CN113732052A

CN113732052A - 假单胞菌土壤修复剂及其在修复重金属污染土壤中的应用

Info

Publication number: CN113732052A
Application number: CN202111136022.7A
Authority: CN
Inventors: 陈华; 贾冰阳
Original assignee: Zhongke Yunheng Chengdu Environmental Technology Co ltd
Current assignee: Zhongke Yunheng Chengdu Environmental Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-09-27
Also published as: CN113732052B

Abstract

本发明提供了一种假单胞菌土壤修复剂及其在修复重金属污染土壤中的应用。该土壤修复剂包括微生物修复剂和化学修复剂，微生物修复剂为假单胞菌MBR和黎巴嫩假单胞菌MY按重量比1:3的混合物，化学修复剂为壳聚糖、鸟粪石、海泡石和干酪素按重量比1:1.5:1.2:2的混合物；所述微生物修复剂与化学修复剂的重量比为1:1.2。本发明提供的土壤修复剂充分发挥了两种假单胞菌的微生物修复功效，同时高效发挥出化学修复剂的功效，二者起到相互促进和协同增效的作用，能够对于多种重金属污染的复杂土壤有很好的修复效果。另外，本发明提供的土壤修复剂还能够很好用于水污染的治理，是一种具有很好使用前景的微生物修复剂。

Description

假单胞菌土壤修复剂及其在修复重金属污染土壤中的应用

技术领域

本发明属于生物修复技术领域，具体涉及一种假单胞菌土壤修复剂及其在修复重金属污染土壤中的应用。

背景技术

重金属污染指的是比重大于5的金属或其他类型化合物对环境造成的污染，重金属污染近年来已经成为人们越来越重视的环境问题之一，无论是在水资源还是在土壤资源中都广泛存在着重金属污染。在土壤资源中的重金属污染物主要有铅、汞、砷、铜、镉等；在水资源中的重金属污染物主要有砷、汞、镉、铅、铬、铜、锌、镍、锰、银等。重金属污染与其他类型的有机化合物污染有所不同，因为部分其它化合物能够通过自然的自身净化能力将有害物质降解，而重金属具有富集性，通过环境的自净化能力难以化解，且在土壤中分布很广，一旦环境产生变化，重金属形态转换，就会造成严重的环境污染。

土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，土壤重金属污染是全球面临的一个重大环境问题，不仅严重影响土壤质量和地力提升，还会危及生态与食品安全和人体健康。

土壤重金属污染产生的主要原因有两方面，一方面是自然因素，另一方面是人为因素。在自然因素中主要是成土母质的风化过程以及风力和水力的自然物理、化学迁移过程会对土壤重金属含量造成影响。人为因素中人类生产生活活动都会对土壤中的重金属含量造成影响，如工矿企业生产、农业生产活动以及交通运输等都会在一定程度上增加土壤中重金属物的含量。另外，电子产品中携带着大量的铅，若在弃用后没有得到合理处理，其中的重金属物就会逐渐深入土壤，最终造成污染影响，目前电子产品带来的土壤重金属污染已成为一个重要的污染途径。

植物生长的好坏直接受到土壤质量的影响，土壤污染会影响粮食产量，若植物种子中重金属含量过高，种植初期会产生出芽率低的情况，即便出芽，叶片也呈现枯萎和卷曲的状态，植物光合作用缓慢，最终就会导致根系发育不够完全，甚至引起植物枯萎死亡。不仅如此，土壤中的重金属会被植物吸收，影响牲畜和人类健康。因此，土壤重金属污染亟待进行治理。

目前，土壤重金属污染的治理措施主要分为以下四种：(1)工程治理技术；(2)物理治理技术；(3)化学治理技术；(4)生物治理技术。分别阐述如下：

(1)工程治理技术最常见的方法有换土法、客土法和深耕翻土法等。换土法是将没有受到污染的土壤放在被污染土壤当中，通过增加土壤的方式来降低重金属污染物在土壤当中的浓度。客土法是将被污染的土壤挖出并迁移至其它地区，在原来被污染的土壤区域中放置干净的土壤。深耕翻土法则是借助机械设备将被污染的土壤置于最底部，通过这样的方式来保持其他土壤层的洁净度。工程治理技术虽然实践起来较为稳定、彻底，但治理过程中需要耗费大量的人力和物力，还有可能会对土壤质量造成消极影响，在破坏土体结构的情况下导致土壤肥力下降，最后还需要解决被污染土壤的堆放问题。

(2)物理治理技术总的来说有以下三种方式：①电动修复技术，其是利用电流将土壤中的重金属离子和无机离子通过电渗透和电迁移向电极移动，最终便于集中收集处理；②电热修复技术，其是利用高频电压来产生电磁波，利用电磁波实现对土壤的加热，在达到一定温度后，土壤内部的重金属污染物就会解吸出来，部分具有较强挥发性的重金属污染物就会和土壤分离，最终实现对被污染土壤的治理； ③土壤淋洗技术，其是在淋洗液的作用下将土壤固相中的重金属污染物转移到土壤液相中去，并回收处理含有重金属污染物的废水。物理治理技术存在适用范围不广泛，在治理过程中需要投入大量能源的问题。

