CN112867784A - 用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物 - Google Patents

用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

提供了用于增加微生物的磷酸盐增溶活性的方法和系统。还提供了通过使用所公开的方法和系统鉴别的微生物。所述方法包括以下步骤：鉴别与磷酸盐增溶相关的编码序列、改变所述与磷酸盐增溶相关的编码序列、将经改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列功能性地连接至启动子，以及将处于所述启动子的控制下的所述经改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列引入到所述微生物中，并且所述系统包括针对所述步骤的说明书。对所述编码序列的改变可包括例如原生密码子的密码子随机化、编码序列的缺失和调控序列的插入。

Description

用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月21日提交的美国临时专利申请第62/734,777号的权益，该申请的内容据此整体并入。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式电子提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2019年9月19日，被命名为47736-711_601_SL.txt，并且大小为344,652字节。
背景技术
植物经由共用的代谢物组与微生物组(microbiome)相联系。特定的作物性状与潜在代谢物组之间的多维关系以具有多个局部最大值的情形(landscape)为特征。出于各种原因(诸如为了对作物优化)，可能期望通过改变微生物组对代谢物组的影响来从较低的局部最大值优化至代表较好性状的另一局部最大值。需要在经济、环境和社会方面可持续的农业和食品生产途径，以满足不断增长的全球人口的需求。联合国食品和农业组织(Foodand Agriculture Organization)预计，到2050年，粮食总产量必须增长70％，以满足不断增长的人口的需求，这一挑战因许多因素而加剧，所述因素包括淡水资源减少、对可耕种土地的竞争加剧、能源价格上涨、投入成本增加，以及作物可能需要适应更干燥、更炎热和更极端的全球气候的压力。
磷是作物生产中的关键营养素。磷通常在农业土壤中很丰富；然而，绝大多数以作物植物不可获得的不溶形式被束缚。在一些土壤中，不溶性有机磷和不溶性无机磷可占土壤总磷的高达90％。
发明内容
本公开的一个方面提供了一种通过如下方式增加微生物的磷酸盐增溶活性的方法：从所述微生物中分离出与磷酸盐增溶相关的编码序列；对所述与磷酸盐增溶相关的编码序列进行密码子随机化；将所述与磷酸盐增溶相关的密码子随机化编码序列功能性地连接至启动子；以及将处于所述启动子的控制下的所述与磷酸盐增溶相关的密码子随机化编码序列重新引入到所述微生物中。
本文提供了工程改造的微生物，其包含与磷酸盐增溶相关的基因的改变，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是所述微生物的原生基因，由此与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量(capacity)或速率增溶磷酸盐。
在一些实施方案中，工程改造的微生物包含与磷酸盐增溶相关的基因的改变，其中所述工程改造的微生物是非属间工程改造的微生物，并且其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
在一些实施方案中，与磷酸盐增溶相关的基因是非特异性酸性磷酸酶基因。在进一步的实施方案中，非特异性酸性磷酸酶基因包括phoC、napA、napD、napE、acpA、appA，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，与磷酸盐增溶相关的基因是植酸酶基因。在进一步的实施方案中，植酸酶基因是appA、phy，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，与磷酸盐增溶相关的基因是葡糖酸生物合成基因。在进一步的实施方案中，葡糖酸生物合成基因是pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gcd、gabY，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，与磷酸盐增溶相关的基因是葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，或它们的功能变体，或它们的任何组合。在进一步的实施方案中，与缺乏所述与磷酸盐增溶相关的基因的改变的相同物种的微生物相比，工程改造的微生物包含与磷酸盐增溶相关的基因的表达的改变。
在一些实施方案中，与磷酸盐增溶相关的基因的改变包括调控元件的插入。在进一步的实施方案中，调控元件是组成型启动子。在一些实施方案中，调控元件是诱导型启动子。在一些实施方案中，调控元件是组织特异性启动子。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物相同物种的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物相同属的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物不同物种的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物不同属的微生物。
在一些实施方案中，与磷酸盐相关的基因的改变包括密码子优化。在一些实施方案中，与磷酸盐相关的基因的改变包括密码子随机化。在一些实施方案中，与磷酸盐相关的基因的改变包括基因功能的降低。在一些实施方案中，与磷酸盐相关的基因的改变包括功能丧失突变。在一些实施方案中，与磷酸盐相关的基因的改变包括基因缺失。
在一些实施方案中，工程改造的微生物是工程改造的细菌。在进一步的实施方案中，工程改造的细菌选自由以下组成的组：产碱杆菌属(Alcaligenes)某些种、产气气杆菌(Aerobactor aerogenes)、无色杆菌属(Achromobacter)某些种、寡孢马杜拉放线菌(Actinomadura oligospora)、土壤杆菌属(Agrobacterium)某些种、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、芽孢杆菌属(Bacillus)某些种、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭形芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumils)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、嗜几丁质类芽孢杆菌(Bacillus chitinolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、慢生根瘤菌属(Bradyzhizobium)某些种、短杆菌属(Brevibacterium)某些种、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)某些种、假单胞菌属(Pseudomonas)某些种、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、条纹假单胞菌(Pseudomonas striata)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、钙假单胞菌(Pseudomonas calcis)、黄杆菌属(Flavobacterium)某些种、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)某些种、欧文氏菌属(Erwinia)某些种、微球菌属(Mirococcus)某些种、中间型大肠杆菌(Escherichia intermedia)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、解磷沙雷氏菌(Serratia phosphoticum)、硝化杆菌属(Nitrobacter)某些种、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferroxidans)、氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiosidans)、草木樨根瘤菌(Rhizobium meliloti)和黄单胞菌属(Xanthomonas)某些种。
在一些实施方案中，工程改造的微生物是工程改造的真菌。在进一步的实施方案中，工程改造的真菌选自由以下组成的组：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus tereus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、文氏曲霉(Aspergillus wentii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、细链格孢(Alternariateneius)、Achrothcium某些种、比莱青霉(Penicillium bilaiae)、指状青霉(Penicillumdigitatum)、淡紫青霉(Penicillum lilacinium)、巴拉吉青霉(Penicillum balaji)、绳状青霉(Penicillum funicolosum)、头孢霉属(Cephalosporium)某些种、枝孢霉属(Cladosprium)某些种、月状弯孢霉(Curvularia lunata)、小克银汉霉属(Cunnighamella)某些种、假丝酵母属(Candida)某些种、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、特异腐质霉(Humicola inslens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginose)、长蠕孢属(Helminthosporium)某些种、具纺锤形孢子拟青霉(Paecilomyces fusisporous)、腐霉属(Pythium)某些种、茎点霉属(Phoma)某些种、棘管轮丝葚霉(Populospora mytilina)、露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)、被孢霉属(Morteirella)某些种、小单孢菌属(Micromonospora)某些种、树粉孢属(Oidendendron)某些种、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、根霉属(Rhizopus)某些种、毛霉属(Mucor)某些种、绿色木霉(Trichoderma viridae)、嗜热色串孢(Torulathermophila)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)，和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。
在一些实施方案中，工程改造的微生物是工程改造的酵母菌。在一些实施方案中，工程改造的微生物是生物控制微生物。在一些实施方案中，工程改造的微生物表达细菌毒素。在一些实施方案中，工程改造的微生物进一步包含与氮的固定或同化相关的基因的改变，并且其中工程改造的微生物以比相同物种的非工程改造的微生物更大的容量或速率排泄出固定的氮。在一些实施方案中，工程改造的微生物固定氮。
本文还提供了工程改造的微生物，其包含选自由以下组成的组的基因的改变：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、pqq生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，或它们的功能变体，或它们的任何组合，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
在一些实施方案中，所述改变包括选自由以下组成的组的基因的改变：phoC、napD、napE、acpA、appA、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gcd，或它们的功能变体，或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述改变包括所述基因中一个或多个密码子的密码子优化。在一些实施方案中，所述改变包括所述基因中一个或多个密码子的密码子随机化。在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物包含所述基因的表达的改变。
在一些实施方案中，所述改变包括调控元件的插入。在一些实施方案中，调控元件是组成型启动子。在一些实施方案中，调控元件是诱导型启动子。在一些实施方案中，调控元件是组织特异性启动子。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物相同物种的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物相同属的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物不同物种的微生物。在一些实施方案中，调控元件来源于与工程改造的微生物不同属的微生物。
本文还提供了工程改造的微生物，其包含选自由以下组成的组的基因的改变：pqq基因、gabY、gcd，或它们的功能变体，或它们的任何组合，其中所述改变包括密码子改变，并且其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
在一些实施方案中，工程改造的微生物在至少约12mM的可溶性磷酸盐存在下增溶磷酸盐。在一些实施方案中，工程改造的微生物不含有来源于不同属生物体的任何DNA元件。
本文还提供了增溶磷酸盐的方法，所述方法包括使不溶性磷酸盐与本文所述的工程改造的微生物接触。
本文还提供了增加土壤中可溶性磷酸盐的量的方法，所述方法包括使包含不溶性磷酸盐的土壤与本文所述的工程改造的微生物接触。
在一些实施方案中，不溶性磷酸盐是有机磷酸盐。在一些实施方案中，其中不溶性磷酸盐是无机磷酸盐。
本文还提供了产生具有改善的磷酸盐增溶活性的工程改造的微生物的方法，所述方法包括：(a)改变与磷酸盐增溶相关的原生编码序列的密码子使用以产生密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列；(b)将所述密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列功能性地连接至启动子；以及(c)将所述启动子和所述密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列引入到微生物中以产生所述改善的微生物。
在一些实施方案中，从与改善的微生物相同物种的微生物中鉴别出原生编码序列。在一些实施方案中，改变原生编码序列的密码子使用包括密码子随机化。在一些实施方案中，改变原生编码序列的密码子使用包括密码子优化。
在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物能够多增溶至少5％的磷酸盐。在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物能够多增溶至少10％的磷酸盐。在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物能够多增溶至少15％的磷酸盐。在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物能够多增溶至少50％的磷酸盐。在一些实施方案中，与相同物种的非工程改造的微生物相比，工程改造的微生物能够多增溶至少90％的磷酸盐。
在一些实施方案中，通过改良的抗坏血酸方法测量所增溶的磷酸盐的量。
本文还提供了增加土壤中可溶性磷酸盐的量的方法，所述方法包括使包含不溶性磷酸盐的土壤与工程改造的微生物接触，其中所述工程改造的微生物具有gad基因、gntT基因，或它们的功能变体，或它们的任何组合的功能的降低。
在一些实施方案中，所述的gad基因、gntT基因，或它们的功能变体，或它们的任何组合的功能的降低是由gad基因、gntT基因，或它们的功能变体，或它们的任何组合的缺失引起。在一些实施方案中，gad基因是gad1或gad2。
本文还提供了工程改造的微生物，其包含选自由phoA、phoC和phoD组成的组的密码子改变的碱性磷酸酶基因，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
在一些实施方案中，密码子改变的碱性磷酸酶基因是密码子随机化的。在一些实施方案中，密码子改变的碱性磷酸酶基因是密码子优化的。
本文还提供了增加植物中磷的量的方法，所述方法包括使所述植物与工程改造的微生物接触，所述工程改造的微生物包含与磷增溶相关的基因的至少一种遗传变异。
