MBR吸附Ni(II)透射电镜图；图12为不同浓度Ni(II)对菌体吸附能力的影响；
图13为不同浓度Mn(II)对菌体吸附能力的影响
具体实施方式
实施例1：Pseudomonas alcaliphila sp.MBR的培养
1、菌种：Pseudomonas alcaliphila sp.MBR
2、培养基(NCTS)：KNO3 1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，CaCl2·2H2O 0.2g，柠檬酸三钠5.13g，蒸馏水1000ml。
3、摇床培养：
将斜面菌种接种2环于100ml液体培养基中，置于28℃，110rpm摇床振荡培养3d，然后按0.2％接种量转接到新鲜培养基中培养48h，重复2次即可获得用于金属还原菌种，菌的生长曲线如图2所示。
实施例2：MBR还原硝酸盐产氨特性
将平板上菌落接种到NCTS液体培养基中，以柠檬酸钠为碳源，28℃培养48h后分别通过纳氏试剂光度法测定氨态氮；N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定亚硝态氮；紫外分光光度法测定硝酸盐氮。分别进行了好氧和厌氧实验，结果表明厌氧条件下生长速率和硝酸盐还原速率远不及好氧，好氧条件下硝酸盐能完全还原，氨积累达到28.2％。结果如表4所示。
表4 72h好氧和厌氧条件下MBR生长和产氨结果
Figure A200810044958D00141
a：NH4 +-N转化率只包括溶液中硝酸盐还原为可溶性氨氮的部分
实施例3：Fe(III)的还原
配制NCTS培养基100ml，装入250ml三角瓶中，塞上棉塞，121℃高温灭菌，冷却后接种新培养的Pseudomonas alcaliphila sp.MBR菌种200μl，加入金属盐FeCl3·6H2O至2mM，28℃，110rpm，培养5d后静置，菌体呈絮状沉淀，将沉淀物离心，去离子水洗涤(重复1-2次)的样品冷冻干燥后，进行X射线光电子能谱分析(XPS)，分析结果表明沉淀中Fe(III)50.15％，Fe(0)49.85％。几乎一半的Fe(III)被还原成单质铁。
实施例4：Mn(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为MnSO4·H2O，浓度为2mM，培养条件及样品制备同实施例3。XPS检测结果如图3，结果表明沉淀中，Mn(II)17.12％，Mn(0)82.88％，即82.88％的Mn(II)被还原为单质锰。透射电镜图如4
实施例5：Cu(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为CuSO4·5H2O，浓度为2mM，XPS检测结果如图5，结果表明沉淀中，Cu(II)21.73％，Cu(0)78.27％，即78.27％的Cu(II)被还原为单质铜。
实施例6：Ni(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为NiCl2·6H2O，浓度为2mM，XPS检测结果沉淀中，Ni(II)25.02％，Ni(0)74.98％，即74.98％的Ni(II)被还原为单质镍。
实施例7：Cd(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为3CdSO4·8H2O，浓度为1mM，XPS检测结果如图6，结果表明沉淀中，Cd(II)0％，Cd(0)100％，Cd(II)完全被还原成单质镉。
实施例8：Co(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为CoCl2·6H2O，浓度为2mM，XPS检测结果沉淀中，Co(II)40.96％，Co(0)59.04％，即59.04％的Co(II)被还原为单质钴。
实施例9：Mo(VI)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为Na2MoO4·2H2O，浓度为2mM，XPS检测结果沉淀中，Mo(VI)63.08％，Mo(0)36.92％，即36.92％的Mo(VI)被还原为单质钼。
实施例10：Pb(II)的还原
方法步骤同实施例3，其中金属盐为Pb(NO3)2，浓度为2mM，XPS检测结果沉淀中Pb(II)76.92％，Pb(0)23.08％，即23.08％的Pb(II)被还原为单质铅。