(3)化学治理技术主要是在化学药剂的使用下进行，其原理是主要通过氧化还原、吸附和沉淀来改变土壤中重金属污染物的含量。如通过化学改良剂来有效改变土壤中重金属污染物的形态，使污染物发生钝化。但化学改良剂主要改变的是重金属污染物在土壤中的形态，对于其在土壤中的数量、浓度并没有做出任何改变，重金属污染物依然存在着再次活化的可能性，从而对土壤造成损害。

(4)生物治理技术主要包括植物修复法和微生物修复法两种。植物修复法主要是利用自然植物来修复被重金属污染的土壤，与传统修复方法相比，植物修复法因其绿色环保、高效、成本低等优点而受到广泛关注。然而，在植物生长过程中经常会遇到由气候因素诱导的非生物胁迫条件，例如盐渍、干旱和极端温度等，因此严重阻碍了植物的生长及其修复效率，进而制约了植物修复技术的实际应用。微生物修复法指的是在受到污染的土壤中添加微生物，利用微生物对重金属的亲合、吸附、转化效应，降低土壤中重金属的有效浓度。对于重金属污染不严重的土壤，使用微生物修复法基本能够将土壤状态恢复到原样，且微生物技术符合绿色治理的原则，不仅不会造成土壤的负担，还能够随着时间的推移促使治理效果越来越好。微生物修复法治理土壤重金属污染具有成本低、效率高、不需要停耕、可进行原位修复、对土壤环境影响小、同时能改善土壤环境、提升土壤肥力等诸多优点，但微生物修复法同时具有对重金属固定性有限、代谢能力不佳、微生物流逝或被吞噬等缺点。

微生物以其物种多样性、功能多样性、易培养、生长速度快等特点受到人们广泛关注，利用微生物治理土壤重金属污染被认为是一种具有广阔应用前景的修复方法。现代生物学研究显示，微生物能够对重金属离子实现有效的处理，主要是归结于微生物对重金属离子的吸附作用和沉淀作用。

微生物对重金属离子的吸附作用，是指利用某些微生物本身的化学成分和结构特性来吸附废水中的重金属离子，通过固液两相分离达到去除废水中的重金属离子的目的。生物吸附剂为自然界中丰富的生物资源，如藻类、地衣、真菌和细菌等。微生物结构的复杂性以及同一微生物和不同金属间亲和力的差别决定了微生物吸附金属的机理非常复杂，至今尚未得到统一认识。

微生物对重金属离子的沉淀作用，一般认为是由于微生物对金属离子的异化还原作用或是由于微生物自身新陈代谢的结果。一方面，一些微生物可分泌特异的氧化还原酶，催化一些变价金属元素发生氧化还原反应，或者其代谢产物或细胞自身的某些还原物直接将毒性强的氧化态的金属离子还原为无毒性或低毒性的离子；另一方面，一些微生物的代谢产物(如硫离子、磷酸根离子)与金属离子发生沉淀反应，使有毒有害的金属元素转化为无毒或低毒金属沉淀物。

对于微生物修复法而言，其主要是依赖于获得活性高和代谢能力高的微生物，以及合理制备相应的生物吸附剂。但由于微生物的复杂性，国内外学者对于微生物修复法在土壤重金属污染的具体应用仍在不断深入，植物与微生物之间或是生物吸附剂之间的相互作用对植物生长、重金属吸收和修复效率的影响仍有待进一步研究。

假单胞菌属是微生物的重要类群，也是分布最广的微生物之一。假单胞菌广泛分布于土壤、淡水、海水以及生物体中，属革兰氏阴性菌，细胞单个，多为直的或弯的杆菌，大小为(0.5-1)μm×(1.4-4) μm，单鞭毛或多鞭毛，不产生鞘或突起物。生长温度范围较广，可在4-43℃生长，大多数菌的最适温度在30℃左右。生长的最适pH范围在pH＝7.0-8.5之间，大多数不能在pH≤6的环境下生长。

多样的生境不仅造就了假单胞菌拥有较广的生长温度、pH值范围和较多的营养代谢类型，同时也为人类提供了多样的遗传资源。随着人类对假单胞菌研究的不断深入，假单胞菌在环境生物修复、生物防治、生物转化等领域逐步体现出越来越重要的作用。在环境生物修复领域，E.coli、B.subtilis等模式菌株因野外环境的温度、pH波动较大等原因无法在野外大规模使用，而假单胞菌是自然界的土著微生物，其所具备的生长温度和pH值变化范围较大以及营养代谢类型多样的特点，使得假单孢菌在环境生物修复领域具有较大的优势。世界各国研究者对假单胞菌在环境的生物修复方面进行了广泛的研究。

现有研究表明，假单胞菌对重金属污染环境的生物修复机理包括以下几点：(1)通过表面吸附、胞内沉淀以及成矿作用来降低重金属离子的沉淀性；(2)通过氧化还原反应改变重金属离子的价态而减弱或消除重金属离子的毒性；(3)分泌一些与重金属离子紧密结合的蛋白，而且形成的重金属离子蛋白质复合体不易为动植物吸收，限制了重金属离子在食物链中的流动。目前，国内外用假单胞菌对重金属污染进行环境生物修复主要是利用假单胞菌的某些种对重金属有抗性并可将其在体内富集的特性。如韩国的Oh等对施氏假单胞菌 (P.stutzeri)冻干细胞对Pb²⁺、Cd²⁺和Cu²⁺生物吸附的研究，刘爱民等对耐Cd²⁺假单胞菌吸附Cd²⁺的研究等。