在一些实施方案中，工程改造的微生物是工程改造的非属间微生物。在一些实施方案中，使植物与工程改造的非属间微生物接触包括将所述工程改造的非属间微生物施加至播种了所述植物的种子的土壤中。在一些实施方案中，使植物与工程改造的非属间微生物接触包括将所述工程改造的非属间微生物施加至播种了所述植物的种子的犁沟中。在一些实施方案中，使植物与工程改造的非属间微生物接触包括将工程改造的非属间微生物包衣至植物的种子上。在一些实施方案中，所述植物是选自由以下组成的组的农业作物植物：高粱、坎诺拉油菜(canola)、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。
在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物至少定殖于植物的根上，使得所述工程改造的非属间微生物以每克组织鲜重至少105个菌落形成单位的量存在于所述植物中。在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物增溶有机磷。在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物增溶无机磷。在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物排泄出磷酸盐增溶产物。工程改造的非属间微生物，其中植物体中的所述工程改造的非属间微生物增溶植物中至少1％的磷。在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物是细菌。在一些实施方案中，工程改造的非属间微生物是真菌。
本文还提供了细菌性磷增溶系统，其包含编码以下的核酸：至少一个操纵子，其包含由共同地与磷酸盐增溶相关的基因编码的多肽集的多个编码序列，其中所述多个编码序列中的至少一个包含至少一个非原生密码子；异源启动子区，其指导所述至少一个操纵子的表达；和异源转录控制子编码序列，其编码指导所述增溶系统的所述至少一个操纵子的表达的蛋白质，其中所述蛋白质直接或间接结合至所述异源启动子区。
本文还提供了包括以下的方法：(a)提供与目的靶植物相关的多个微生物物种；(b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；(c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；(d)在所述候选微生物物种中表征选自由以下组成的组的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；(e)将一种或多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中；(f)确认所述一种或多种靶向遗传变异在靶基因组基因座处的整合；以及(g)重复步骤(d)和(e)一次或多次，直至所述候选微生物物种已获得改善的增溶磷酸盐的能力。
在一些实施方案中，所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异。在一些实施方案中，所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且步骤(f)进一步包括确认转基因序列的不存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因。
在一些实施方案中，步骤(e)包括：(a)用转化质粒转化所述候选微生物物种，所述转化质粒包含：(i)选择标记；(ii)反选择标记；(iii)DNA片段，其包含待在与磷酸盐增溶相关的一个或多个基因组通路或基因集中的靶基因组基因座处引入到所述候选微生物物种中的遗传变异，和位于所述遗传变异侧翼的针对所述靶基因组基因座的同源臂；和(iv)质粒骨架；(b)基于所述选择标记在所述候选微生物物种的基因组中的存在，选择出已经历初始同源重组从而使得所述遗传变异整合至所述靶基因组基因座中的候选微生物物种；以及(c)基于所述反选择标记的不存在，选择出具有整合至所述靶基因组基因座中的所述遗传变异并且已经历环出(loop-out)所述质粒骨架的额外同源重组的候选微生物物种。
在一些实施方案中，DNA片段包含非属间遗传变异。
在一些实施方案中，步骤(f)包括对候选微生物物种的基因组的一部分进行测序。在一些实施方案中，步骤(f)包括确认来自转化质粒的转基因序列的不存在。
在一些实施方案中，步骤(b)包括在基于温室或实验室的条件下测定所述多个微生物物种的定殖度量。在一些实施方案中，步骤(b)包括在田间条件下测定所述多个微生物物种的定殖度量。在一些实施方案中，步骤(b)包括在(i)基于温室或实验室的条件和(ii)田间条件下测定所述多个微生物物种的定殖度量。在一些实施方案中，步骤(b)中测定的定殖度量包括空间定殖模式、时间定殖动力学、定殖密度或其组合。
在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量微生物物种的转录组谱。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量与增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括在不溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括在不溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量微生物物种的转录组谱。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量与增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括在可溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括在可溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量微生物物种的转录组谱。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量与微生物物种增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括在可溶性磷酸盐耗乏的条件和可溶性磷酸盐充足的条件下测量启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括在可溶性磷酸盐耗乏的条件和可溶性磷酸盐充足的条件下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述启动子序列的转录组活性。在一些实施方案中，测定所述多个微生物物种的定殖度量包括使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。在一些实施方案中，测定所述多个微生物物种的定殖度量包括在基于温室或实验室的条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。在一些实施方案中，测定所述多个微生物物种的定殖度量包括在田间条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括在基于温室或实验室的条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。在一些实施方案中，在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括在田间条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
在一些实施方案中，步骤(b)包括在基于温室或实验室的条件下测定所述多个微生物物种增溶磷酸盐的能力。在一些实施方案中，步骤(b)包括在磷酸盐增溶测定中测定所述多个微生物物种的磷酸盐增溶活性。
在一些实施方案中，转化质粒是自杀质粒。
本文还提供了合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的方法，所述方法包括：(a)提供多个微生物物种；(b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；(c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；(d)在选自由以下组成的组的基因中的靶基因组基因座处将一种或多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；(e)确认所述遗传变异在所述靶基因组基因座处的整合；以及(f)重复步骤(d)-(e)一次或多次，直至所述候选微生物物种已获得改善的增溶磷酸盐的能力。
在一些实施方案中，步骤(b)包括在代谢相关的环境条件下测定转录活性基因。在一些实施方案中，在步骤d)中，所述一种或多种靶向遗传变异包括全部基因缺失、部分基因缺失、启动子插入、单个碱基对变化以及它们的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且步骤(f)进一步包括确认任一转基因遗传序列的不存在。在一些实施方案中，步骤(e)包括对候选微生物物种的基因组的一部分进行测序。
本文还提供了合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的方法，其包括：(a)提供多个微生物物种；(b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；(c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；(d)在一种或多种选自由以下组成的组的基因中的两个或更多个靶基因组基因座处将两种或更多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；以及(e)确认所述遗传变异在所述靶基因组位点处的引入。
在一些实施方案中，步骤(b)包括在代谢相关的环境条件下测定转录活性基因。在一些实施方案中，在步骤(d)中，遗传变异选自由以下组成的组：全部基因缺失、部分基因缺失、启动子插入、单个碱基对变化以及它们的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且其中步骤(f)进一步包括确认任一转基因遗传序列的不存在。在一些实施方案中，步骤(e)包括对候选微生物物种的基因组进行测序。
本文还提供了计算方法，其包括：(a)获取多个微生物全基因组序列；(b)鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；(c)鉴别来自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；(d)从所述多个调控基因序列和所述多个与磷酸盐增溶相关的基因中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因，其中步骤a)-d)在计算机中进行；以及(e)在体内制造重塑的微生物细胞，所述重塑的微生物细胞包含所选择的调控基因序列与所选择的与磷酸盐增溶相关的基因的可操作的连接，由此改善所述与磷酸盐增溶相关的基因的表达。
本文还提供了用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的计算系统，其包括：(a)一个或多个处理器；和(b)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器可操作地耦合至所述一个或多个处理器并且具有存储在其上的指令，所述指令在由所述一个或多个处理器执行时使得所述系统：(i)获取多个微生物全基因组序列；(ii)鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；(iii)鉴别选自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；以及(iv)从所述多个调控基因序列和所述多个与磷酸盐增溶相关的基因中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因。
本文还提供了用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的计算方法，所述方法包括：(a)激活计算机系统，所述计算机系统包括一个或多个处理器和一个或多个存储器，所述一个或多个存储器可操作地耦合至所述一个或多个处理器并且包括存储在其上的指令，由此使得所述一个或多个处理器执行所述指令，并且使得所述系统：(i)获取多个微生物全基因组序列；(ii)鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；(iii)鉴别来自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；(iv)从所述多个中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因；以及(b)在体内制造重塑的微生物细胞，所述重塑的微生物细胞包含所选择的调控基因序列与所选择的与磷酸盐增溶相关的基因的可操作的连接，由此改善所述与磷酸盐增溶相关的基因的表达。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，引用程度就如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指出通过引用并入本文的程度一样。
附图简述
本发明的新颖特征具体地陈述于所附权利要求书中。通过参考阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案和附图的以下详细描述可更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：
图1描绘了表达phoC1(19-1237、19-1235)和phoC2(19-1234)的菌株以及相应的野生型亲本菌株(CI019)的对玉米根的定殖。
图2A描绘了与野生型亲本菌株(CI019)相比，过表达菌株中的phoC1(19-1237、19-1235)转录物水平。
图2B描绘了与野生型亲本菌株(CI019)相比，过表达菌株中的phoC2(19-1234)转录物水平。
图3示出了描绘对1个野生型和7个突变变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)菌株的培养基执行的可溶性磷酸盐筛选的结果的箱形图。
图4示出了描绘对1个野生型和3个突变水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)菌株的培养基执行的可溶性磷酸盐筛选的结果的箱形图。
图5示出了描绘对1个野生型和8个突变水生拉恩菌菌株的培养基执行的可溶性磷酸盐筛选的结果的箱形图。
具体实施方式
已发现通过表达和释放非特异性酸性磷酸酶(NSAP)来使土壤有机磷游离出来的植物相关微生物。本公开提供了用于使土壤中的有机磷和无机磷游离出来的方法和组合物。另外，本公开提供了分离的水生拉恩菌的磷酸盐增溶菌株(CI019)，其含有phoC基因的两种旁系同源物(SEQ ID NO:1和2)，所述phoC基因在另一细菌中具有编码酸性磷酸单酯酶的特征。
如本文所用，“属间微生物体”是通过有意组合最初从不同分类属的生物体中分离出来的遗传材料而形成的微生物体。“属间突变体”可与“属间微生物体”可互换使用。示例性的“属间微生物体”包括含有从与受体微生物体不同属的微生物体中分离出来的可移动遗传元件或调控元件的微生物体。
如本文所用，“属内微生物体”是通过有意组合最初从相同分类属的生物体中分离出来的遗传材料而形成的微生物体。“属内突变体”可与“属内微生物体”可互换使用。
如本文所用，“引入的遗传材料”意指添加至受体的基因组中并且作为受体的基因组的组分保留下来的遗传材料。
如本文所用，“控制序列”是指操纵子、启动子、沉默子或终止子。
如本文所用，“植物体中(in planta)”是指在植物中、在植物上、与植物缔合或者在植物存在下。
在一些实施方案中，本公开的基因的原生或内源控制序列被一个或多个属内控制序列替代。
如本文所用，“引入的”是指借助于现代生物技术的引入，而不是天然存在的引入。
在一些实施方案中，本公开的细菌已被修饰，使得它们不是天然存在的细菌。
如本文所用，“引入的遗传材料”意指添加至受体的基因组中并且作为受体的基因组的组分保留下来的遗传材料。
如本文所用，“组成型启动子”是在给定生物体中在大多数条件下有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用组成型启动子有几个优点，诸如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质的高水平产生；报告蛋白或可评分标记的高水平表达(这使得检测和定量易于进行)；作为调控转录系统一部分的转录因子的高水平产生；以及生物体中需要普遍存在的活性的化合物的产生。序列可以在一个物种中是组成型启动子，而在另一物种中则不是。非限制性示例性组成型启动子包括四环素抗性启动子、T7启动子和SP6启动子。
如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段期间有活性的启动子。例如，组织特异性启动子、组织优选性启动子、细胞类型特异性启动子、细胞类型优选性启动子、诱导型启动子和处于发育控制下的启动子是非组成型启动子。处于发育控制下的启动子的实例包括在某些组织中优先启动转录的启动子。
如本文所用，“诱导型”或“阻遏型”启动子是处于化学或环境因素控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件，某些化学品，光的存在、酸性或碱性条件等。