实施例11：Ti(IV)的还原
1、取Ti(SO4)2溶液(15-18％)0.5ml至150ml三角瓶中，加入氨水(25-28％)1.7ml，再加入4.0ml乳酸(85-90％)，加水约150ml，并逐渐水浴加热至70℃，待混浊变澄清即获得2mMTi(SO4)2溶液。
2、如步骤1中配制的150ml2mM Ti(SO4)2溶液中加入KH2PO4300mg，MgSO4 150mg，FeCl3·6H2O7.5mg，CaCO3 1.5mg，混合均匀，调节pH7.0，塞上棉塞，于121℃高温灭菌20min，冷却后接种200μlPseudomonas alcaliphila sp.MBR菌种，置于110rpm，28℃摇床振荡培养，5d后将收集沉淀物，将其离心，去离子水洗涤2-3次，再离心，将离心获得的沉淀物冷冻干燥后进行X射线光电子能谱分析(XPS)检测金属离子价态。结果沉淀物中Ti(IV)69.02％，Ti(0)30.98％，即30.98％的Ti(IV)被还原成单质。
实施例12：Se(IV)的还原
方法步骤同实施例3，其中非金属离子为Na2SeO3·5H2O，浓度为2mM，28℃，110rpm摇床振荡培养2d后培养液变成红色，5d后静置，收集沉淀物，离心，去离子水洗涤，再离心获得沉淀物。XPS分析结果表明沉淀物中有Se(IV)占75.61％，Se(0)24.39％，部分Se(IV)被还原为Se(0)。MBR菌在含Se(IV)固体培养基上的生长如图7。
同时本发明所述培养基中MgSO4·7H2O由1.0g减为0.01g，同时补充K2SO4硫酸钾0.99g，以消除硫酸根离子的影响，其他组分和条件保持不变。操作同上，结果表明减少Mg离子，菌的生长与对照比较明显减慢，生长周期延长。从XPS分析结果也可以看出培养基中减少Mg对金属的还原能力影响很小，沉淀物中Se(IV)68.65％，Se(0)22.16％。
实施例13：Te(IV)的还原。
方法和步骤同实施例3，其中非金属离子为Na2TeO3，浓度为2mM，28℃，110rpm摇床振荡培养2d后培养液变成黑色，5d后静置，收集沉淀物，离心，去离子水洗涤，再离心获得沉淀物。将沉淀物冷冻干燥后进行X射线光电子能谱分析(XPS)，如图8，分析结果表明沉淀中Te(IV)占22.87％，Te(0)77.13％，大部分Te(IV)被还原成单质Te(0)。
同时本发明所述培养基中MgSO4·7H2O由1.0g减为0.01g，同时补充K2SO4硫酸钾0.99g，以消除硫酸根离子的影响，其他组分和条件保持不变。操作同上，结果表明减少Mg离子，4d后菌体都没有生长，5d后溶液开始变黑，菌体的生长周期延长。从XPS分析结果也可以看出培养基中减少Mg对金属的还原能力有明显影响，Te(0)仅占31.35％，Te(IV)占68.65％。
实施例14：Si(IV)的还原
1、250ml三角瓶中配制本发明中所述培养基100ml，盖上棉塞，121℃高温灭菌，冷却后接种新培养的Pseudomonas alcaliphila sp.菌种200μl，加入5mM Na2SiO3·9H2O，置于28℃，110rmp摇床振荡培养，2d后培养液变成混浊，5d后静置，收集沉淀物，离心，去离子水洗涤，再离心即获得沉淀物。将沉淀物冷冻干燥后进行X射线光电子能谱分析(XPS)，如图9，分析结果表明沉淀中Si(IV)占79.16％，Si(0)(20.84％)，部分被还原成单质。Si还原透射电镜照片如图10。
2、在上述步骤中培养基KH2PO4由1.0g减少为0.1g，加入1mM Na2SiO3·9H2O，其他组分和条件保持不变。结果表明减少P对菌体生长影响不显著。结果如表5所示。
表5 还原条件的改变对还原效果的影响
Figure A200810044958D00161
Sia：NCTS培养基
Sib：NCTS培养基中MgSO4·7H2O由1.0g减为0.01g。
实施例15：Cu(II)的吸附
配制150mlNCTS培养基，装入250ml三角瓶中，塞上棉塞，121℃高温灭菌，冷却后接种新培养的Pseudomonas alcaliphila sp.菌种200μl，加入5mM CuSO4·5H2O(测定铜离子的初始浓度为294mg/L)，设定吸附温度28℃，110rpm，经过5d后将培养液离心获得的沉淀物水洗2-3次，再离心后烘干称重，上清液进行剩余金属离子浓度的检测。