专利文献CN 107129942A公开了一种培养复合菌群快速生长和产酸的方法及得到的复合菌群，该菌群中采用了铜绿假单胞菌 CCTCCAB 2013184，对去除土壤中重金属镉表现出很好的清除效率。

专利文献CN 101892187 B中将一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01菌株用于镉污染土壤的治理，使得接种CH01菌的豇豆根际镉吸附量最高达到16.13±3.80nmol/mg，是对照组的1.75倍，这一方法降低了重金属镉污染土壤的生物毒性，促进了污染区农作物的稳产高产。

专利文献CN 112522166 A公开了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)Z-12，其能够将重金属镉转化为可溶性的镉离子浸出，该假单胞菌Z-12培养周期短，生长速度快，培养基成分简单，成本低，菌液适合的pH值范围对土壤的酸化作用较小，对土壤中弱酸态和铁锰结合态镉转化效率高。

专利文献CN 104357363 A公开了一株假单胞菌 (Pseudomonassp.)CCTCCNO:M2013570，该菌株能在利用多种碳源进行发酵的过程中产生复合表面活性剂，即糖脂和含氨基酸类脂，该菌株及其发酵液和表面活性剂提取物在污水处理、土壤重金属污染治理、果蔬等食品抑菌防腐、洗涤日化等方面有良好的应用前景。

如上所述，虽然假单胞菌在修复土壤重金属污染中的应用已有涉及，并起到了一定的修复效果，但仍然处于摸索阶段，关于假单胞菌在重金属污染土壤中的治理还有诸多问题有待解决和探索。特别的，目前针对于假单胞菌而言，仅仅只开展了单一假单胞菌在土壤重金属污染修复方面的应用，如何利用各假单胞菌株之间各自的优势，充分发挥不同菌株的修复功效；另一方面，由于各种微生物之间相互作用的复杂性，以及微生物修复剂与土壤中原有微生物之间的协同和拮抗作用存在各种不同情形，能否寻找到一种可协同增效的微生物修复剂，能够适用于多种重金属污染的不同受污染程度的土壤进行修复，成为假单胞菌微生物修复剂领域迫切需要开展的研究内容，而该方向的研究尚处于空白。

同时，介于国内外科学工作者对于土壤化学修复剂的研究已有了广泛的历史，一部分化学物质能够作为微生物很好的载体，来发挥微生物修复剂的修复性能，然而对于假单胞菌株而言，其修复载体的研究较少。特别是对于不同种类的假单胞菌株而言，能否寻找到一种能够与不同假单胞菌株之间进行合理复配的化学修复剂组成，不仅能够起到载体的作用，同时还能够通过化学修复来大大提高微生物修复剂的修复效果，二者之间协同增效，相互促进，该方向的研究就更为复杂。以往的研究在针对不同的土壤污染程度中各重金属之间存在相互影响时，微生物修复剂的效果大多容易受到土壤污染程度和环境变化，以及植物生长环境和不同污染条件等因素带来的影响，从而降低了其修复效果。相关研究工作也亟待进一步开展。

因此，能否提供一种优良的微生物修复剂与化学修复剂的组合，以期寻找到一种假单胞菌的复合微生物与化学物质组成的复配土壤修复剂，并将其用于重金属污染的土壤中，复合微生物菌剂之间能够协同增效，同时微生物修复剂与化学修复剂之间也能够起到相互促进的作用，并且其修复效果高效稳定可靠，不会受土壤环境变化和植物生长影响以及不同污染物之间的相互影响，成为本发明亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种假单胞菌土壤修复剂及其在修复重金属污染土壤中的应用。本发明提供的土壤微生物修复剂，是将复配后的假单胞菌与其它化学修复剂再进行组合，本发明人意外地发现，该复合土壤修复剂能够很好用于重金属污染的土壤中，复配后的假单胞菌能够发挥其各自的修复功效，并起到很好的协同增效作用，而假单胞菌复配微生物修复剂与化学修复剂之间又起到很好的促进作用。该土壤修复剂对多种复杂重金属的污染修复效果高效稳定可靠，且不会受土壤环境变化和植物生长影响以及不同污染物之间的相互影响，具有极大的应用前景。

本发明的目的之一是提供一种假单胞菌土壤修复剂，所述土壤修复剂包括微生物修复剂和化学修复剂，所述微生物修复剂为假单胞菌 MBR和黎巴嫩假单胞菌MY按重量比1:3的混合物，所述化学修复剂为壳聚糖、鸟粪石、海泡石和干酪素按重量比1:1.5:1.2:2的混合物；所述微生物修复剂与化学修复剂的重量比为1:1.2。其中，所述假单胞菌MBR的保藏号为CGMCC No.2318，于2008年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心；所述黎巴嫩假单胞菌MY的保藏号为CGMCC No.15613，于2018年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。