如本文所用，细菌背景下的“组织特异性”启动子是基于细菌所在的植物组织启动基因转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是数种基因调控水平相互作用的结果。因此，在本领域中，有时优选使用来自同源或密切相关物种的启动子来实现转基因在特定组织中的高效和可靠表达。这是在科学和专利文献两者中都发现的从特定组织中分离出大量组织特异性启动子的主要原因之一。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸序列的功能由另一个调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达(即编码序列处于该启动子的转录控制下)时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或反义取向可操作地连接至调控序列。在另一个实例中，本公开的互补RNA区域可直接或间接地可操作地连接至靶mRNA的5'或靶mRNA的3'或在靶mRNA内部，或者第一互补区域位于靶mRNA的5'而其互补体位于靶mRNA的3'。
“互补性”是指核酸通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个分别为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键结合。如本文所用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域内互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。诸如出于评估互补百分比的目的，序列同一性可通过任何适合的比对算法来测量，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nu cleotide.html处获得的EMBOSS Needle比对器(aligner)，任选地使用默认设置)、BLAST算法(参见例如可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg i处获得的BLAST比对工具，任选地使用默认设置)或Smith-Waterm an算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html处获得的EMBOSS Water比对器，任选地使用默认设置)。可使用所选择的算法的任何适合参数(包括默认参数)来评估最佳比对。
如本文所用，术语“约”与术语“近似”同义使用。例示性地，关于量的术语“约”的使用表示值略微超出引用值，例如加或减0.1％至10％。
磷酸盐增溶微生物还可增溶无机磷。磷酸盐增溶微生物通过有机酸的产生和排泄来使无机磷释放出来，该有机酸的产生和排泄酸化了周围的土壤并增加了对来自不溶性矿物复合物的磷酸盐的螯合。一个实例是由许多磷酸盐增溶细菌产生和排泄的葡糖酸。
在一些情况下，本公开提供了用于优化生物体中的基因或通路的活性的方法。在一些情况下，所述方法涉及选择出要优化的基因，对所述基因的编码序列进行密码子随机化以去除内部调控序列，以及将所述密码子随机化的编码序列连接至启动子和核糖体结合位点(RBS)。在一些情况下，密码子随机化步骤可包括产生许多不同的经密码子随机化的序列，以及在计算机中或在体内分析所述序列，以确定哪些序列在期望生物体中最高效地表达。
生物体
生物体可以是多细胞生物体或单细胞生物体。在一些情况下，生物体是微生物。在一些情况下，生物体是细菌、古细菌或真菌。在一些情况下，生物体是植物内生菌。在一些情况下，生物体是与根际相关的微生物。在某些情况下，生物体能够定殖于植物上。在一些情况下，生物体可能与植物紧密缔合。在一些情况下，生物体可以是水生拉恩菌、山登泛菌(Pantoea cedenensis)、远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)、栖盐生植物中间根瘤菌(Rhizobium halophytocola)、溶纤维素根瘤菌(Rhizobium cellulosilyticum)、蔗糖肠杆菌(Enterobacter sacchari)、蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)、花园伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)、假单胞菌属种、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)种、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、香坊肠杆菌(Enterobacter xiangfangensis)、隐藏伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、泛菌属(Pantoea)种、根瘤菌属种、克雷伯菌属(Klebsiella)种、三赞鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、莱略特菌属(Lelliottia)种、副黄假单胞菌(Pseudomonasparafulva)或变栖克雷伯菌。
在一些情况下，如本文所述的磷酸盐增溶微生物可以是细菌、真菌、放线菌或蓝细菌。在某些情况下，磷酸盐增溶放线菌可选自由放线菌属(Actinomyces)某些种和链霉菌属(Streptomyces)某些种组成的组。在各种情况下，磷酸盐增溶蓝细菌可选自由以下组成的组：鱼腥藻属(Anabena)某些种、勃氏眉藻(Calothrix braunii)、念珠藻属(Nostoc)某些种和伪枝藻属(Scytonema)某些种。在一些情况下，磷酸盐增溶微生物可以是聚生球囊霉(Glomus fasciculatum)微生物。
在某些情况下，磷酸盐增溶真菌可选自由以下组成的组：泡盛曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、臭曲霉、文氏曲霉、尖孢镰刀菌、细链格孢、Achrothcium某些种、指状青霉、淡紫青霉、巴拉吉青霉、绳状青霉、头孢霉属某些种、枝孢霉属某些种、月状弯孢霉、小克银汉霉属某些种、假丝酵母属某些种、球毛壳菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、长蠕孢属某些种、具纺锤形孢子拟青霉、腐霉属某些种、茎点霉属某些种、棘管轮丝葚霉、露湿漆斑菌、被孢霉属某些种、小单孢菌属某些种、树粉孢属某些种、立枯丝核菌、根霉属某些种、毛霉属某些种、绿色木霉、嗜热色串孢、西方许旺酵母，和齐整小核菌。在各种情况下，磷酸盐增溶真菌可选自由以下组成的组：比莱青霉ATCC 18309、比莱青霉ATCC 20851、比莱青霉ATCC22348、比莱青霉NRRL 50162、比莱青霉NRRL 50169、比莱青霉NRRL 50776、比莱青霉NRRL50777、比莱青霉NRRL 50778、比莱青霉NRRL 50777、比莱青霉NRRL 50778、比莱青霉NRRL50779、比莱青霉NRRL 50780、比莱青霉NRRL 50781、比莱青霉NRRL 50782、比莱青霉NRRL50783、比莱青霉NRRL 50784、比莱青霉NRRL 50785、比莱青霉NRRL 50786、比莱青霉NRRL50787、比莱青霉NRRL 50788、比莱青霉RS7B-SD1、短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)AgRFl8、变灰青霉(Penicillium canescens)ATCC 10419、扩展青霉(Penicillium expansum)ATCC 24692、扩展青霉YT02、费拉塔纳姆青霉(Penicilliumfellatanum)ATCC 48694、加斯特氏青霉(Penicillium gaestrivorus)NRRL 50170、光孢青霉(Penicillium glabrum)DAOM 239074、光孢青霉CBS 229.28、微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)ATCC 10455、诺索可鲁里木青霉(Penicillium lanosocoeruleum)ATCC48919、甘蓝青霉(Penicillium radicum)ATCC 201836、甘蓝青霉FRR 4717、甘蓝青霉FRR4719、甘蓝青霉N93/47267、雷斯特里克青霉(Penicillium raistrickii)ATCC 10490和杰氏假单胞菌(Pseudomonas jessenii)PS06。
在一些情况下，磷酸盐增溶细菌可选自由以下组成的组：产碱杆菌属某些种、产气气杆菌、无色杆菌属某些种、寡孢马杜拉放线菌、土壤杆菌属某些种、巴西固氮螺菌、芽孢杆菌属某些种、环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜几丁质类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生根瘤菌属某些种、短杆菌属某些种、柠檬酸杆菌属某些种、假单胞菌属某些种、恶臭假单胞菌、条纹假单胞菌、荧光假单胞菌、钙假单胞菌、黄杆菌属某些种、亚硝化单胞菌属某些种、欧文氏菌属某些种、微球菌属某些种、中间型大肠杆菌、阿氏肠杆菌、解磷沙雷氏菌、硝化杆菌属某些种、氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、草木樨根瘤菌和黄单胞菌属某些种。
在某些情况下，磷酸盐增溶微生物还可以是生物控制微生物，例如具有生物杀虫活性的微生物。表现出生物杀虫活性的微生物菌株的实例包括但不限于不动杆菌属、放线菌属、虫座孢属(Aegerita)、土壤杆菌属(例如放射形土壤杆菌(A.radiobacter)菌株，诸如K1026和K84)、刺束梗孢属(Akanthomyces)、产碱杆菌属、链格孢属、氨基杆菌属(Aminobacter)(例如、阿贺野氨基杆菌(A.aganoensis)、嗜氨基氨基杆菌(A.aminovorans)、绒毛花氨基杆菌(A.anthyllidis)、西塞龙氨基杆菌(A.ciceronei)、丽莎氨基杆菌(A.lissarensis)、新泻氨基杆菌(A.niigataensis))、白粉寄生菌属(Ampelomyces)(例如，白粉寄生菌(A.quisqualis)菌株，诸如M-10)、鱼腥藻属(例如，等长鱼腥藻(A.aequalis)、近亲鱼腥藻(A.afflnis)、安格斯第尤马利斯安格斯第尤马利斯鱼腥藻(A.angstumalis angstumalis)、安格斯第尤马利斯马其塔鱼腥藻(A.angstumalismarchita)、束丝鱼腥藻(A.aphanizomendoides)、满江红鱼腥藻(A.azollae)、博氏鱼腥藻(A.bornetiana)、链状鱼腥藻(A.catenula)、雪松鱼腥藻(A.cedrorum)、卷曲鱼腥藻(A.circinalis)、丝状鱼腥藻(A.confervoides)、缢缩鱼腥藻(A.constricta)、蓝细菌鱼腥藻(A.cyanobacterium)、苏铁鱼腥藻(A.cycadeae)、柱孢鱼腥藻(A.cylindrica)、棘孢鱼腥藻(A.echinispora)、费利西尼鱼腥藻(A.felisii)、水华水华鱼腥藻(A.flos-aquae flos-aquae)、水华小鱼腥藻(A.flos-aquae minor)、水华特里利氏鱼腥藻(A.flos-aquaetreleasei)、旋蜗牛超科鱼腥藻(A.helicoidea)、崎岖鱼腥藻(A.inaequalis)、拉普鱼渥藻(A.lapponica)、宽松鱼腥藻(A.laxa)、累氏鱼腥藻(A.lemmermannii)、雷万鱼腥藻(A.levanderi)、湖泊鱼腥藻(A.limnetica)、巨孢巨孢鱼腥藻(A.macrosporamacrospora)、巨孢罗布斯塔鱼腥藻(A.macrospora robusta)、高山鱼腥藻(A.monticulosa)、念珠鱼腥藻(A.nostoc)、阿西拉里兹鱼腥藻(A.ascillarioides)、浮游鱼腥藻(A.planctonica)、拉氏鱼腥藻(A.raciborski)、许门鱼腥藻(A.scheremetievi)、球孢鱼腥藻(A.sphaerica)、粗糙螺旋鱼腥藻(A.spiroides crassa)、螺旋螺旋鱼腥藻(A.spiroides sprroides)、近圆柱形鱼腥藻(A.subcylindrica)、纽曲鱼腥藻(A.torulosa)、单孢鱼腥藻(A.unispora)、多变鱼腥藻(A.variabilis)、疣状鱼腥藻(A.verrucosa)、威格鱼腥藻(A.viguieri)、威斯康星鱼腥藻(A.wisconsinense)、麒麟鱼腥藻(A.zierlingii))、节杆菌属(Arthrobacter)、节丛孢属(Arthrobotrys)(例如，聚团节丛孢(A.aggregata)、阿拉斯加节丛孢(A.alaskana)、单孢节丛孢(A.ameropora)、异形节丛孢(A.anomala)、阿普歇伦节丛孢(A.apscheronica)、葡萄串状节丛孢(A.arthrobotryoides)、阿塞拜疆节丛孢(A.azerbaijanica)、巴库尼卡节丛孢(A.bakunika)、葡萄孢节丛孢(A.botryospora)、环捕节丛孢(A.brochopaga)、查萨里卡节丛孢(A.chazarica)、智利节丛孢(A.chilensis)、叶状枝节丛孢(A.cladodes)、裂环孢节丛孢(A.calvispora)、致密节丛孢(A.compacta)、圆锥节丛孢(A.conoides)、收缩节丛孢(A.constringens)、柱孢节丛孢(A.cylindrospora)、指状节丛孢(A.dactyloides)、偏转节丛孢(A.deflectans)、枝状节丛孢(A.dendroides)、桶状节丛孢(A.doliiformis)、掘氏节丛孢(A.drechsleri)、秀丽节丛孢(A.elegans)、椭圆孢节丛孢(A.ellipsospora)、食虫节丛孢(A.entomopaga)、多刺节丛孢(A.ferox)、叶生节丛孢(A.foliicola)、小灌木节丛孢(A.fruticulosa)、球孢节丛孢(A.globospora)、哈托斯波拉节丛孢(A.hatospora)、贺左耶那节丛孢(A.hertziana)、籼型节丛孢(A.indica)、不规则节丛孢(A.irregularis)、爪哇节丛孢(A.javanica)、吉尔吉斯节丛孢(A.kirghizica)、长节丛孢(A.longa)、长梗节丛孢(A.longiphora)、长副枝节丛孢(A.longiramulifera)、长孢节丛孢(A.longispora)、红树孢节丛孢(A.mangrovispora)、巨孢节丛孢(A.megaspora)、小舟形节丛孢(A.microscaphoides)、微孢节丛孢(A.microspora)、多节肢节丛孢(A.multisecundaria)、弯孢节丛孢(A.musiformis)、食线虫节丛孢(A.nematopaga)、无隔节丛孢(A.nonseptata)、少孢节丛孢(A.oligospora)、奥德蘑节丛孢(A.oudemansii)、卵形节丛孢(A.oviformis)、富营养节丛孢(A.perpasta)、多头节丛孢(A.polycephala)、拟棒状节丛孢(A.pseudoclavata)、梨形节丛孢(A.pyriformis)、直节丛孢(A.recta)、罗布斯塔节丛孢(A.robusta)、玫红节丛孢(A.rosea)、舟形节丛孢(A.scaphoides)、硬菌丝节丛孢(A.sclerohypha)、沙赫里亚里节丛孢(A.shahriari)、狮子山节丛孢(A.shizishanna)、中华节丛孢(A.sinensis)、索普卢诺维节丛孢(A.soprunovii)、束梗孢节丛孢(A.stilbacea)、蒿秆节丛孢(A.straminicola)、多孢节丛孢(A.superba)、大不里士节丛孢(A.tabrizica)、秀丽节丛孢(A.venusta)、蠕虫节丛孢(A.vermicola)、云南节丛孢(A.yunnanensis))、座壳孢属(Aschersonia)、球囊菌属(Ascophaera)、曲霉属(例如，黄曲霉菌株，诸如NRRL 21882，寄生曲霉(A.parasiticus))、管链藻属(Aulosira)(例如模糊管链藻(A.aenigmatica)、非洲管链藻(A.africana)、波希米亚管链藻(A.bohemensis)、孟买管链藻(A.bombayensis)、汇合管链藻(A.confluens)、繁育管链藻(A.fertilissima)、繁育管链藻特纽斯变种(A.fertilissma var.tenius)、费氏管链藻(A.fritschii)、格多耶那管链藻(A.godoyana)、交织管链藻(A.implexa)、宽松管链藻(A.laxa)、普兰顿管链藻(A.plantonica)、多育管链藻(A.prolifica)、假枝管链藻(A.pseuodoramosa)、绍因斯兰管链藻(A.schauinslandii)、纹状管链藻(A.striata)、陆生管链藻(A.terrestris)、热腐生管链藻(A.thermalis))、金杆菌属(Aureobacterium)、短梗霉属(Aureobasidium)(例如，出芽短梗霉(A.pullulans)菌株，诸如DSM 14940和DSM 