检测结果表明经过菌体的吸附作用后，铜离子的初始浓度由294mg/L降低为8.13mg/L，铜离子去掉285.87mg/L，150ml培养液菌体和吸附的铜总重0.169g，吸附的铜离子的重量为42.88mg，菌体自身重量为0.126g。即本发明所述菌体吸附铜离子的吸附容量为340mg/g干菌体。
实施例16：Zn(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入10mM ZnSO4·7H2O，经过菌体吸附作用后，锌离子的初始浓度由424.5mg/L降低为0.332mg/L，150ml培养液菌体和吸附的锌总重0.235g，吸附的锌离子的重量为63.63mg，菌体自身重量为0.17g。即本发明所述菌体吸附锌离子的吸附容量为372.35mg/g干菌体。
实施例17：Ni(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入3mM NiCl2·6H2O，经过菌体吸附作用后，镍离子的初始浓度由161.4mg/L降低为6.415mg/L，150ml培养液菌体和吸附的镍总重0.16g，吸附的镍离子的重量为23.25mg，菌体自身重量为0.137g。即本发明所述菌体吸附镍离子的吸附容量为169.75mg/g干菌体。菌体吸附Ni(II)透射电镜照片如图11。
实施例18：Cd(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入1mM 3CdSO4·8H2O，经过菌体吸附作用后，镉离子的初始浓度由111mg/L降低为1.14mg/L，150ml培养液菌体和吸附的镍总重0.147g，吸附的镍离子的重量为16.48mg，菌体自身重量为0.131g。即本发明所述菌体吸附镍离子的吸附容量为125.87mg/g干菌体。
实施例19：Fe(III)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入4mMFeCl3·6H2O，经过菌体吸附作用后，铁离子的初始浓度由224mg/L降低为0.122mg/L，150ml培养液菌体和吸附的铁总重0.493g，吸附的铁离子的重量为33.58mg，菌体自身重量为0.46g。即本发明所述菌体吸附铁离子的吸附容量为73.1mg/g干菌体。
实施例20：Mn(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入2mM MnSO4·H2O，经过菌体吸附作用后，锰离子的初始浓度由94.4mg/L降低为5.09mg/L，150ml培养液菌体和吸附的锰总重0.09g，吸附的锰离子的重量为13.4mg，菌体自身重量为0.075g。即本发明所述菌体吸附锰离子的吸附容量为178.85mg/g干菌体。
实施例21：Co(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入2mMCoCl2·6H2O，经过菌体吸附作用后，钴离子的初始浓度由119mg/L降低为11.8mg/L，150ml培养液菌体和吸附的钴总重0.157g，吸附的钴离子的重量为16.08mg，菌体自身重量为0.14g。即本发明所述菌体吸附钴离子的吸附容量为114.51mg/g干菌体。
实施例22：Pb(II)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入1mMPb(NO3)2，经过菌体吸附作用后，铅离子的初始浓度由186.78mg/L降低为0.418mg/L，150ml培养液菌体和吸附的铅总重0.183g，吸附的铅离子的重量为27.95mg，菌体自身重量为0.155g。即本发明所述菌体吸附铅离子的吸附容量为180.18mg/g干菌体。
实施例23：Al(III)的吸附
方法和步骤同实施例15，加入1mM Al2(SO4)3，经过菌体吸附作用后，铝离子的初始浓度由92.8mg/L降低为3.28mg/L，150ml培养液菌体和吸附的铝总重0.123g，吸附的铝离子的重量为13.43mg，菌体自身重量为0.11g。即本发明所述菌体吸附铝离子的吸附容量为122.1mg/g干菌体。
实施例24：以Ni(II)为例，金属离子浓度对MBR吸附能力的影响
100ml NCTS培养基分装于250ml三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后接入200μl菌种，然后分别加入NiCl2·6H2O，使其Ni2+初始浓度分别为0.5mM、1.0mM、2mM、5mM、7mM，置于28℃，110rpm摇床振荡培养。