专利文献CN 110076193 B中报道了一株黎巴嫩假单胞菌MY(保藏编号：CGMCCNo.15613)，其发明人马莹和张长对该菌株的特性和功能进行了研究，结果发现：黎巴嫩假单胞菌MY对重金属(镉、铬、铜、镍、铅和锌)、抗生素(氨苄西林、链霉素、氯霉素和青霉素)以及盐(8％)均具有较强的抗性，并能够在含盐(3％或6％) 的液体培养基中很好地生长；可以分泌植物生长促进剂，比如1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、吲哚乙酸、铁载体，固氮(Nitrogen fixation) 并能溶解土壤中难溶性磷酸盐以及合成胞外聚合物质；能够在植物根际有效定殖；显著促进修复植物在重金属和盐(单一或复合)胁迫条件下的生长；降低重金属和盐胁迫引起的植物电解质泄漏、脯氨酸和丙二醛的累积；显著提高污染土壤中修复植物对镍和钠的吸收量。

上述专利文献主要报道了黎巴嫩假单胞菌MY在促进植物在重金属污染盐渍土壤上的生长，降低重金属和盐对植物的毒性，提高植物对土壤中重金属和钠离子的吸收能力，因而其是利用该黎巴嫩假单胞菌MY来促进植物的修复效率，其本质仍然是属于植物修复手段，并非是直接利用黎巴嫩假单胞菌MY来处理和吸附重金属离子。本专利的发明人尝试将该黎巴嫩假单胞菌MY直接用于修复重金属污染土壤方面的研究，但遗憾的是，该MY菌株并未表现出可以直接吸附和去除土壤中重金属离子的迹象。

由于该黎巴嫩假单胞菌MY表现出很好的重金属离子抗性和对高盐环境的抗性，因此本发明人又进一步尝试将其与其它微生物菌剂组合，以期获得该黎巴嫩假单胞菌MY可直接用于修复重金属离子的教导。发明人尝试了将黎巴嫩假单胞菌MY与现有报道中具有较好修复效果的多株假单胞菌分别进行一一复配组合，具体包括：恶臭假单胞菌CH01(CN 101892187 B，该基因工程菌CH01可以在多种重金属存在的实验室条件下显著吸附重金属镉，与豇豆、玉米的共生的水培结果显示其可以在植物根际定殖并快速吸附重金属镉)、假单胞菌 HN103(CN 102286405 A，该菌可以耐受高浓度的重金属离子，可在 1000mg/L的镉离子污水中正常生长，具有将镉离子吸附到细胞壁的特性，然后通过沉降、过滤或者固定化细胞等技术移除菌体，可以快速降低水中镉离子的浓度)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ZC6和Zn10(CN 103937702 B，该专利中筛选出了9株Zn²⁺耐受菌，但其中仅有2株表现出了对Zn²⁺的去除能力，其余7株虽然可以在较高浓度Zn²⁺的环境中生长，但是溶液上清中的Zn²⁺含量未见明显减少，其中ZC6对溶液中Zn²⁺的去除率可达到12.6％，Zn10对溶液中 Zn²⁺的去除率仅为2.5％)、假单胞菌CCTCC NO:M2013570(CN104357363A，该菌及其发酵液和发酵提取物适用于水体、土壤等的重金属污染的治理)、铜绿假单胞菌CICC 10351、蜡样芽孢杆菌CICC 21155、葡萄球菌CICC 10311、膜醭毕赤酵母CICC 33242(上述四种菌株均来自文献CN 109486716 B，共同组成的复合微生物菌剂能够快速高效吸附去除重金属离子，对镉、铜、铅、铬等重金属离子都具有较好的吸附去除效果)、假单胞菌Z-12(CN 112522166 A，该菌株能将弱酸态镉和铁锰结合态镉快速转化为可溶性镉，实现高效地移除土壤中镉含量的目的)，然而上述10种菌株与黎巴嫩假单胞菌MY复配时，均不能使得黎巴嫩假单胞菌MY产生出能够吸附和去除重金属离子的功能。

专利文献CN 101531970 B公开了一株假单胞菌Pseudomonas alcaliphilasp.MBR，该菌株能够将溶液中金属离子包括Fe(III)， Mn(II)，Cu(II)，Ni(II)，Cd(II)，Co(II)，Mo(VI)，Pb(II)，Ti(IV)还原为金属单质。此外，该菌株还能够将溶液中Si(IV)，Se(IV)，Te(IV)非金属离子还原为单质，从而去除水体、土壤以及废弃物中的有害 Se(IV)，Te(IV)非金属离子。

本发明人意外地发现，当将上述假单胞菌MBR与黎巴嫩假单胞菌MY进行复配时，通过调整其菌浓度和比例，表现出了使得黎巴嫩假单胞菌MY可吸附去除重金属离子的功能。为了验证该发现是否偶然，发明人进行了大量研究和对比，先是去除假单胞菌MBR，发现经复合培养后的黎巴嫩假单胞菌MY能够单独表现出吸附去除重金属离子的功能，而未经与假单胞菌MBR复合培养的黎巴嫩假单胞菌 MY却无法表现出该功能，因而可能的原因是，假单胞菌MBR和黎巴嫩假单胞菌MY组合在一起时，一定程度上改变了黎巴嫩假单胞菌MY的细胞壁结构，使用重金属离子能够穿透其细胞壁，从而实现对重金属离子的吸附和去除。