14941)、固氮菌类(Azobacter)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)(例如，茎瘤固氮根瘤菌(A.caulinodans)、德贝赖纳氏固氮根瘤菌(A.doebereinerae)、嗜草酸固氮根瘤菌(A.oxalatiphilum))、固氮螺菌属(例如，亚马逊固氮螺菌(A.amazonense)菌株，诸如BR 11140(SpY2T)，巴西固氮螺菌(A.brasilense)菌株，诸如INTA Az-39、AZ39、XOH、BR 11002、BR 11005、Ab-V5和Ab-V6，加拿大固氮螺菌(A.canadense)，德贝赖纳氏固氮螺菌(A.doebereinerae)，台湾固氮螺菌(A.formosense)，高盐固氮螺菌(A.halopraeferans)，伊拉克固氮螺菌(A.irakense)，大型移动式固氮螺菌(A.largimobile)，生脂固氮螺菌(A.lipoferum)菌株，诸如BR 11646，糖蜜草固氮螺菌(A.melinis)，稻固氮螺菌(A.oryzae)，皮克斯固氮螺菌(A.picis)，多皱固氮螺菌(A.rugosum)，嗜硫固氮螺菌(A.thiophilum)，玉米固氮螺菌(A.zeae))、固氮菌属(例如，敏捷固氮菌(A.agilis)、亚美尼亚固氮菌(A.armeniacus)、固氮菌属种AR、拜氏固氮菌(A.beijerinckii)、圆褐固氮菌(A.chroococcum)、固氮菌属DCU26、固氮菌属FA8、黑色固氮菌(A.nigricans)、雀稗固氮菌(A.paspali)、盐生固氮菌(A.salinestris)、热带固氮菌(A.tropicalis)、棕色固氮菌(A.vinelandii))、芽孢杆菌属(例如，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株，蜡样芽孢杆菌菌株，左旋乳酸芽孢杆菌(B.laevolacticus)，地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)，软化芽孢杆菌(B.macerns)，坚硬芽孢杆菌(B.firmus)，蕈状芽孢杆菌菌株，诸如NRRL B-21664，巴斯德氏芽孢杆菌(B.pasteurii)，短小芽孢杆菌(B.pumilus)，球形芽孢杆菌(B.sphaericus)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)菌株，诸如ATCC 13367、GC-91、NRRL B-21619、ABTS-1857、SAN 401I、ABG-6305、ABG-6346、AM65-52、SA-12、SB4、ABTS-351、HD-l、EG 2348、EG 7826、EG 7841、DSM2803、NB-125和NB-176)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、白僵菌属(Beauveria)(例如，球孢白僵菌(B.bassiana)菌株，诸如ATCC 26851、ATCC 48023、ATCC 48585、ATCC 74040、ATCC-74250、DSM 12256和PPRI 5339)、拜叶林克氏菌属、芽枝酵母属(Blastodendrion)、包西氏菌属(例如，恩内艾包西氏菌(B.eneae)、山黧豆包西氏菌(B.lathyri)、羽扇豆包西氏菌(B.lupini)、马赛包西氏菌(B.massiliensis)、米纳蒂特兰包西氏菌(B.minatitlanensis)、刺槐包西氏菌(B.robiniae)、氧化硫包西氏菌(B.thiooxidans)、维斯特里斯包西氏菌(B.vestrisii))、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)(例如，花生慢生根瘤菌(B.arachidis)，贝特慢生根瘤菌(B.bete)，加拿利慢生根瘤菌(B.canariense)，金雀慢生根瘤菌(B.cytisi)，大庆慢生根瘤菌(B.daqingense)，脱氮慢生根瘤菌(B.denitriflcans)，重氮动力慢生根瘤菌(B.diazoefflciens)，埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)菌株，诸如SEMIA 501、SEMIA 587和SEMIA 5019，赣州慢生根瘤菌(B.ganzhouense)，黄淮海慢生根瘤菌(B.huanghuauhaiense)，艾森斯慢生根瘤菌，印加慢生根瘤菌(B.ingae)，西表岛慢生根瘤菌(B.iriomotense)，大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)菌株，诸如NRRL B-50586(还保藏为NRRL B-59565)、NRRL B-50587(还保藏为NRRL B-59566)、NRRL B-50588(还保藏为NRRL B-59567)、NRRL B-50589(还保藏为NRRL B-59568)、NRRL B-50590(还保藏为NRRL B-59569)、NRRL B-50591(还保藏为NRRL B-59570)、NRRL B-50592(还保藏为NRRL B-59571)、NRRL B-50593(还保藏为NRRL B-59572)、NRRL B-50594(还保藏为NRRL B-50493)、NRRL B-50608、NRRL B-50609、NRRL B-50610、NRRL B-50611、NRRL B-50612、NRRL B-50726、NRRL B-50727、NRRL B-50728、NRRL B-50729、NRRL B-50730、SEMIA 566、SEMIA 5079、SEMIA 5080、USDA 6、USDA 110、USDA 122、USDA 123、USDA127、USDA 129和USDA 532C，凉薯慢生根瘤菌(B.jicamae)，扁豆慢生根瘤菌(B.lablabi)，辽宁慢生根瘤菌(B.liaoningense)，马瑙斯慢生根瘤菌(B.manausense)，新热带区慢生根瘤菌(B.neotropicale)，贫营养慢生根瘤菌(B.oligotrophicum)，渥太华慢生根瘤菌(B.ottawaense)，豆薯慢生根瘤菌(B.pachyrhizi)，帕克斯莱瑞慢生根瘤菌(B.paxllaeri)，雷塔马慢生根瘤菌(B.retamae)，瑞芬斯慢生根瘤菌(B.rifense)，巴伦西亚慢生根瘤菌(B.valentinum)，圆明慢生根瘤菌(B.yuanmingense))、伯克霍尔德菌属(例如，阿斯德帕鲁迪斯伯克霍尔德菌(B.acidipaludis)，双向伯克霍尔德菌(B.ambifaria)，须芝草伯克霍尔德菌(B.andropogonis)，花核伯克霍尔德菌(B.anthina)，树枝状伯克霍尔德菌(B.arboris)，班南伯克霍尔德菌(B.bannensis)，藓生伯克霍尔德菌(B.bryophila)，喀里多尼亚伯克霍尔德菌(B.caledonica)，加勒比伯克霍尔德菌(B.caribensis)，丁香伯克霍尔德菌(B.caryophylli)，洋葱伯克霍尔德菌(B.cenocepacua)，秋伊卡伯克霍尔德菌(B.choica)，椰毒伯克霍尔德菌(B.cocovenenans)，污染伯克霍尔德菌(B.contaminans)，脱氮伯克霍尔德菌(B.denitriflcans)，重氮养伯克霍尔德菌(B.diazotrophica)，扩散伯克霍尔德菌(B.diffusa)，迪尔沃思伯克霍尔德菌(B.dilworthii)，朵露莎伯克霍尔德菌(B.dolosa)，象牙伯克霍尔德菌(B.eburnea)，内生真菌伯克霍尔德菌(B.endofungorum)，法拉利伯克霍尔德菌(B.ferrariae)，真菌伯克霍尔德菌(B.fungorum)，人参土伯克霍尔德菌(B.ginsengisoli)，唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)，格氏伯克霍尔德菌(B.glathei)，荚壳伯克霍尔德菌(B.glumae)，禾谷伯克霍尔德菌(B.graminis)，紫萼藓伯克霍尔德菌(B.grimmiae)，黑利亚伯克霍尔德菌(B.heleia)，医院伯克霍尔德菌(B.hospital)，休米伯克霍尔德菌(B.humi)，久留里伯克霍尔德菌(B.kururiensis)，拉塔伯克霍尔德菌(B.lata)，隐藏伯克霍尔德菌(B.latens)，鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)，大都市伯克霍尔德菌(B.megapolitana)，金属伯克霍尔德菌(B.metallica)，含羞草伯克霍尔德菌(B.mimosarum)，多嗜伯克霍尔德菌(B.multivorans)，结瘤伯克霍尔德菌(B.nodosa)，纽伦堡伯克霍尔德菌(B.norimbergensis)，俄克拉荷马伯克霍尔德菌(B.oklahomensis)，吩嗪伯克霍尔德菌(B.phenazinium)，吩里拉普伯克霍尔德菌(B.phenoliruptrix)，瘤状伯克霍尔德菌(B.phymatum)，菲投费门思伯克霍尔德菌(B.phytofirmans)，皮氏伯克霍尔德菌(B.pickettii)，植物伯克霍尔德菌(B.plantarii)，类鼻疽伯克霍尔德菌(B.pseudomallei)，假多嗜伯克霍尔德菌(B.pseudomultivorans)，吡咯伯克霍尔德菌(B.pyrrocinia)，根霉素伯克霍尔德菌(B.rhizoxinica)，鹿藿伯克霍尔德菌(B.rhynchosiae)，清风藤伯克霍尔德菌(B.sabiae)，蔗糖伯克霍尔德菌(B.sacchari)，撒提斯索里伯克霍尔德菌(B.sartisoli)，赛迪米内考拉伯克霍尔德菌(B.sediminicola)，精囊伯克霍尔德菌(B.seminalis)，斯沃兰提卡伯克霍尔德菌(B.silvatlantica)，新加坡伯克霍尔德菌(B.singaporensis)，土壤伯克霍尔德菌(B.soli)，索地考拉伯克霍尔德菌(B.sordidcola)，伯克霍尔德菌种菌株，诸如A396，点缀伯克霍尔德菌(B.sprentiae)，稳定伯克霍尔德菌(B.stabilis)，共生伯克霍尔德菌(B.symbiotica)，碲化伯克霍尔德菌(B.telluris)，土伯克霍尔德菌(B.terrae)，陆生伯克霍尔德菌(B.terrestris)，土生伯克霍尔德菌(B.terricola)，泰国伯克霍尔德菌(B.thailandensis)，热带伯克霍尔德菌(B.tropica)，管伯克霍尔德菌(B.tuberum)，乌汶伯克霍尔德菌(B.ubonensis)，乌岱斯伯克霍尔德菌(B.udeis)，安纳美伯克霍尔德菌(B.unamae)，范氏伯克霍尔德菌(B.vandii)，越南伯克霍尔德菌(B.vietnamiensis)，异种伯克霍尔德菌(B.xenovorans)，浙江伯克霍尔德菌(B.zhejiangensis))、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德菌属(例如，伯克霍尔德菌新种A396里诺杰(rinojensis)NRRL B-50319)、丽赤壳属(Calonectria)、假丝酵母属(例如，橄榄假丝酵母属(C.oleophila)，诸如1-182，齐藤假丝酵母(C.saitoana))、暂定种(Candidatus)(例如，暂定卡尔瓦伯克霍尔德菌(C.Burkholderia calva)、暂定圆齿伯克霍尔德菌(C.Burkholderia crenata)、暂定粗毛伯克霍尔德菌(C.Burkholderiahispidae)、暂定柯氏伯克霍尔德菌(C.Burkholderia kirkii)、暂定乳头伯克霍尔德菌(C.Burkholderia mamillata)、暂定黑点伯克霍尔德菌(C.Burkholderianigropunctata)、暂定硬伯克霍尔德菌(C.Burkholderia rigidae)、暂定休玛尼内伯克霍尔德菌(C.Burkholderia schumannianae)、暂定维什尔伦伯克霍尔德菌(C.Burkholderiaverschuerenii)、暂定绿色伯克霍尔德菌(C.Burkholderia virens)、暂定异木麻黄植原体(C.Phytoplasma allocasuarinae)、暂定美洲植原体(C.Phytoplasma americanum)、暂定星状植原体(C.Phytoplasma asteris)、暂定橙黄色叶植原体(C.Phytoplasmaaurantifolia)、暂定澳大利亚植原体(C.Phytoplasma australiense)、暂定拜拉尼提植原体(C.Phytoplasma balanitae)、暂定巴西植原体(C.Phytoplasma brasiliense)、暂定番木瓜属植原体(C.Phytoplasma caricae)、暂定栗属植原体(C.Phytoplasma castaneae)、暂定尼日利亚可可植原体(C.Phytoplasma cocosnigeriae)、暂定坦桑尼亚可可植原体(C.Phytoplasma cocostanzaniae)、暂定旋花属植原体(C.Phytoplasma convolvuli)、暂定哥斯达黎加植原体(C.Phytoplasma costaricanum)、暂定狗牙根植原体(C.Phytoplasmacynodontis)、暂定蛇莓植原体(C.Phytoplasma fragariae)、暂定秦皮植原体(C.Phytoplasma fraxini)、暂定禾木植原体(C.Phytoplasma graminis)、暂定日本植原体(C.Phytoplasma japonicum)、暂定丝瓜植原体(C.Phytoplasma luffae)、暂定番茄植原体(C.Phytoplasma lycopersici)、暂定马来西亚植原体(C.Phytoplasma malasianum)、暂定马里植原体(C.Phytoplasma mali)、暂定阿曼植原体(C.Phytoplasma omanense)、暂定稻植原体(C.Phytoplasma oryzae)、暂定棕榈科植原体(C.Phytoplasma palmae)、暂定棕榈生植原体(C.Phytoplasma palmicola)、暂定腓尼基植原体(C.Phytoplasma phoenicium)、暂定皮尼植原体(C.Phytoplasma pini)、暂定普鲁尼植原体(C.Phytoplasma pruni)、暂定普如诺植原体(C.Phytoplasma prunorum)、暂定梨植原体(C.Phytoplasma pyri)、暂定鼠李植原体(C.Phytoplasma rhamni)、暂定鲁比植原体(C.Phytoplasma rubi)、暂定茄植原体(C.Phytoplasma solani)、暂定斯巴提植原体(C.Phytoplasma spartii)、暂定南美植原体(C.Phytoplasma sudamericanum)、暂定柽柳植原体(C.Phytoplasma tamaricis)、暂定三叶草植原体(C.Phytoplasma trifolii)、暂定榆叶植原体(C.Phytoplasma ulmi)、暂定葡萄植原体(C.Phytoplasma vitis)、暂定枣植原体(C.Phytoplasma ziziphi))、色杆菌属(Chromobacterium)(例如，萨布茨格色杆菌(C.subtsugae)NRRL B-30655和PRAA4-1，痘苗色杆菌(C.vaccinia)菌株，诸如NRRL B-50880，紫色色杆菌(C.violaceum))、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、棒形杆菌属(Clavibacter)、螺旋聚孢霉属(Clonostachys)(例如，粉红螺旋聚孢霉链孢变型(C.rosea f.catenulata)(还被称为链孢粘帚霉(Gliocladiumcatenulatum))菌株，诸如J1446)、梭菌属(Clostridium)、柯里真菌属(Coelemomyces)、腔壶菌属(Coelomycidium)、刺盘孢属(Colletotrichum)(例如，胶孢刺盘孢(C.gloeosporioides)菌株，诸如ATCC 52634)、丛毛单胞菌属(Comomonas)、耳霉属(Conidiobolus)、盾壳霉属(Coniothyrium)(例如，小盾壳霉(C.minitans)菌株，诸如CON/M/91-08)、冬虫夏草属(Cordyceps)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、库奇霉属(Couchia)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)(例如，寄生隐丛赤壳(C.parasitica))、隐球菌属(Cryptococcus)(例如，白色隐球菌(C.albidus))、异形小卷蛾属(Cryptophlebia)(例如，苹果异形小卷蛾(C.leucotreta))、蚊霉属(Culicinomyces)、贪铜菌属(Cupriavidus)(例如，嗜碱贪铜菌(C.alkaliphilus)、拜斯勒塞斯贪铜菌(C.basilensis)、坎皮内斯贪铜菌(C.campinensis)、格拉迪贪铜菌(C.gilardii)、拉哈瑞斯贪铜菌(C.laharis)、耐金属贪铜菌(C.metallidurans)、沼津贪铜菌(C.numazuensis)、草酸贪铜菌(C.oxalaticus)、潘姆帕贪铜菌(C.pampae)、罕见贪铜菌(C.pauculus)、皮那图本内塞斯贪铜菌(C.pinatubonensis)、瑞斯皮瑞库里贪铜菌(C.respiraculi)、台湾贪铜菌(C.taiwanensis))、短小杆菌属(Curtobacterium)、小卷蛾属(Cydia)(例如，苹果小卷蛾(C.pomonella)菌株，诸如V03和V22)、指霉属(Dactylaria)(例如，假丝酵母指霉(D.Candida))、代尔夫特菌属(Delftia)(例如，食酸代尔夫特菌(D.acidovorans)菌株，诸如RAY209)、Desulforibtio、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、德沃斯氏菌属(Devosia)(例如，假含羞草属德沃斯氏菌(D.neptuniae))、二磷酸杆菌属(Dilophosphora)(例如，阿罗帕库瑞二磷酸杆菌(D.alopecuri))、侧齿霉属(Engyodontium)、肠杆菌属(Enterobacter)、噬虫霉属(Entomophaga)、虫霉属(Entomophthora)、虫疫霉属(Erynia)、大肠杆菌属(Escherichia)(例如，中间型大肠杆菌)、正青霉属(Eupenicillium)、微小杆菌属(Exiguobacaterium)、丝菌属(Filariomyces)、线黑粉菌属(Filobasidiella)、黄杆菌属(例如，黄杆菌属H492 