采用丁二酮肟光度法每天检测溶液中Ni2+的含量，结果表明，第1、2天Ni2+几乎没有变化，到第3天，初始浓度5mM以下的Ni2+迅速减少，而到了5mM以上对菌体有了毒害，Ni2+没有变化。如图12。
实施例25：以Mn(II)为例，金属离子浓度对MBR吸附能力的影响
方法和步骤同实施例24。采用高碘酸氧化光度法测定锰离子的含量。结果表明，锰离子浓度越高，吸附时间越长，当锰离子浓度超过7mM时，完全不能吸附，如图13。

Claims (8)

1、一株假单胞菌，其特征是：拉丁文学名Pseudomonas alcaliphila sp.MBR，保藏号为CGMCC No.2318，对金属离子或/和非金属离子具有还原能力，对金属离子具有吸附能力；菌落白色，菌落边缘不整齐，但光滑湿润，有光泽，黏稠不透明；培养该细菌的培养基NCTS成分为：KNO3 0.5-1.0g，KH2PO4 0.1-1.0g，MgSO4·7H2O 0.01-1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，CaCl2·2H2O0.2g，柠檬酸三钠0.9-6.9g，蒸馏水1000ml。
2、权利要求1所述的假单胞菌，其特征是：该细菌在好氧条件下，既能还原硝酸盐产生氨，也能把金属离子或/和非金属离子还原为单质。
3、权利要求1所述的假单胞菌，其特征是：还原的金属离子有Fe(III)，Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)；还原的非金属离子有Si(IV)，Se(IV)，Te(IV)。
4、权利要求1和3所述的假单胞菌，其特征是：还原金属Ti(IV)的步骤和方法如下：
①取百分比浓度为15-18％Ti(SO4)2溶液按1：0.25-3加入百分比浓度为25-28％氨水形成偏钛酸，偏钛酸溶解于浓度为85-90％的乳酸，其加入量为Ti(SO4)2溶液的7-10倍，加水，并逐渐水浴加热至70℃，待混浊变澄清即获得可溶性鳌合钛溶液；
②配制的150ml 2mM Ti(SO4)2溶液中加入KH2PO4300mg，MgSO4 150mg，FeCl3·6H2O7.5mg，CaCO3 1.5mg，混合均匀，调节pH7.0，塞上棉塞，于121℃高温灭菌20min，冷却后接种200μl-500μl Pseudomonas alcaliphilasp.MBR菌种，置于110rpm，28℃摇床振荡培养，3-5d后经离心、去离子水洗、再离心，收集沉淀物。
5、权利要求1和3所述的假单胞菌，其特征是：还原其它金属离子或/和非金属离子的步骤和方法如下：
①将斜面保存的菌株接种于经灭菌的LB液体培养基中，置于28℃，110rpm摇床振荡培养3d进行菌种的活化，然后按0.2％接种量转接到NCTS液体培养基中培养48h；
②配制培养基NCTS，121℃高温灭菌20min，待培养基冷却后，接种步骤①中新培养的MBR菌种50-200μl；
③在步骤②所述培养基中加入金属离子或非金离子，在pH 6.0-10.0，温度28-38℃，100-150rpm摇床振荡培养3-5d后经离心、去离子水洗、再离心，收集沉淀物。
6、权利要求1所述的假单胞菌，其特征是：吸附的金属离子有Cu(II)，Zn(II)，Ni(II)，Cd(II)，Fe(III)，Mn(II)，Co(II)，Pb(II)，Al(III)。
7、权利要求1所述的假单胞菌，其特征是：吸附金属离子的方法为：
①菌种的活化，将斜面保存菌株接种于经灭菌的LB液体培养基中，置于28℃，110rpm摇床振荡培养3d，然后按0.2％接种量转接到NCTS液体培养基中培养48h获得用于吸附菌种；
②配制NCTS培养基，121℃高温灭菌，冷却后接种步骤①中新培养的MBR菌种，加入浓度为20-450mg/L金属离子，在温度28-38℃，50-150rpm摇床振荡培养3-5d后经离心、去离子水洗、再离心，收集沉淀物，溶液中金属离子得到去除。
8、权利要求1或2或3所述的假单胞菌在生物还原和生物吸附中的用途，其特征是：用于生物冶金、生产金属及非金属单质、环境中含金属离子废水处理，以及土壤和水体中有害金属离子、非金属离子的去除。
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