进一步研究发现，本发明的上述假单胞菌土壤修复剂配方，其中的假单胞菌MBR除了在好氧条件下能还原硝酸盐产生氨，也能吸附金属离子，还能够还原溶液中金属离子、非金属离子为单质之外，还表现出了对土壤中多种重金属离子高效的吸附去除效率，特别是对于原先未报道的Cr(Ⅲ)和Cr(VI)离子，表现出了很好的吸附效果。而黎巴嫩假单胞菌MY除了具有较强的对重金属、抗生素和盐的抗性，能够促进植物在胁迫条件下的生长，提高植物吸收土壤中重金属镍和钠离子的能力之外，还能够很好用于吸附去除土壤中重金属污染，表现出了对土壤中各种重金属离子高效的吸附去除效果。二者产生了协同增效的作用。

本发明创造性地将这两种假单胞菌进行复合，发现其对于土壤中多种重金属离子能够起到很好的修复作用，大大降低土壤中重金属离子的含量，同时与本发明的化学修复剂组合之后，能够实现对土壤中多种重金属离子包括Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Ni(Ⅱ)，Cd(Ⅱ)，Fe(Ⅲ)，Mn(Ⅱ)， Co(Ⅱ)，Pb(Ⅱ)，Al(Ⅲ)，Se(Ⅳ)，Te(Ⅳ)，Cr(Ⅱ)，Cr(Ⅲ)在内均具有高效的吸收去除效果，两种不同种类的修复剂之间，即微生物修复剂与化学修复剂之间，也起到了很好的促进作用，而原先的微生物修复剂和化学修复剂单独使用时均无法针对于多种金属离子实现本发明的修复效果。特别的，本发明中微生物修复剂与化学修复剂的重量比为1:1.2，二者的比例接近相等，因而本发明是很好的发挥了化学修复剂的修复作用，而并非仅仅是起到了微生物修复剂的载体作用，两种修复剂是共同发挥作用，相互促进，从而协同增效，实现了本发明如此优异的效果。另一方面，本发明土壤修复剂的修复效果不仅高效稳定可靠，而且还不会受土壤环境变化和植物生长影响以及不同污染物之间的相互影响，其重金属污染修复效果极佳，大大超出了原有假单胞杆菌和化学修复剂所能实现的修复效果。

进一步的是，所述微生物修复剂中假单胞菌MBR的菌液浓度为 1.3～2.5×10⁸个/mL，所述黎巴嫩假单胞菌MY的菌液浓度为1.5～2.0 ×10⁸个/mL。

进一步的是，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为20000 Da，其脱乙酰度为80～90％。

进一步的是，所述鸟粪石的硬度为2-3，密度为1.68g/cm³，鸟粪石中六水合磷酸镁铵的纯度≥92％。

进一步的是，所述海泡石为纤维状海泡石，其SiO₂的含量为 55％。

进一步的是，所述干酪素采用粉碎后的干酪素粉，其粒径为100 μm。

本发明的目的之二是提供一种如上所述假单胞菌土壤修复剂的制备方法，其是将所述化学修复剂中各原料进行混合，将所述微生物修复剂进行菌种培养，达到所述菌液浓度后再与所述化学修复剂进行混合。

本发明的目的之三是提供一种如上所述假单胞菌土壤修复剂的应用，其是将该土壤修复剂用于重金属污染的治理，所述重金属包括 Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Ni(Ⅱ)，Cd(Ⅱ)，Fe(Ⅲ)，Mn(Ⅱ)，Co(Ⅱ)，Pb(Ⅱ)， Al(Ⅲ)，Se(Ⅳ)，Te(Ⅳ)，Cr(Ⅱ)，Cr(Ⅲ)中的至少一种。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种假单胞菌土壤修复剂，其是一种微生物修复与化合修复相结合的土壤修复技术，二者之间能够起到协同增效作用；

(2)本发明提供的假单胞菌土壤修复剂，能够对土壤中多种重金属离子如Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Ni(Ⅱ)，Cd(Ⅱ)，Fe(Ⅲ)，Mn(Ⅱ)，Co(Ⅱ)， Pb(Ⅱ)，Al(Ⅲ)，Se(Ⅳ)，Te(Ⅳ)，Cr(Ⅱ)，Cr(Ⅲ)等，以及多种金属离子的组合污染物，均起到高效的去除效果；

(3)本发明提供的假单胞菌土壤修复剂，不会受土壤环境变化以及不同污染物之间的相互影响，其重金属污染修复效果极佳；同时，本发明的修复剂也能够很好用于水污染中重金属的治理，其应用范围较广，效果极佳。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

土壤修复剂及供试土壤的准备：

一、土壤修复剂-O的制备：

(一)假单胞菌MBR的培养：

本发明的假单胞菌MBR保藏号为CGMCC No.2318，于2008年 1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，来源于成都固体废弃物卫生处置场垃圾渗滤液，由中国科学院成都生物研究所分离获得。