NRRL B-50584)、弗兰克氏菌属(Frankia)(例如，桤木弗兰克氏菌(F.alni))、镰刀菌属(例如，砖红镰刀菌(F.laterium)、尖孢镰刀菌、茄镰刀菌(F.solani))、球束梗孢属(Gibellula)、巨孢囊霉属(Gigaspora)(例如珍珠巨孢囊霉(G.margarita))、粘帚霉属(Gliocladium)(例如，绿粘帚霉(G.virens)菌株，诸如ATCC52045和GL-21)、球囊霉属(Glomus)(例如，聚丛球囊霉(G.aggregatum)，巴西球囊霉(fl.brasilianum)，明球囊霉(fl.clarum)，沙漠球囊霉(fl.deserticola)，幼套球囊霉(fl.etunicatum)，集球囊霉(G.fasciculatum)，根内球囊霉(G.intraradices)菌株，诸如RTI-801，单孢球囊霉(G.monosporum)，摩西球囊霉(G.mosseae)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、钩丝孢属(Harposporium)(例如，鳗形线虫钩丝孢(H.anguillulae))、金星菌属(Hesperomyces)、被毛孢属(Hirsutella)(例如，明尼苏达被毛孢(H.minnesotensis)，洛斯里被毛孢(H.rhossiliensis)，滇缅花楸被毛孢(H.thorns onii)菌株，诸如ATCC 24874))、噬氢菌属(Hydrogenophage)、膜盘菌属(Hymenoscyphous)(例如，灰斑膜盘菌(H.ericae))、层梗孢属(Hymenostilbe)、亚肉座菌属(Hypocrella)、棒束孢属(Isaria)(例如，玫烟棒束孢(I.fumosorosea)菌株，诸如Apopka-97(保藏为ATCC 20874))、克雷伯菌属(例如，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、产酸克雷伯菌)、克吕沃氏菌属(Kluyvera)、蜡蘑属(Laccaria)(例如，双色蜡蘑(L.bicolor)、漆蜡蘑(L.laccata))、乳杆菌属(Lactobacillus)、链壶菌属(Lagenidium)、蚧霉属(Lecanicillium)(例如，蜡蚧霉(L.lecanii)菌株，诸如KV01，长孢疥霉(L.longisporum)菌株，诸如KV42和KV71)、细囊霉属(Leptolegnia)、溶杆菌属(Lysobacter)(例如，抗生素溶杆菌(L.antibioticus)菌株，诸如13-1和HS124，产酶溶杆菌(L.enzymogenes)菌株，诸如3.1T8)、团孢霉属(Massospora)、顶裂霉属(例如，星孢顶裂霉(M.asterospermum))、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)(例如，阿比西尼亚中慢生根瘤菌(M.abyssinicae)、合欢中慢生根瘤菌(M.albiziae)、骆驼刺中慢生根瘤菌(M.alhagi)、紫穗槐中慢生根瘤菌(M.amorphae)、澳大利亚中慢生根瘤菌(M.australicum)、骆驼刺中慢生根瘤菌(M.camelthorni)、锦鸡儿中慢生根瘤菌(M.caraganae)、查科中慢生根瘤菌(M.chacoense)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M.ciceri)、戈壁中慢生根瘤菌(M.gobiense)、哈娃斯中慢生根瘤菌(M.hawassense)、华癸中慢生根瘤菌(M.huakuii)、百脉中慢生根瘤菌(M.loti)、地中海中慢生根瘤菌(M.mediterraneum)、耐重金属中慢生根瘤菌(M.metallidurans)、木垒中慢生根瘤菌(M.muleiense)、机会中慢生根瘤菌(M.opportunistum)、多源中慢生根瘤菌(M.plurifarium)、庆笙中慢生根瘤菌(M.qingshengii)、刺槐中慢生根瘤菌(M.robiniae)、桑格中慢生根瘤菌(M.sangaii)、银木中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、香格里拉中慢生根瘤菌(M.shangrilense)、休嫩斯中慢生根瘤菌(M.shonense)、西拉莫润嫩斯中慢生根瘤菌(M.silamurunense)、泰美德恩斯中慢生根瘤菌(M.tamadayense)、塔里木中慢生根瘤菌(M.tarimense)、温带中慢生根瘤菌(M.temperatum)、硫恒河中慢生根瘤菌(M.thiogangeticum)、天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense))、绿僵菌属(Metarhizium)(例如，金龟子绿僵菌(M.anisopliae)(还被称为褐色绿僵菌(M.brunneum)、金龟子绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)和绿圆叶葡萄菌(green muscadine))菌株，诸如IMI 330189、FI-985、FI-1045、F52(保藏为DSM 3884、DSM3885、ATCC 90448、SD 170和ARSEF 7711)和ICIPE69)，黄绿绿僵菌(M.flavoviride)菌株，诸如ATCC 32969)、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如，粘甲基杆菌(M.adhaesivum)、气生甲基杆菌(M.aerolatum)、嗜胺甲基杆菌(M.aminovorans)、水生甲基杆菌(M.aquaticum)、分枝甲基杆菌(M.brachiatum)、青藓甲基杆菌(M.brachythecii)、气泡甲基杆菌(M.bullatum)、色瑞斯提甲基杆菌(M.cerastii)、氯甲烷甲基杆菌(M.chloromethanicum)、丹口肯斯甲基杆菌(M.dankookense)、二氯甲烷甲基杆菌(M.dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌(M.extorquens)、藤泽甲基杆菌(M.fujisawaense)、鼠曲草甲基杆菌(M.gnaphalii)、格辛甲基杆菌(M.goesingense)、棉生甲基杆菌(M.gossipiicola)、动物群甲基杆菌(M.gregans)、小羽藓甲基杆菌(M.haplocladii)、西班牙甲基杆菌(M.hispanicum)、懒惰甲基杆菌(M.iners)、伊斯比利亚甲基杆菌(M.isbiliense)、咸海鲜甲基杆菌(M.jeotgali)、驹形氏甲基杆菌(M.komagatae)、长甲基杆菌(M.longum)、葡萄牙甲基杆菌(M.lusitanum)、地钱甲基杆菌(M.marchantiae)、嗜中温甲基杆菌(M.mesophilicum)、结瘤甲基杆菌(M.nodulans)、嗜有机甲基杆菌(M.organophilum)、稻甲基杆菌(M.oryzae)、酢浆草甲基杆菌(M.oxalidis)、桃红甲基杆菌(M.persicinum)、叶际甲基杆菌(M.phyllosphaerae)、悬铃木甲基杆菌(M.platani)、根际甲基杆菌(M.podarium)、极甲基杆菌(M.populi)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)、罗氏甲基杆菌(M.rhodesianum)、浅红甲基杆菌(M.rhodinum)、海水甲基杆菌(M.salsuginis)、索里甲基杆菌(M.soli)、芬兰甲基杆菌(M.suomiense)、慢生甲基杆菌(M.tardum)、塔尔汗甲基杆菌(M.tarhaniae)、硫氰酸盐甲基杆菌(M.thiocyanatum)、苏云金甲基杆菌(M.thurigiense)、三叶草甲基杆菌(M.trifolii)、易变甲基杆菌(M.variabile)、扎氏甲基杆菌(M.zatmanii))、梅奇酵母属(Metschnikowia)(例如，果生梅奇酵母(M.fructicola))、微杆菌属(Microbacterium)(例如，产左聚糖微杆菌(M.laevaniformans))、微结节菌属(Microdochium)(例如，单隔微结节菌(M.dimerum))、小球壳孢属(Microsphaeropsis)(例如，赭小球壳孢(M.ochracea)P130A)、微枝形杆菌属(Microvirga)(例如，气生微枝形杆菌(M.aerilata)、嗜气微枝形杆菌(M.aerophila)、絮状微枝形杆菌(M.flocculans)、广西微枝形杆菌(M.guangxiensis)、罗顿豆微枝形杆菌(M.lotononidis)、羽扇豆微枝形杆菌(M.lupini)、地下微枝形杆菌(M.subterranea)、豇豆微枝形杆菌(M.vignae)、赞比亚微枝形杆菌(M.zambiensis))、单顶孢属(Monacrosporium)(例如，柱捕单顶孢(M.cionopagum))、毛霉属、产气霉属(Muscodor)(例如，白色产气霉(M.albus)，诸如NRRL 30547、QST 20799和SA-13，粉红产气霉(M.roseus)菌株，诸如NRRL30548)、醭酵母属(Mycoderma)、蝇壶菌属(Myiophagus)、多腔菌属(Myriangium)、漆斑菌属(例如，疣孢漆斑菌(M.verrucaria))、丛赤壳属(Nectria)、毒虫霉属(Nematoctonus)(例如，吉奥吉尼斯毒虫霉(N.geogenius)、滑孢毒虫霉(N.leiosporus))、新接霉属(Neozygites)、野村菌属(Nomuraea)(例如，莱氏野村菌(N.rileyi)菌株，诸如SA86101、GU87401、SR86151、CG128和VA9101)、念珠藻属(例如，满江红念珠藻(N.azollae)、石青念珠藻(N.caeruleum)、肉色念珠藻(N.carneum)、粉末念珠藻(N.comminutum)、普通念珠藻(N.commune)、椭孢念珠藻(N.ellipsosporum)、发状念珠藻(N.flagelliforme)、林氏念珠藻(N.linckia)、朗斯塔夫念珠藻(N.longs taffi)、微小念珠藻(N.microscopicum)、灰色念珠藻(N.muscorum)、沼泽念珠藻(N.paludosum)、梅型念珠藻(N.pruniforme)、点形念珠藻(N.punctifrome)、球形念珠藻(N.sphaericum)、球状念珠藻(N.sphaeroides)、海绵状念珠藻(N.spongiaeforme)、裂褶念珠藻(N.verrucosum))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如，人苍白杆菌(O.anthropi)、西塞罗苍白杆菌(O.cicero)、金雀儿苍白杆菌(O.cytisi)、大田苍白杆菌(O.daejeonense)、母鸡粪苍白杆菌(O.gallinifaecis)、格瑞根嫩斯苍白杆菌(O.grigonense)、广州苍白杆菌(O.guangzhouense)、嗜血苍白杆菌(O.haematophilum)、中间苍白杆菌(O.intermedium)、羽扇豆苍白杆菌(O.lupini)、稻苍白杆菌(O.oryzae)、克冠酸钠苍白杆菌(O.pectoris)、粘液苍白杆菌(O.pituitosum)、假中间体苍白杆菌(O.pseudointermedium)、假格里朗苍白杆菌(O.pseudogrignonense)、根球虫苍白杆菌(O.rhizosphaerae)、食噻吩苍白杆菌(O.thiophenivorans)、小麦苍白杆菌(O.tritici))、树粉孢属(Oidiodendron)、拟青霉属(例如，玫烟色拟青霉(P.fumosoroseus)菌株，诸如FE991和FE 9901，淡紫色拟青霉(P.lilacinus)菌株，诸如251、DSM 15169和BCP2)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(例如，蜂房类芽孢杆菌(P.alvei)菌株，诸如NAS6G6，固氮类芽孢杆菌(P.azotofixans)，多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)菌株，诸如ABP166(保藏为NRRL B-50211))、虫疠霉属(Pandora)、泛菌属(Pantoea)(例如，成团泛菌(P.agglomerans)菌株，诸如NRRL B-21856、泛生泛菌(P.vagans)菌株，诸如C9-1)、类球囊霉属(Paraglomus)(例如，巴西类球囊霉(P.brazilianum))、羽束梗孢属(Paraisaria)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、巴斯德氏芽菌属(例如，西泽巴斯德氏芽菌(P.nishizawae)菌株，诸如Pnl，穿刺巴斯德氏芽菌(P.penetrans)，分支巴斯德氏芽菌(P.ramose)，巴斯德氏芽菌种菌株，诸如ATCC PTA-9643和ATCC SD-5832，索恩巴斯德氏芽菌(P.thornea)，乌沙格巴斯德氏芽菌(P.usage))、青霉属(例如，发白青霉(P.albidum)，橘灰青霉(P.aurantiogriseum)，比莱青霉(以前称为比莱伊青霉(P.bilaii)和比拉伊青霉(P.bilaji))菌株，诸如ATCC 18309、ATCC 20851、ATCC 22348、NRRL 50162、NRRL 50169、NRRL 50776、NRRL 50777、NRRL 50778、NRRL 50777、NRRL 50778、NRRL 50779、NRRL 50780、NRRL 50781、NRRL 50782、NRRL 50783、NRRL 50784、NRRL 50785、NRRL 50786、NRRL 50787、NRRL 50788和RS7B-SD1，短密青霉菌株，诸如AgRFl8，变灰青霉菌株，诸如ATCC 10419，产黄青霉(P.chyrsogenum)，黄暗青霉(P.citreonigrum)，桔青霉(P.citrinum)，指状青霉，扩展青霉菌株，诸如ATCC 24692和YT02，费拉塔纳姆青霉菌株，诸如ATCC 48694，常现青霉(P.frequentas)，锈色青霉(P.fuscum)，富西珀勒斯青霉(P.fussiporus)，加斯特氏青霉菌株，诸如NRRL 50170，光孢青霉(P.glabrum)菌株，诸如DAOM 239074和CBS 229.28，灰绿青霉(P.glaucum)，灰黄青霉(P.griseofulvum)，纠缠青霉(P.implicatum)，微紫青霉菌株，诸如ATCC 10455，诺索可鲁里木青霉菌株，诸如ATCC48919，淡紫青霉，朱黄青霉(P.minioluteum)，山地青霉(P.montanense)，黑青霉(P.nigricans)，草酸青霉(P.oxalicum)，松木青霉(P.pinetorum)，嗜松青霉(P.pinophilum)，产紫青霉(P.purpurogenum)，甘蓝青霉菌株，诸如ATCC 201836、FRR 4717、FRR 4719和N93/47267，雷斯特里克青霉菌(P.raistrickii)菌株，诸如ATCC 