在无菌条件下将MBR菌株接种于经灭菌的100mL LB液体培养基中(LB培养基成分为：每升含5g酵母提取物，10g胰蛋白胨， 10g NaCl)，置于28℃，110rpm摇床振荡培养3d进行菌种的活化，然后按0.2％接种量转接到NCTS液体培养基(NCTS液体培养基成分为：KNO₃1.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.05g， CaCl₂·2H₂O 0.2g，柠檬酸三钠6.9g，蒸馏水1000mL)中培养至生长对数期，采用稀释平板计数测定细菌数量，获得菌液浓度为2.5× 10⁸个/mL的假单胞菌MBR悬浮液，备用。

(二)黎巴嫩假单胞菌MY的培养：

本发明的黎巴嫩假单胞菌MY的保藏号为CGMCC No.15613，于2018年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，来源于葡萄牙东北部山区蛇纹岩发育土壤(41°46′ 30″N；6°53′55″W)上生长的三叶草的根际土壤，由马莹和张长分离获得。

在无菌条件下将MY菌株接种于LB液体培养基中(LB液体培养基配方为：每升含5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl)， 28℃下200rpm振荡培养至对数生长期，离心后收集菌体，并用磷酸盐缓冲液反复洗涤3次，采用稀释平板计数测定细菌数量，得到含菌量为2.0×10⁸个/mL的黎巴嫩假单胞菌MY菌悬液，备用。

(三)土壤修复剂的制备：

(1)将上述方法获得的假单胞菌MBR和黎巴嫩假单胞菌MY 菌悬液按重量比1:3进行混合，得到微生物修复剂。

(2)将壳聚糖(低分子量壳聚糖，分子量为20000Da，脱乙酰度为90％)、鸟粪石(硬度为3，密度为1.68g/cm³，六水合磷酸镁铵的纯度92％)、海泡石(纤维状海泡石，其SiO₂的含量为55％) 和干酪素(干酪素粉，粒径为100μm)按重量比1:1.5:1.2:2进行混合，得到化学修复剂。

(3)将上述化学修复剂与微生物修复剂按照质量比1.2:1混合，得到本发明的土壤修复剂-O，备用。

上述土壤修复剂在土壤重金属去除试验前制备。

二、供试土壤的准备

供试土壤采自四川农业大学标准试验田。土壤基本理化性质为： pH 7.1，有机质43.52％，全氮2.65g·kg^-1，全磷0.72g·kg^-1，有效钾27.56g·kg^-1。土壤未受重金属污染，将该土壤筛分(2mm)，连续三天在100℃下灭菌1小时，备用。

实施例2

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Mn污染：

在上述供试土壤中加入MnSO₄·H₂O溶液，以使得土壤中Mn(Ⅱ) 的初始浓度为350mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Mn(Ⅱ)的最终浓度为 1.2mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Mn(Ⅱ)的去除率高达99.66％。

实施例3

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Cu污染：

在上述供试土壤中加入CuSO₄·5H₂O溶液，以使得土壤中Cu(Ⅱ) 的初始浓度为380mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cu(Ⅱ)的最终浓度为0.32 mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cu(Ⅱ)的去除率高达 99.92％。

实施例4

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Fe污染：

在上述供试土壤中加入FeCl₃·6H₂O溶液，以使得土壤中Fe(Ⅲ) 的初始浓度为460mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Fe(Ⅲ)的最终浓度为 1.5mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Fe(Ⅲ)的去除率高达 99.67％。

实施例5

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Zn污染：

在上述供试土壤中加入ZnSO₄·7H₂O溶液，以使得土壤中Zn(Ⅱ) 的初始浓度为500mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的1.5％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Zn(Ⅱ)的最终浓度为 1.3mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Zn(Ⅱ)的去除率高达 99.74％。

实施例6

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Ni污染：

在上述供试土壤中加入NiCl₂·6H₂O溶液，以使得土壤中Ni(Ⅱ) 的初始浓度为220mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的1％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Ni(Ⅱ)的最终浓度为 0.11mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Ni(Ⅱ)的去除率高达99.95％。

实施例7

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Cd污染：

在上述供试土壤中加入3CdSO₂·8H₂O溶液，以使得土壤中Cd(Ⅱ) 的初始浓度为300mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的1.2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cd(Ⅱ)的最终浓度为 0.18mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cd(Ⅱ)的去除率高达99.94％。

实施例8

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Pb污染：

在上述供试土壤中加入Pb(NO₃)₂溶液，以使得土壤中Pb(Ⅱ)的初始浓度为260mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的1％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Pb(Ⅱ)的最终浓度为0.21mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Pb(Ⅱ)的去除率高达99.92％。

实施例9

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Co污染：

在上述供试土壤中加入CoCl₂·6H₂O溶液，以使得土壤中Co(Ⅱ) 的初始浓度为290mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的1％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Co(Ⅱ)的最终浓度为 0.25mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Co(Ⅱ)的去除率高达99.91％。

实施例10

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Al污染：

在上述供试土壤中加入Al₂(SO₄)₃溶液，以使得土壤中Al(Ⅲ)的初始浓度为600mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Al(Ⅲ)的最终浓度为0.84mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Al(Ⅲ)的去除率高达99.86％。