10490，皱褶青霉(P.rugulosum)，简青霉(P.simplicissimum)，离生青霉(P.solitum)，变幻青霉(P.variabile)，绒状青霉(P.velutinum)，纯绿青霉(P.viridicatum))、鞘氨醇杆菌属(Phingobacterium)、伏革菌属(Phlebiopsis)(例如，大伏革菌(P.gigantea))、发光杆菌属(Photorhabdus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)(例如，勃艮第叶杆菌(P.bourgognense)、油菜叶杆菌(P.brassicacearum)、墓穴叶杆菌(P.catacumbae)、内生叶杆菌(P.endophyticum)、黄芪叶杆菌(P.ifriqiyense)、豆科植物叶杆菌(P.leguminum)、百脉根叶杆菌(P.loti)、紫金牛叶杆菌(P.myrsinacearum)、槐叶杆菌(P.sophorae)、三叶草叶杆菌(P.trifolii))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，异常毕赤酵母(P.anomala)菌株，诸如WRL-076)、豆马勃属(Pisolithus)(例如，彩色豆马勃(P.tinctorius))、拟浮丝藻属(Planktothricoides)、织线藻属(Plectonema)、侧链孢属(Pleurodesmospora)、普可尼亚菌属(Pochonia)(例如，厚垣孢普可尼亚菌(P.chlamydopora))、丛赤壳菌属(Podonectria)、多头霉属(Polycephalomyces)、原绿球藻属(Prochlorocoous)(例如，海洋原绿球藻(P.marinus))、原绿藻属(Prochloron)(例如，原绿藻(P.didemni))、原绿发藻属(Prochlorothrix)、拟球束梗孢属(Pseudogibellula)、假单胞菌属(例如，伞菊假单胞菌(P.agarici)，南极假单胞菌(P.antartica)，桔黄假单胞菌(P.aurantiaca)，致金色假单胞菌(P.aureofaciens)，固氮假单胞菌(P.azotiflgens)，生氮假单胞菌(P.azotoformans)，巴利阿里假单胞菌(P.balearica)，布拉奇福特假单胞菌(P.blatchfordae)，油菜假单胞菌(P.brassicacearum)，布氏假单胞菌(P.brenneri)，大麻假单胞菌(P.cannabina)，松柏假单胞菌(P.cedrina)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)，绿针假单胞菌(P.chlororaphis)菌株，诸如MA 342，结冰假单胞菌(P.congelans)，起皱假单胞菌(P.corrugata)，康氏假单胞菌(P.costantinii)，脱氮假单胞菌(P.denitrileans)，喜昆虫假单胞菌(P.entomophila)，荧光假单胞菌(P.fluorescem)菌株，诸如ATCC 27663、CL 145A和A506，莓实假单胞菌(P.fragii)，褐鞘假单胞菌(P.fuscovaginae)，黄褐假单胞菌(P.fulva)，盖氏假单胞菌(P.gessardii)，杰氏假单胞菌菌株，诸如PS06，基尔假单胞菌(P.kilonensis)，韩国假单胞菌(P.koreensis)，黎巴嫩假单胞菌(P.libanensis)，里里假单胞菌(P.lili)，隆德假单胞菌(P.lundensis)，藤黄假单胞菌(P.lutea)，浅黄假单胞菌(P.luteola)，孟氏假单胞菌(P.mandelii)，边缘假单胞菌(P.marginalis)，地中海假单胞菌(P.meditrranea)，子午线假单胞菌(P.meridana)，米氏假单胞菌(P.migulae)，摩拉维亚假单胞菌(P.moraviensis)，霉味假单胞菌(P.mucidolens)，东方假单胞菌(P.orientalis)，稻皮假单胞菌(P.oryzihabitans)，帕氏假单胞菌(P.palleroniana)，人参假单胞菌(P.panacis)，副黄假单胞菌(P.parafulva)，烂泥假单胞菌(P.peli)，穿孔假单胞菌(P.pertucinogena)，香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)，硫辛酸假单胞菌(P.protogens)，解朊假单胞菌(P.proteolytica)，恶臭假单胞菌，皮西那假单胞菌(P.pyrocina)菌株，诸如ATCC 15958，罗氏假单胞菌(P.rhodesiae)，假单胞菌属种菌株，诸如DSM 13134，条纹假单孢菌(P.striata)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)，丁香假单胞菌(P.syringae)，产黄假单胞菌(P.synxantha)，腐臭假单胞菌(P.taetrolens)，西斯福瓦伦西斯假单胞菌(P.thisvervalensis)，托拉假单胞菌(P.tolaasii)，斡氏假单胞菌(P.veronii))、假酵母状菌属(Pseudozyma)(例如，絮绒酵母状菌(P.flocculosa)菌株，诸如PF-A22 UL)、腐霉属(例如，寡雄腐霉(P.oligandrum)菌株，诸如DV 74)、根瘤菌属(例如，集结根瘤菌(R.aggregatum)，奥氏根瘤菌(R.alamii)，碱土根瘤菌(R.alkalisoli)，蜂房根瘤菌(P.alvei)，阿齐根瘤菌(P.azibense)，污泥根瘤菌(P.borbori)，朱缨花根瘤菌(R.calliandrae)，中国农大根瘤菌(R.cauense)，解纤维素根瘤菌(R.cellulosilyticum)，大田根瘤菌(R.daejeonense)，石内根瘤菌(R.endolithicum)，内生根瘤菌(R.endophyticum)，菜豆根瘤菌(R.etli)，蚕豆根瘤菌(R.fabae)，黄色(R.flavum)，费氏根瘤菌(R.fredii)，弗莱雷根瘤菌(R.freirei)，山羊豆根瘤菌(R.galegae)，高卢根瘤菌(R.gallicum)，贾氏根瘤菌(R.giardinii)，葛拉汉米根瘤菌(R.grahamii)，海南根瘤菌(R.hainanense)，栖盐生植物中间根瘤菌(R.halophytocola)，耐盐根瘤菌(R.halotolerans)，贺兰山根瘤菌(R.helanshanense)，草本根瘤菌(R.herbae)，洪特拉根瘤菌(R.huautlense)，木蓝根瘤菌(R.indigoferae)，雅瓜里根瘤菌(R.jaguaris)，昆明根瘤菌(R kunmingense)，拉格雷根瘤菌(R.laguerreae)，拉氏根瘤菌(R.larrymoorei)，豆根瘤菌(R.leguminosarum)菌株，诸如S012A-2(IDAC 080305-01)，浮萍根瘤菌(R.lemnae)，银合欢根瘤菌(R.leucaenae)，黄土根瘤菌(R.loessense)，羽扇豆根瘤菌(R.lupini)，葡萄牙根瘤菌(R.lusitanum)，山楂花根瘤菌(R.mayense)，中美洲根瘤菌(R.mesoamericanum)，华中根瘤菌(R.mesosinicum)，汨罗江根瘤菌(R.miluonense)，蒙古根瘤菌(R.mongolense)，多宿主根瘤菌(R.multihospitium)，食萘根瘤菌(R.naphthalenivorans)，内波特姆根瘤菌(R.nepotum)，水稻根瘤菌(R.oryzae)，巴基斯坦根瘤菌(R.pakistanensis)，北榄根瘤菌(R.paknamense)，巴拉那根瘤菌(R.paranaense)，石油根瘤菌(R.petrolearium)，菜豆根瘤菌(R.phaseoli)，解菲根瘤菌(R.phenanthrenilyticum)，豌豆根瘤菌(R.pisi)，水黄皮根瘤菌(R.pongamiae)，杨根瘤菌(R.populi)，假稻根瘤菌(R.pseudoryzae)，普沙根瘤菌(R.pusense)，祁连山根瘤菌(R.qilianshanese)，放射形根瘤菌(R.radiobacter)，发根根瘤菌(R.rhizogenes)，水稻根根瘤菌(R rhizoryzae)，罗泽第福曼斯根瘤菌(Rrozettiformans)，悬钩子根瘤菌(R.rubi)，塞尔尼地雷德赛斯根瘤菌(R.selenitireeducens)，斯凯尔涅维采根瘤菌(R.skierneiwicense)，鹿药根瘤菌(R.smilacinae)，土壤根瘤菌(R.soli)，槐根瘤菌(R.sophorae)，槐根根瘤菌(Rsophoriradicis)，苦马豆根瘤菌(R.sphaerophysae)，稻杆根瘤菌(R.straminoryzae)，萨博拉尼斯根瘤菌(R.subbaraonis)，岩黄芪根瘤菌(R.sullae)，太白山根瘤菌(R.taibaishanense)，塔里木根瘤菌(R.tarimense)，西藏根瘤菌(R.tibeticum)，三叶草根瘤菌(R.trifolii)菌株，诸如RP113-7，热带根瘤菌(R.tropici)菌株，诸如SEMIA 4080，吐蕃根瘤菌(R.tubonense)，居水根瘤菌(R.undicola)，红河谷根瘤菌(R.vallis)，野豌豆根瘤菌(R.viciae)菌株，诸如PlNP3Cst、SU303和WSM 1455，绿豆根瘤菌(R.vignae)，葡萄根瘤菌(R.vitis)，杨凌根瘤菌(R.yanglingense)，盐亭根瘤菌(R.yantingense))、丝核菌属、须腹菌属(Rhizopogon)(例如，须淀粉须腹菌(R.amylopogon)、尔维氏须腹菌(R.fulvigleba)、浅黄根须腹菌(R.luteolus)、长毛须腹菌(R.villosuli))、红球菌属(Rhodococcus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)(例如，刺糖多孢菌(S.spinosd))、硬皮马勃属(Scleroderma)(例如，光硬皮马勃(S.cepa)、橙黄硬皮马勃(S.citrinum))、隔担耳属(Septobasidium)、沙雷氏菌属(Serratia)、申氏菌属(Shinella)(例如，鸡眼草申氏菌(S.kummerowiae))、中华根瘤菌属(Sinorhizoium)(例如，岩穴中华根瘤菌(S.abri)，粘着中华根瘤菌(S.adhaerens)，美洲中华根瘤菌(S.americanum)，木本树中华根瘤菌(S.arboris)，恰帕斯中华根瘤菌(S.chiapanecum)，费氏中华根瘤菌(S.fredii)菌株，诸如CCBAU114和USDA 205，格拉马提卡斯中华根瘤菌(S.garamanticus)，印度中华根瘤菌(S.indiaense)，柯斯第中华根瘤菌(S.kostiense)，鸡眼草中华根瘤菌(S.kummerowiae)，苜蓿中华根瘤菌(S.medicae)，草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)菌株，诸如MSDJ0848，墨西哥中华根瘤菌(S.mexicanus)，努米底亚中华根瘤菌(S.numidicus)，补骨脂中华根瘤菌(S.psoraleae)，萨赫靳中华根瘤菌(S.saheli)，田菁中华根瘤菌(S.sesbaniae)，大豆中华根瘤菌(S.sojae)，好客中华根瘤菌(S.terangae)，新疆中华根瘤菌(S.xinjiangense))、小团孢属(Sorosporella)、球壳属(Sphaerodes)(例如，真菌寄生球壳(S.mycoparasitica)菌株，诸如IDAC301008-01)、灰翅夜蛾属(Spodoptera)(例如，海灰翅夜蛾(S.littoralis))、拟小孢霉属(Sporodiniella)、斯氏线虫属(Steinernema)(例如，小卷蛾斯氏线虫(S.carpocapsae)、夜蛾斯氏线虫(S.feltiae)、克劳瑟斯氏线虫(S.kraussei)菌株，诸如L137)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(例如，链霉菌属NRRL B-30145，链霉菌属M1064，链霉菌属WYE 53(保藏为ATCC 55750)，可可链霉菌(S.cacaoi)菌株，诸如ATCC19093，鲜黄链霉菌(S.galbus)菌株，诸如NRRL 30232，灰绿链霉菌(S.griseoviridis)菌株，诸如K61，利迪链霉菌(S.lydicus)菌株，诸如WYEC 108(保藏为ATCC 55445)，紫黑链霉菌(S.violaceusniger)菌株，诸如YCED-9(保藏为ATCC 55660))、链孢子囊菌属(Streptosporangium)、小束梗孢菌属(Stillbella)、斯瓦米纳坦氏菌属(Swaminathania)、踝节菌属(Talaromyces)(例如，棘孢踝节菌(T.aculeatus)、黄色踝节菌(T.flavus)菌株，诸如Vl l7b)、四臂壳孢属(Tetranacrium)、硫杆菌属、多头束霉属(Tilachlidium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、单歧藻属(Tolypothrix)、虫壳菌属(Torrubiella)、有孢圆酵母属(Torulospora)、特雷诺真菌属(Trenomyces)、木霉属(例如，棘孢木霉(T.asperellum)菌株，诸如SKT-l，深绿木霉(T.atroviride)菌株，诸如LC52和CNCM 1-1237，顶孢木霉(T.fertile)菌株，诸如JM41R，盖姆斯木霉(T.gamsii)菌株，诸如ICC 080，钩状木霉(T.hamatum)菌株，诸如ATCC 52198，哈茨木霉(T.harzianum)菌株，诸如ATCC 52445、KRL-AG2、T-22、TH-35、T-39和ICC012，多孢木霉(T.polysporum)，里氏木霉(T.reesi)菌株，诸如ATCC 28217，子座木霉(T.stromaticum)，绿木霉(T.virens)菌株，诸如ATCC 58678、GL-3、GL-21和G-41，绿色木霉(T.viridae)菌株，诸如ATCC 52440、ICC080和TV1)、核瑚菌属(Typhula)、细基格孢属(Ulocladium)(例如，奥德曼细基格孢(U oudemansii)菌株，诸如HRU3)、拟锈菌属(Uredinella)、贪噬菌属(Variovorax)、轮枝孢属(Verticillium)(例如，厚垣孢轮枝孢(V.chlamydosporum)，蜡蚧轮枝孢(V.lecanii)菌株，诸如ATCC 46578)、弧菌属(Vibrio)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、黄单胞菌属、致病杆菌属(Xenorhadbus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如，嗜虫耶尔森氏菌(Y.entomophaga)菌株，诸如082KB8)和虫瘟霉属(Zoophthora)。
线虫拮抗性生物控制剂的一些实例包括ARF18；节丛孢属某些种；毛壳属某些种；柱孢霉属(Cylindrocarpon)某些种；外瓶霉属(Exophilia)某些种；镰刀菌属某些种；粘帚霉属某些种；被毛孢属某些种；蚧霉属某些种；单顶孢属某些种；漆斑菌属某些种；新赤壳属(Neocosmospora)某些种；拟青霉属某些种；普可尼亚菌属某些种；壳多孢属(Stagonospora)某些种；泡囊-丛枝状菌根真菌、伯克霍尔德菌属某些种；巴斯德氏芽菌属某些种、短芽孢杆菌属某些种；假单胞菌属某些种；和根际细菌(Rhizobacteria)。线虫拮抗性生物控制剂可包括ARF18、少孢节丛孢、指状节丛孢、球毛壳菌、异丝藻柱孢霉(Cylindrocarpon heteronema)、甄氏外瓶霉、嗜鱼外瓶霉、镰刀菌属曲霉属、茄镰刀菌、链孢粘帚霉、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、绿粘帚霉(Gliocladium vixens)、洛斯里被毛孢、明尼苏达被毛孢、蜡蚧霉、掘氏单顶孢(Monacrosporium drechsleri)、哺噬单顶孢(Monacrosporium gephyropagum)、疣孢漆斑菌、侵管新赤壳(Neocosmosporavasinfecta)、淡紫色拟青霉、厚垣孢普可尼亚菌、异皮壳多孢、菜豆壳多孢、泡囊-丛枝状菌根真菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、穿刺巴斯德氏芽菌、索恩巴斯德氏芽菌、西泽巴斯德氏芽菌、分支巴斯德氏芽菌、乌沙格巴斯德氏芽菌、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)菌株G4、荧光假单胞菌和根际细菌。
可从任何来源获得可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物。在一些情况下，微生物可以是细菌、古细菌、原生动物或真菌。本公开的微生物可以是磷酸盐增溶微生物，例如磷酸盐增溶细菌、磷酸盐增溶古细菌、磷酸盐增溶真菌、磷酸盐增溶酵母菌或磷酸盐增溶原生动物。可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物可以是形成孢子的微生物，例如形成孢子的细菌。在一些情况下，可用于本文所公开的方法和组合物中的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些情况下，所述细菌可以是厚壁菌门(Firmicute)的形成内生孢子的细菌。在一些情况下，所述细菌可以是固氮生物。在一些情况下，所述细菌可以不是固氮生物。
本公开的方法和组合物可与诸如例如嗜热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus)的古细菌一起使用。