实施例11

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Cr(Ⅲ)污染：

在上述供试土壤中加入CrCl₃·6H₂O溶液，以使得土壤中Cr(Ⅲ) 的初始浓度为350mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cr(Ⅲ)的最终浓度为 0.51mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cr(Ⅲ)的去除率高达99.85％。

实施例12

土壤修复剂-O用于修复土壤中重金属Cr(VI)污染：

在上述供试土壤中加入Na₂Cr₂O₇·2H₂O溶液，以使得土壤中 Cr(VI)的初始浓度为100mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cr(VI)的最终浓度为 0.22mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cr(VI)的去除率高达99.78％。

实施例13

土壤修复剂-O用于修复土壤中混合重金属污染：

在上述供试土壤中加入CuSO₄·5H₂O、FeCl₃·6H₂O和 3CdSO₂·8H₂O溶液，以使得土壤中Cu(Ⅱ)的初始浓度为260mg·kg^-1、 Fe(Ⅲ)的初始浓度为360mg·kg^-1、Cd(Ⅱ)的初始浓度为220mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2.5％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)的最终浓度分别为0.58mg·kg^-1、 1.47mg·kg^-1、0.25mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cu(Ⅱ)、 Fe(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)的去除率分别为99.77％、99.57％、99.88％，可以看出在3种混合重金属污染条件下，本发明的土壤修复剂对重金属的去除率并未出现下降。

实施例14

土壤修复剂-O用于修复土壤中混合重金属污染：

在上述供试土壤中加入CuSO₄·5H₂O、FeCl₃·6H₂O、 3CdSO₂·8H₂O、Pb(NO₃)₂和Al₂(SO₄)₃溶液，以使得土壤中Cu(Ⅱ) 的初始浓度为260mg·kg^-1、Fe(Ⅲ)的初始浓度为360mg·kg^-1、Cd(Ⅱ) 的初始浓度为220mg·kg^-1、Pb(Ⅱ)的初始浓度为250mg·kg^-1、Al(Ⅲ)的初始浓度为480mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2.5％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3 天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Al(Ⅲ)的最终浓度分别为0.87mg·kg^-1、1.66mg·kg^-1、 0.39mg·kg^-1、0.54mg·kg^-1、1.13mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Al(Ⅲ)的的去除率分别为99.66％、99.53％、99.82％、99.78％、99.76％，可以看出在5种混合重金属污染条件下，本发明的土壤修复剂对重金属的去除率并未出现明显下降。

实施例15

土壤修复剂-O用于修复土壤中混合重金属污染：

在上述供试土壤中加入MnSO₄·H₂O、CuSO₄·5H₂O、FeCl₃·6H₂O、 ZnSO₄·7H₂O、NiCl₂·6H₂O、3CdSO₂·8H₂O、Pb(NO₃)₂、CoCl₂·6H₂O、 Al₂(SO₄)₃和CrCl₃·6H₂O溶液，以使得土壤中Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、 Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)的初始浓度分别为280mg·kg^-1、300mg·kg^-1、260mg·kg^-1、320mg·kg^-1、 440mg·kg^-1、220mg·kg^-1、550mg·kg^-1、310mg·kg^-1、500mg·kg^-1、390mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的3％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、 Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)的最终浓度分别为1.86mg·kg^-1、 0.54mg·kg^-1、0.88mg·kg^-1、0.93mg·kg^-1、1.10mg·kg^-1、0.99mg·kg^-1、 1.54mg·kg^-1、1.83mg·kg^-1、1.97mg·kg^-1、1.41mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、 Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)的去除率分别为99.33％、 99.82％、99.66％、99.70％、99.75％、99.55％、99.72％、99.41％、99.60％、 99.63％，可以看出在10种混合重金属污染条件下，本发明的土壤修复剂对重金属的去除率并未出现明显下降。

实施例16

土壤修复剂-O用于修复土壤中混合重金属污染：

在上述供试土壤中加入CrCl₃·6H₂O和Na₂Cr₂O₇·2H₂O溶液，以使得土壤中Cr(Ⅲ)和Cr(VI)的初始浓度分别为250mg·kg^-1和200 mg·kg^-1。向该土壤试样中添加本发明的土壤修复剂，添加量占土壤试样总重量的2％，混合均匀。向土壤中添加水，保持土壤水分含量为50％，于25℃下于110rpm震荡处理土壤。3天后将土壤试样离心，测定土壤试样中Cr(Ⅲ)和Cr(VI)的最终浓度分别为1.55mg·kg^-1和 2.34mg·kg^-1，表明本发明的土壤修复剂对土壤中Cr(Ⅲ)和Cr(VI)的去除率分别为99.38％和98.83％，可以看出在不同价态重金属污染条件下，本发明的土壤修复剂对重金属的去除率略有下降，去除率仍然很高。

对比例1

将实施例1中的化学修复剂中去掉鸟粪石组分，得到的土壤修复剂-O1用于土壤中重金属污染的去除，方法分别参照上述实施例(结果见表1)，得到对土壤中Mn(Ⅱ)的去除率为80.14％、对土壤中Cu(Ⅱ) 的去除率为82.27％、对土壤中Fe(Ⅲ)的去除率为90.03％、对土壤中 Zn(Ⅱ)的去除率为91.16％，将土壤修复剂-O1与本发明的土壤修复剂相比可以看出，其对重金属离子的去除效率明显下降。

表1

对比例2

将实施例1中的化学修复剂中壳聚糖、鸟粪石、海泡石和干酪素的重量比改为1:1:1:1，得到的土壤修复剂-O2用于土壤中重金属污染的去除，方法分别参照上述实施例(结果见表2)，得到对土壤中 Mn(Ⅱ)的去除率为85.54％、对土壤中Cu(Ⅱ)的去除率为88.31％、对土壤中Fe(Ⅲ)的去除率为91.12％、对土壤中Zn(Ⅱ)的去除率高达 92.27％，将土壤修复剂-O2与本发明的土壤修复剂相比可以看出，其对重金属离子的去除效率明显下降，但与土壤修复剂-O1相比略有提高。

表2

对比例3

将实施例1中的微生物修复剂中的假单胞菌MBR去除，得到的土壤修复剂-O3用于土壤中重金属污染的去除，方法分别参照上述实施例(结果见表3)，得到对土壤中Ni(Ⅱ)的去除率为85.81％、对土壤中Cd(Ⅱ)的去除率为83.34％、对土壤中Pb(Ⅱ)的去除率为89.48％、对土壤中Co(Ⅱ)的去除率为91.17％、对土壤中Al(Ⅲ)的去除率为90.05％、对土壤中Cr(Ⅲ)的去除率为78.84％，将土壤修复剂 -O3与本发明的土壤修复剂相比可以看出，其对重金属离子的去除效率明显下降。

表3

对比例4

将实施例1中的微生物修复剂中的黎巴嫩假单胞菌MY去除，得到的土壤修复剂-O4用于土壤中重金属污染的去除，方法分别参照上述实施例(结果见表4)，得到对土壤中Ni(Ⅱ)的去除率为82.27％、对土壤中Cd(Ⅱ)的去除率为80.08％、对土壤中Pb(Ⅱ)的去除率为 87.78％、对土壤中Co(Ⅱ)的去除率为90.03％、对土壤中Al(Ⅲ)的去除率为84.41％、对土壤中Cr(Ⅲ)的去除率为75.59％，将土壤修复剂 -O4与本发明的土壤修复剂相比可以看出，其对重金属离子的去除效率明显下降。

表4

对比例5

将实施例1中的微生物修复剂中假单胞菌MBR和黎巴嫩假单胞菌MY的重量比改为1:1，得到的土壤修复剂-O5用于土壤中重金属污染的去除，方法分别参照上述实施例(结果见表5)，得到对土壤中Cr(Ⅲ)的去除率为92.55％、对土壤中Cr(VI)的去除率为90.41％、对土壤中Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)和Cd(Ⅱ)的去除率分别为92.11％、93.52％、89.85％(参照实施例13)、对土壤中Cr(Ⅲ)和Cr(VI)的去除率分别为90.15％和82.24％(参照实施例16)，将土壤修复剂-O5与本发明的土壤修复剂相比可以看出，其对重金属离子的去除效率明显下降，且受土壤中重金属离子的复杂程度影响较大。

表5

Claims

1.一种假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述土壤修复剂包括微生物修复剂和化学修复剂，所述微生物修复剂为假单胞菌MBR和黎巴嫩假单胞菌MY按重量比1:3的混合物，所述化学修复剂为壳聚糖、鸟粪石、海泡石和干酪素按重量比1:1.5:1.2:2的混合物；所述微生物修复剂与化学修复剂的重量比为1:1.2；其中，所述假单胞菌MBR的保藏号为CGMCCNo.2318，于2008年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心；所述黎巴嫩假单胞菌MY的保藏号为CGMCC No.15613，于2018年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述微生物修复剂中假单胞菌MBR的菌液浓度为1.3～2.5×10⁸个/mL，所述黎巴嫩假单胞菌MY的菌液浓度为1.5～2.0×10⁸个/mL。

3.根据权利要求1所述的假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述壳聚糖为低分子量壳聚糖，其分子量为20000Da，脱乙酰度为80～90％。

4.根据权利要求1所述的假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述鸟粪石的硬度为2-3，密度为1.68g/cm³，鸟粪石中六水合磷酸镁铵的纯度≥92％。

5.根据权利要求1所述的假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述海泡石为纤维状海泡石，其SiO₂的含量为55％。

6.根据权利要求1所述的假单胞菌土壤修复剂，其特征在于，所述干酪素采用粉碎后的干酪素粉，其粒径为100μm。

7.一种如权利要求1-6任一项所述假单胞菌土壤修复剂的制备方法，其特征在于，是将所述化学修复剂中各原料进行混合，将所述微生物修复剂进行菌种培养，达到所述菌液浓度后再与所述化学修复剂进行混合。

8.一种如权利要求1-6任一项所述假单胞菌土壤修复剂的应用，其特征在于，是将该土壤修复剂用于重金属污染的治理，所述重金属包括Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)、Cr(VI)中的至少一种。