在一些情况下，可能有用的细菌包括但不限于放射形土壤杆菌、酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、酸土芽孢杆菌(Bacillus acidoterrestris)、土壤芽孢杆菌(Bacillus agri)、相泽芽孢杆菌(Bacillus aizawai)、乳白芽孢杆菌(Bacillusalbolactis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、氨基糖苷芽孢杆菌(Bacillus aminoglucosidicus)、噬胺芽孢杆菌(Bacillusaminovorans)、溶淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolyticus)(还被称为溶淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus))、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillusaneurinolyticus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽孢杆菌(Bacillusazotoformans)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、蜡样芽孢杆菌(同义词：内节律芽孢杆菌(Bacillus endorhythmos)和水母芽孢杆菌(Bacillus medusa))、角质孢子芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、内寄生芽孢杆菌(Bacillusendoparasiticus)、苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)、强固芽孢杆菌、库斯塔克芽孢杆菌(Bacillus kurstaki)、栖乳芽孢杆菌(Bacillus lacticola)、乳病芽孢杆菌(Bacillus lactimorbus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)(还被称为侧孢短芽孢杆菌)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、缓死芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣形芽孢杆菌、摩洛哥芽孢杆菌(Bacillus maroccanus)、巨大芽孢杆菌、剑麻芽孢杆菌(Bacillus metiens)、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、杀线虫芽孢杆菌(Bacillusnematocida)、致黑芽孢杆菌(Bacillus nigrificans)、黑芽孢杆菌(Bacillus nigrum)、泛养芽孢杆菌(Bacillus pantothenticus)、金龟子芽孢杆菌(Bacillus popillae)、冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、单鞭毛芽孢杆菌(Bacillus uniflagellatus)、大豆慢生根瘤菌、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、侧孢短芽孢杆菌(以前为侧孢芽孢杆菌)、萨布茨格色杆菌、食酸代尔夫特菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、抗生素溶杆菌、产酶溶杆菌、蜂房类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)(以前为日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae))、成团泛菌、穿刺巴斯德氏芽菌(以前为穿刺芽孢杆菌)、犹斯盖巴斯德氏芽菌(Pasteuria usgae)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)(以前为胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora))、铜绿假单胞菌、致金色假单胞菌、洋葱假单胞菌(以前称为洋葱伯克霍尔德氏菌)、绿针假单胞菌、荧光假单胞菌、普罗拉迪(Pseudomonas proradix)、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、粘质沙雷氏菌、哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)、五色链霉菌(Streptomycesgoshikiensis)、灰绿链霉菌、薰衣草链霉菌(Streptomyces lavendulae)、葱绿链霉菌(Streptomyces prasinus)、萨腊赛链霉菌(Streptomyces saraceticus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)AQ719(NRRL登记号B-21663)、芽孢杆菌属种AQ175(ATCC登记号55608)、芽孢杆菌属种AQ 177(ATCC登记号55609)、芽孢杆菌属种AQ178(ATCC登记号53522)和链霉菌属种菌株NRRL登记号B-30145。在一些情况下，所述细菌可以是圆褐固氮菌、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、肺炎克雷伯菌、棕色固氮菌、球形红杆菌(Rhodobacter spharoides)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红杆菌(Rhodobcter palustris)、深红红螺菌(Rhodosporillum rubrum)、豆根瘤菌或菜豆根瘤菌。
在一些情况下，所述细菌可以是梭菌属种，例如，巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌(Clostridium tetani)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以是蓝细菌。蓝细菌属的实例包括鱼腥藻属(例如，鱼腥藻属种PCC7120)、念珠藻属(例如，点形念珠藻(Nostocpunctiforme))或集胞藻属(Synechocystis)(例如，集胞藻属种PCC6803)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可属于绿菌门(Chlorobi)，例如微温绿菌。
本文所述的微生物和产生微生物的方法可适用于能够在叶表面、根表面或植物组织内部有效地自繁殖而不诱导破坏性植物防御反应的微生物，或抵抗植物防御反应的微生物。可通过在不添加可溶性磷的培养基中培养植物组织、植物组织提取物、根表面洗涤物或叶表面洗涤物来分离本文所述的微生物。本文所述的微生物可以是内生菌或附生菌或栖居在植物根际的微生物(根际微生物)。内生菌是进入植物内部而不引起疾病症状或诱发共生结构形成的生物体，并且由于它们可促进植物生长并改善植物的营养(例如，通过磷酸盐增溶)而有农艺学意义。微生物可以是种传内生菌。种传内生菌包括与草或植物的种子相关或来源于草或植物的种子的微生物，诸如在成熟、干燥、未受损(例如，无裂缝、无可见真菌感染或无过早萌发)的种子中发现的种传细菌内生菌。种传细菌内生菌可与种子的表面缔合或者来源于种子的表面；替代地或另外，它可与内部种子隔室(例如，表面灭菌的种子的内部种子隔室)缔合，或者来源于内部种子隔室(例如，表面灭菌的种子的内部种子隔室)。在一些情况下，种传内生菌能够在植物组织(例如，种子的内部)内复制。此外，在一些情况下，种传内生菌能够在干燥条件下存活。
根据本公开的方法或用于本公开的方法或组合物中的微生物可包含呈组合形式的多种不同的微生物分类群。举例来说，微生物可包括变形菌门(Proteobacteria)(诸如假单胞菌属、肠杆菌属、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克霍尔德菌属、根瘤菌属、草螺菌属(Herbaspirillum)、泛菌属、沙雷氏菌属、拉恩菌属、固氮螺菌属、固氮根瘤菌属、固氮菌属、杜擀氏菌属(Duganella)、代尔夫特菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属和嗜盐菌属(Halomonas))、硬壁菌门(Firmicutes)(诸如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)和醋酸杆菌属(Acetabacterium))和放线菌门(Actinobacteria)(诸如链霉菌属、红球菌属、微杆菌属和短小杆菌属)。
可通过本文所公开的方法修饰的细菌包括固氮菌属种、慢生根瘤菌属种、克雷伯菌属种和中华根瘤菌属种。在一些情况下，所述细菌可选自由以下组成的组：棕色固氮菌、大豆慢生根瘤菌、肺炎克雷伯菌和中华草木樨根瘤菌。在一些情况下，所述细菌可属于肠杆菌属或拉恩菌属。在一些情况下，所述细菌可属于弗兰克氏菌属或梭菌属。梭菌属细菌的实例包括但不限于丙酮丁醇梭菌、巴斯德梭菌、拜氏梭菌、产气荚膜梭菌和破伤风梭菌。在一些情况下，所述细菌可属于类芽孢杆菌属，例如固氮类芽孢杆菌、北风类芽孢杆菌(Paenibacillus borealis)、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、多粘类芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌、溶淀粉类芽孢杆菌、坎皮纳斯市类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacilluschibensis)、解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、依利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)、幼虫类芽孢杆菌幼虫亚种(Paenibacillus larvaesubsp Larvae)、幼虫类芽孢杆菌尘埃亚种(Paenibacillus larvaesubsp.Pulvifaciens)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、浸麻类芽孢杆菌、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)、马阔里类芽孢杆菌、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)或多粘类芽孢杆菌。
在一些实例中，根据本公开的方法的细菌可以是以下分类群中的一个或多个分类群的成员：无色杆菌属、酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、Acidovoraz、不动杆菌属、游动放线菌属(Actinoplanes)、阿德勒克罗伊茨菌属(Adlercreutzia)、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿菲波菌属(Afipia)、农霉菌属(Agromyces)、屈曲杆菌属(Ancylobacter)、节杆菌属、陌生柱状杆菌属(Atopostipes)、固氮螺菌属、芽孢杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、拜叶林克氏菌属、包西氏菌属、慢生根瘤菌属、短芽孢杆菌属、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德菌属、暂定盐复活菌属(Haloredivivus)、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、柠檬酸杆菌属、梭菌属、珊瑚微球菌属(Coraliomargarita)、棒状杆菌属、贪铜菌属、短小杆菌属、弯钩菌属(Curvibacter)、异常球菌属(Deinococcus)、代尔夫特菌属、德库菌属(Desemzia)、德沃斯氏菌属、独岛菌属(Dokdonella)、戴氏菌属(Dyella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、肠杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属、大肠杆菌属、大肠杆菌属/志贺氏菌属(Shigella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、铁球状菌属(Ferroglobus)、内生丝状单胞菌属(Filimonas)、芬沟德氏菌属(Finegoldia)、黄色土源菌属(Flavisolibacter)、黄杆菌属、寒冷杆菌属(Frigoribacterium)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、盐棒菌属(Halobaculum)、嗜盐菌属、盐简菌属(Halosimplex)、草螺菌属、薄层菌属(Hymenobacter)、克雷伯菌属、考克氏菌属(Kocuria)、小坂菌属(Kosakonia)、乳杆菌属、勒克菌属(Leclercia)、伦茨氏菌属(Lentzea)、藤黄色杆菌属(Luteibacter)、藤黄色单胞菌属(Luteimonas)、马赛菌属(Massilia)、中慢生根瘤菌属、甲基杆菌属、微杆菌属、微球菌属、微枝形杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、大洋棒菌属(Oceanibaculum)、苍白杆菌属、奥卡河杆菌属(Okibacterium)、寡养菌属(Oligotropha)、水稻土菌属(Oryzihumus)、嗜草酸菌属(Oxalophagus)、类芽孢杆菌属、潘替欧菌属(Panteoa)、泛菌属、污泥单胞菌属(Pelomonas)、透明球菌属(Perlucidibaca)、植物杆菌属(Plantibacter)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、丙酸棒状体菌属(Propioniciclava)、假棍状杆菌属(Pseudoclavibacter)、假单胞菌属、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、墨氏菌属(Rheinheimera)、根瘤菌属、红球菌属、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、浅粉不完全光合菌属(Roseateles)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、塞巴尔德氏菌属(Sebaldella)、沉积物芽孢杆菌属(Sediminibacillus)、沉积物杆菌属(Sediminibacterium)、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申氏菌属、中华根瘤菌属、中国孢子囊属(Sinosporangium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇胞菌属(Sphingosinicella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属、窄食单胞菌属(Strenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、栖温境单胞菌属(Tepidimonas)、热单胞菌属(Thermomonas)、硫杆菌属、贪噬菌属、WPS-2位置未定属、黄单胞菌属和齐默尔曼氏菌属(Zimmermannella)。
在一些实施方案中，本公开的微生物可以是不动杆菌属、放线菌属、虫座孢属、土壤杆菌属(例如放射形土壤杆菌菌株，诸如K1026和K84)、刺束梗孢属、产碱杆菌属、链格孢属、氨基杆菌属(例如、阿贺野氨基杆菌、嗜氨基氨基杆菌、绒毛花氨基杆菌、西塞龙氨基杆菌、丽莎氨基杆菌、新泻氨基杆菌)、白粉寄生菌属(例如，白粉寄生菌菌株，诸如M-10)、鱼腥藻属(例如，等长鱼腥藻、近亲鱼腥藻、安格斯第尤马利斯鱼腥藻、安格斯第尤马利斯马其塔鱼腥藻、束丝鱼腥藻、满江红鱼腥藻、博氏鱼腥藻、链状鱼腥藻、雪松鱼腥藻、卷曲鱼腥藻、丝状鱼腥藻、缢缩鱼腥藻、蓝细菌鱼腥藻、苏铁鱼腥藻、柱孢鱼腥藻、棘孢鱼腥藻、费利西尼鱼腥藻、水华鱼腥藻、水华小鱼腥藻、水华特里利氏鱼腥藻、旋蜗牛超科鱼腥藻、崎岖鱼腥藻、拉普鱼渥藻、宽松鱼腥藻、累氏鱼腥藻、雷万鱼腥藻、湖泊鱼腥藻、巨孢鱼腥藻、巨孢罗布斯塔鱼腥藻、高山鱼腥藻、念珠鱼腥藻、阿西拉里兹鱼腥藻、浮游鱼腥藻、拉氏鱼腥藻、许门鱼腥藻、球孢鱼腥藻、粗糙螺旋鱼腥藻、螺旋螺旋鱼腥藻、近圆柱形鱼腥藻、纽曲鱼腥藻、单孢鱼腥藻、多变鱼腥藻、疣状鱼腥藻、威格鱼腥藻、威斯康星鱼腥藻、麒麟鱼腥藻)、节杆菌属、节丛孢属(例如，聚团节丛孢、阿拉斯加节丛孢、单孢节丛孢、异形节丛孢、阿普歇伦节丛孢、葡萄串状节丛孢、阿塞拜疆节丛孢、巴库尼卡节丛孢、葡萄孢节丛孢、环捕节丛孢、查萨里卡节丛孢、智利节丛孢、叶状枝节丛孢、裂环孢节丛孢、致密节丛孢、圆锥节丛孢、收缩节丛孢、柱孢节丛孢、指状节丛孢、偏转节丛孢、枝状节丛孢、桶状节丛孢、掘氏节丛孢、秀丽节丛孢、椭圆孢节丛孢、食虫节丛孢、多刺节丛孢、叶生节丛孢、小灌木节丛孢、球孢节丛孢、哈托斯波拉节丛孢、贺左耶那节丛孢、籼型节丛孢、不规则节丛孢、爪哇节丛孢、吉尔吉斯节丛孢、长节丛孢、长梗节丛孢、长副枝节丛孢、长孢节丛孢、红树孢节丛孢、巨孢节丛孢、小舟形节丛孢、微孢节丛孢、多节肢节丛孢、弯孢节丛孢、食线虫节丛孢、无隔节丛孢、少孢节丛孢、奥德蘑节丛孢、卵形节丛孢、富营养节丛孢、多头节丛孢、拟棒状节丛孢、梨形节丛孢、直节丛孢、罗布斯塔节丛孢、玫红节丛孢、舟形节丛孢、硬菌丝节丛孢、沙赫里亚里节丛孢、狮子山节丛孢、中华节丛孢、索普卢诺维节丛孢、束梗孢节丛孢、蒿秆节丛孢、多孢节丛孢、大不里士节丛孢、秀丽节丛孢、蠕虫节丛孢、云南节丛孢)、座壳孢属、球囊菌属、曲霉属(例如，黄曲霉菌株，诸如NRRL 21882，寄生曲霉)、管链藻属(例如模糊管链藻、非洲管链藻、波希米亚管链藻、孟买管链藻、汇合管链藻、繁育管链藻、繁育管链藻特纽斯变种、费氏管链藻、格多耶那管链藻、交织管链藻、宽松管链藻、普兰顿管链藻、多育管链藻、假枝管链藻、绍因斯兰管链藻、纹状管链藻、陆生管链藻、热腐生管链藻、金杆菌属、短梗霉属(例如，出芽短梗霉菌株，诸如DSM 14940和DSM 14941)、固氮菌类、固氮根瘤菌属(例如，茎瘤固氮根瘤菌、德贝赖纳氏固氮根瘤菌、嗜草酸固氮根瘤菌)、固氮螺菌属(例如，亚马逊固氮螺菌菌株，诸如BR11140(SpY2T)，巴西固氮螺菌菌株，诸如INTA Az-39、AZ39、XOH、BR 11002、BR 11005、Ab-V5和Ab-V6，加拿大固氮螺菌，德贝赖纳氏固氮螺菌，台湾固氮螺菌，高盐固氮螺菌，伊拉克固氮螺菌，大型移动式固氮螺菌，生脂固氮螺菌菌株，诸如BR 11646，糖蜜草固氮螺菌，稻固氮螺菌，皮克斯固氮螺菌，多皱固氮螺菌，嗜硫固氮螺菌，玉米固氮螺菌)、固氮菌属(例如，敏捷固氮菌、亚美尼亚固氮菌、固氮菌属种AR、拜氏固氮菌、圆褐固氮菌、固氮菌属DCU26、固氮菌属FA8、黑色固氮菌、雀稗固氮菌、盐生固氮菌、热带固氮菌、棕色固氮菌)、芽孢杆菌属(例如，解淀粉芽孢杆菌菌株，诸如D747、NRRL B-50349、TJ1000(还被称为1BE、分离物ATCCBAA-390)、FZB24、FZB42、IN937a、IT-45、TJ1000、MBI600、BS27(保藏为NRRL B-5015)、BS2084(保藏为NRRL B-50013)、15AP4(保藏为ATCC PTA-6507)、3AP4(保藏为ATCC PTA-6506)、LSSA01(保藏为NRRL B-50104)、ABP278(保藏为NRRL B-50634)、1013(保藏为NRRLB-50509)、918(保藏为NRRL B-50508)、22CP1(保藏为ATCC PTA-6508)和BS18(保藏为NRRLB-50633)，蜡样芽孢杆菌菌株，诸如1-1562，坚硬芽孢杆菌菌株，诸如1-1582，左旋乳酸芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌菌株，诸如BA842(保藏为NRRL B-50516)和BL21(保藏为NRRL B-50134)，软化芽孢杆菌，坚硬芽孢杆菌，蕈状芽孢杆菌菌株，诸如NRRL B-21664，巴斯德氏芽孢杆菌，短小芽孢杆菌菌株，诸如NRRL B-21662、NRRL B-30087、ATCC 55608、ATCC 55609、GB34、KFP9F和QST 2808，球形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌菌株，诸如ATCC 55078、ATCC 55079、MBI 600、NRRL B-21661、NRRL B-21665、CX-9060、GB03、GB07、QST 713、FZB24、D747和3BP5(保藏为NRRL B-50510)，苏云金芽孢杆菌菌株，诸如ATCC 13367、GC-91、NRRL B-21619、ABTS-1857、SAN 401I、ABG-6305、ABG-6346、AM65-52、SA-12、SB4、ABTS-351、HD-l、EG 2348、EG 7826、EG 7841、DSM 2803、NB-125和NB-176)、拜叶林克氏菌属、白僵菌属(例如，球孢白僵菌菌株，诸如ATCC 26851、ATCC 48023、ATCC 48585、ATCC 74040、ATCC-74250、DSM 12256和PPRI 5339)、拜叶林克氏菌属、芽枝酵母属、包西氏菌属(例如，恩内艾包西氏菌、山黧豆包西氏菌、羽扇豆包西氏菌、马赛包西氏菌、米纳蒂特兰包西氏菌、刺槐包西氏菌、氧化硫包西氏菌、维斯特里斯包西氏菌)、慢生根瘤菌属(例如，花生慢生根瘤菌，贝特慢生根瘤菌，加拿利慢生根瘤菌，金雀慢生根瘤菌，大庆慢生根瘤菌，脱氮慢生根瘤菌，重氮动力慢生根瘤菌，埃氏慢生根瘤菌菌株，诸如SEMIA 501、SEMIA 587和SEMIA 5019，赣州慢生根瘤菌，黄淮海慢生根瘤菌，艾森斯慢生根瘤菌，印加慢生根瘤菌，西表岛慢生根瘤菌，大豆慢生根瘤菌菌株，诸如NRRL B-50586(还保藏为NRRL B-59565)、NRRL B-50587(还保藏为NRRL B-59566)、NRRL B-50588(还保藏为NRRL B-59567)、NRRL B-50589(还保藏为NRRL B-59568)、NRRL B-50590(还保藏为NRRL B-59569)、NRRL B-50591(还保藏为NRRL B-59570)、NRRL B-50592(还保藏为NRRL B-59571)、NRRL B-50593(还保藏为NRRL B-59572)、NRRL B-50594(还保藏为NRRL B-50493)、NRRL B-50608、NRRL B-50609、NRRL B-50610、NRRL B-50611、NRRL B-50612、NRRL B-50726、NRRL B-50727、NRRL B-50728、NRRL B-50729、NRRL B-50730、SEMIA 566、SEMIA 5079、SEMIA 5080、USDA 6、USDA 110、USDA 122、USDA 123、USDA127、USDA 129和USDA 532C，凉薯慢生根瘤菌，扁豆慢生根瘤菌，辽宁慢生根瘤菌，马瑙斯慢生根瘤菌，新热带区慢生根瘤菌，贫营养慢生根瘤菌，渥太华慢生根瘤菌，豆薯慢生根瘤菌，帕克斯莱瑞慢生根瘤菌，雷塔马慢生根瘤菌，瑞芬斯慢生根瘤菌，巴伦西亚慢生根瘤菌，圆明慢生根瘤菌)、伯克霍尔德菌属(例如，阿斯德帕鲁迪斯伯克霍尔德菌，双向伯克霍尔德菌，须芝草伯克霍尔德菌，花核伯克霍尔德菌，树枝状伯克霍尔德菌，班南伯克霍尔德菌，藓生伯克霍尔德菌，喀里多尼亚伯克霍尔德菌，加勒比伯克霍尔德菌，丁香伯克霍尔德菌，洋葱伯克霍尔德菌，秋伊卡伯克霍尔德菌，椰毒伯克霍尔德菌，污染伯克霍尔德菌，脱氮伯克霍尔德菌，重氮养伯克霍尔德菌，扩散伯克霍尔德菌，迪尔沃思伯克霍尔德菌，朵露莎伯克霍尔德菌，象牙伯克霍尔德菌，内生真菌伯克霍尔德菌，法拉利伯克霍尔德菌，真菌伯克霍尔德菌，人参土伯克霍尔德菌，唐菖蒲伯克霍尔德菌，格氏伯克霍尔德菌，荚壳伯克霍尔德菌，禾谷伯克霍尔德菌，紫萼藓伯克霍尔德菌，黑利亚伯克霍尔德菌，医院伯克霍尔德菌，休米伯克霍尔德菌，久留里伯克霍尔德菌，拉塔伯克霍尔德菌，隐藏伯克霍尔德菌，鼻疽伯克霍尔德菌，大都市伯克霍尔德菌，金属伯克霍尔德菌，含羞草伯克霍尔德菌，多嗜伯克霍尔德菌，结瘤伯克霍尔德菌，纽伦堡伯克霍尔德菌，俄克拉荷马伯克霍尔德菌，吩嗪伯克霍尔德菌，吩里拉普伯克霍尔德菌，瘤状伯克霍尔德菌，菲投费门思伯克霍尔德菌，皮氏伯克霍尔德菌，植物伯克霍尔德菌，类鼻疽伯克霍尔德菌，假多嗜伯克霍尔德菌，吡咯伯克霍尔德菌，根霉素伯克霍尔德菌，鹿藿伯克霍尔德菌，清风藤伯克霍尔德菌，蔗糖伯克霍尔德菌，撒提斯索里伯克霍尔德菌，赛迪米内考拉伯克霍尔德菌，精囊伯克霍尔德菌，斯沃兰提卡伯克霍尔德菌，新加坡伯克霍尔德菌，土壤伯克霍尔德菌，索地考拉伯克霍尔德菌，伯克霍尔德菌种菌株，诸如A396，点缀伯克霍尔德菌，稳定伯克霍尔德菌，共生伯克霍尔德菌，碲化伯克霍尔德菌，土伯克霍尔德菌，陆生伯克霍尔德菌，土生伯克霍尔德菌，泰国伯克霍尔德菌，热带伯克霍尔德菌，管伯克霍尔德菌，乌汶伯克霍尔德菌，乌岱斯伯克霍尔德菌，安纳美伯克霍尔德菌，范氏伯克霍尔德菌，越南伯克霍尔德菌，异种伯克霍尔德菌，浙江伯克霍尔德菌)、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属(例如，伯克霍尔德菌新种A396里诺杰NRRL B-50319)、丽赤壳属、假丝酵母属(例如，橄榄假丝酵母属，诸如1-182，齐藤假丝酵母)、暂定种(例如，暂定卡尔瓦伯克霍尔德菌、暂定圆齿伯克霍尔德菌、暂定粗毛伯克霍尔德菌、暂定柯氏伯克霍尔德菌、暂定乳头伯克霍尔德菌、暂定黑点伯克霍尔德菌、暂定硬伯克霍尔德菌、暂定休玛尼内伯克霍尔德菌、暂定维什尔伦伯克霍尔德菌、暂定绿色伯克霍尔德菌、暂定异木麻黄植原体、暂定美洲植原体、暂定星状植原体、暂定橙黄色叶植原体、暂定澳大利亚植原体、暂定拜拉尼提植原体、暂定巴西植原体、暂定番木瓜属植原体、暂定栗属植原体、暂定尼日利亚可可植原体、暂定坦桑尼亚可可植原体、暂定旋花属植原体、暂定哥斯达黎加植原体、暂定狗牙根植原体、暂定蛇莓植原体、暂定秦皮植原体、暂定禾木植原体、暂定日本植原体、暂定丝瓜植原体、暂定番茄植原体、暂定马来西亚植原体、暂定马里植原体、暂定阿曼植原体、暂定稻植原体、暂定棕榈科植原体、暂定棕榈生植原体、暂定腓尼基植原体、暂定皮尼植原体、暂定普鲁尼植原体、暂定普如诺植原体、暂定梨植原体、暂定鼠李植原体、暂定鲁比植原体、暂定茄植原体、暂定斯巴提植原体、暂定南美植原体、暂定柽柳植原体、暂定三叶草植原体、暂定榆叶植原体、暂定葡萄植原体、暂定枣植原体)、色杆菌属(例如，萨布茨格色杆菌NRRL B-30655和PRAA4-1，痘苗色杆菌菌株，诸如NRRL B-50880，紫色色杆菌)、华丽单胞菌属、棒形杆菌属、螺旋聚孢霉属(例如，粉红螺旋聚孢霉链孢变型(还被称为链孢粘帚霉)菌株，诸如J1446)、梭菌属、柯里真菌属、腔壶菌属、刺盘孢属(例如，胶孢刺盘孢菌株，诸如ATCC 52634)、丛毛单胞菌属、耳霉属、盾壳霉属(例如，小盾壳霉菌株，诸如CON/M/91-08)、冬虫夏草属、棒状杆菌属、库奇霉属、隐丛赤壳属(例如，寄生隐丛赤壳)、隐球菌属(例如，白色隐球菌)、异形小卷蛾属(例如，苹果异形小卷蛾)、蚊霉属、贪铜菌属(例如，嗜碱贪铜菌、拜斯勒塞斯贪铜菌、坎皮内斯贪铜菌、格拉迪贪铜菌、拉哈瑞斯贪铜菌、耐金属贪铜菌、沼津贪铜菌、草酸贪铜菌、潘姆帕贪铜菌、罕见贪铜菌、皮那图本内塞斯贪铜菌、瑞斯皮瑞库里贪铜菌、台湾贪铜菌)、短小杆菌属、小卷蛾属(例如，苹果小卷蛾菌株，诸如V03和V22)、指霉属(例如，假丝酵母指霉)、代尔夫特菌属(例如，食酸代尔夫特菌菌株，诸如RAY209)、Desulforibtio、脱硫弧菌属、德沃斯氏菌属(例如，假含羞草属德沃斯氏菌)、二磷酸杆菌属(例如，阿罗帕库瑞二磷酸杆菌)、侧齿霉属、肠杆菌属、噬虫霉属、虫霉属、虫疫霉属、大肠杆菌属(例如，中间型大肠杆菌)、正青霉属、微小杆菌属、丝菌属、线黑粉菌属、黄杆菌属(例如，黄杆菌属H492 NRRL B-50584)、弗兰克氏菌属(例如，桤木弗兰克氏菌)、镰刀菌属(例如，砖红镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄镰刀菌)、球束梗孢属、巨孢囊霉属(例如珍珠巨孢囊霉)、粘帚霉属(例如，绿粘帚霉菌株，诸如ATCC 52045和GL-21)、球囊霉属(例如，聚丛球囊霉，巴西球囊霉，明球囊霉，沙漠球囊霉，幼套球囊霉，集球囊霉，根内球囊霉菌株，诸如RTI-801，单孢球囊霉，摩西球囊霉)、葡糖杆菌属、盐螺旋藻属、钩丝孢属(例如，鳗形线虫钩丝孢)、金星菌属、被毛孢属(例如，明尼苏达被毛孢，洛斯里被毛孢，滇缅花楸被毛孢菌株，诸如ATCC24874)、噬氢菌属、膜盘菌属(例如，灰斑膜盘菌)、层梗孢属、亚肉座菌属、棒束孢属(例如，玫烟棒束孢菌株，诸如Apopka-97(保藏为ATCC 20874))、克雷伯菌属(例如，肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌)、克吕沃氏菌属、蜡蘑属(例如，双色蜡蘑、漆蜡蘑)、乳杆菌属、链壶菌属、蚧霉属(例如，蜡蚧霉菌株，诸如KV01，长孢疥霉菌株，诸如KV42和KV71)、细囊霉属、溶杆菌属(例如，抗生素溶杆菌菌株，诸如13-1和HS124，产酶溶杆菌菌株，诸如3.1T8)、团孢霉属、顶裂霉属(例如，星孢顶裂霉)、中慢生根瘤菌属(例如，阿比西尼亚中慢生根瘤菌、合欢中慢生根瘤菌、骆驼刺中慢生根瘤菌、紫穗槐中慢生根瘤菌、澳大利亚中慢生根瘤菌、骆驼刺中慢生根瘤菌、锦鸡儿中慢生根瘤菌、查科中慢生根瘤菌、鹰嘴豆中慢生根瘤菌、戈壁中慢生根瘤菌、哈娃斯中慢生根瘤菌、华癸中慢生根瘤菌、百脉中慢生根瘤菌、地中海中慢生根瘤菌、耐重金属中慢生根瘤菌、木垒中慢生根瘤菌、机会中慢生根瘤菌、多源中慢生根瘤菌、庆笙中慢生根瘤菌、刺槐中慢生根瘤菌、桑格中慢生根瘤菌、银木中慢生根瘤菌、香格里拉中慢生根瘤菌、休嫩斯中慢生根瘤菌、西拉莫润嫩斯中慢生根瘤菌、泰美德恩斯中慢生根瘤菌、塔里木中慢生根瘤菌、温带中慢生根瘤菌、硫恒河中慢生根瘤菌、天山中慢生根瘤菌)、绿僵菌属(例如，金龟子绿僵菌(还被称为褐色绿僵菌、金龟子绿僵菌和绿圆叶葡萄菌)菌株，诸如IMI 330189、FI-985、FI-1045、F52(保藏为DSM 3884、DSM 3885、ATCC 90448、SD 170和ARSEF 7711)和ICIPE 69)，黄绿绿僵菌菌株，诸如ATCC 32969)、甲基杆菌属(例如，粘甲基杆菌、气生甲基杆菌、嗜胺甲基杆菌、水生甲基杆菌、分枝甲基杆菌、青藓甲基杆菌、气泡甲基杆菌、色瑞斯提甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、丹口肯斯甲基杆菌、二氯甲烷甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽甲基杆菌、鼠曲草甲基杆菌、格辛甲基杆菌、棉生甲基杆菌、动物群甲基杆菌、小羽藓甲基杆菌、西班牙甲基杆菌、懒惰甲基杆菌、伊斯比利亚甲基杆菌、咸海鲜甲基杆菌、驹形氏甲基杆菌、长甲基杆菌、葡萄牙甲基杆菌、地钱甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、嗜有机甲基杆菌、稻甲基杆菌、酢浆草甲基杆菌、桃红甲基杆菌、叶际甲基杆菌、悬铃木甲基杆菌、根际甲基杆菌、极甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗氏甲基杆菌、浅红甲基杆菌、海水甲基杆菌、索里甲基杆菌、芬兰甲基杆菌、慢生甲基杆菌、塔尔汗甲基杆菌、硫氰酸盐甲基杆菌、苏云金甲基杆菌、三叶草甲基杆菌、易变甲基杆菌、扎氏甲基杆菌)、梅奇酵母属(例如，果生梅奇酵母)、微杆菌属(例如，产左聚糖微杆菌)、微结节菌属(例如，单隔微结节菌)、小球壳孢属(例如，赭小球壳孢P130A)、微枝形杆菌属(例如，气生微枝形杆菌、嗜气微枝形杆菌、絮状微枝形杆菌、广西微枝形杆菌、罗顿豆微枝形杆菌、羽扇豆微枝形杆菌、地下微枝形杆菌、豇豆微枝形杆菌、赞比亚微枝形杆菌)、单顶孢属(例如，柱捕单顶孢)、毛霉属、产气霉属(例如，白色产气霉，诸如NRRL 30547、QST 20799和SA-13，粉红产气霉菌株，诸如NRRL 30548)、醭酵母属、蝇壶菌属、多腔菌属、漆斑菌属(例如，疣孢漆斑菌)、丛赤壳属、毒虫霉属(例如，吉奥吉尼斯毒虫霉、滑孢毒虫霉)、新接霉属、野村菌属(例如，莱氏野村菌菌株，诸如SA86101、GU87401、SR86151、CG128和VA9101)、念珠藻属(例如，满江红念珠藻、石青念珠藻、肉色念珠藻、粉末念珠藻、普通念珠藻、椭孢念珠藻、发状念珠藻、林氏念珠藻、朗斯塔夫念珠藻、微小念珠藻、灰色念珠藻、沼泽念珠藻、梅型念珠藻、点形念珠藻、球形念珠藻、球状念珠藻、海绵状念珠藻、裂褶念珠藻)、苍白杆菌属(例如，人苍白杆菌、西塞罗苍白杆菌、金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、母鸡粪苍白杆菌、格瑞根嫩斯苍白杆菌、广州苍白杆菌、嗜血苍白杆菌、中间苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆菌、克冠酸钠苍白杆菌、粘液苍白杆菌、假中间体苍白杆菌、假格里朗苍白杆菌、根球虫苍白杆菌、食噻吩苍白杆菌、小麦苍白杆菌)、树粉孢属、拟青霉属(例如，玫烟色拟青霉菌株，诸如FE991和FE 9901，淡紫色拟青霉菌株，诸如251、DSM 15169和BCP2)、类芽孢杆菌属(例如，蜂房类芽孢杆菌菌株，诸如NAS6G6，固氮类芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌菌株，诸如ABP166(保藏为NRRL B-50211))、虫疠霉属、泛菌属(例如，成团泛菌菌株，诸如NRRL B-21856，泛生泛菌菌株，诸如C9-1)、类球囊霉属(例如，巴西类球囊霉)、羽束梗孢属、巴斯德氏芽菌属、巴斯德氏芽菌属(例如，西泽巴斯德氏芽菌菌株，诸如Pnl，穿刺巴斯德氏芽菌，分支巴斯德氏芽菌，巴斯德氏芽菌种菌株，诸如ATCC PTA-9643和ATCC SD-5832，索恩巴斯德氏芽菌，乌沙格巴斯德氏芽菌)、青霉属(例如，发白青霉，橘灰青霉，比莱青霉(以前称为比莱伊青霉和比拉伊青霉)菌株，诸如ATCC18309、ATCC 20851、ATCC 22348、NRRL 50162、NRRL 50169、NRRL 50776、NRRL 50777、NRRL50778、NRRL 50777、NRRL 50778、NRRL 50779、NRRL 50780、NRRL 50781、NRRL 50782、NRRL50783、NRRL 50784、NRRL 50785、NRRL 50786、NRRL 50787、NRRL 50788和RS7B-SD1，短密青霉菌株，诸如AgRFl8，变灰青霉菌株，诸如ATCC 10419，产黄青霉，黄暗青霉，桔青霉，指状青霉，扩展青霉菌株，诸如ATCC 24692和YT02，费拉塔纳姆青霉菌株，诸如ATCC 48694，常现青霉，锈色青霉，富西珀勒斯青霉，加斯特氏青霉菌株，诸如NRRL 50170，光孢青霉菌株，诸如DAOM 239074和CBS 229.28，灰绿青霉，灰黄青霉，纠缠青霉，微紫青霉菌株，诸如ATCC10455，诺索可鲁里木青霉菌株，诸如ATCC 48919，淡紫青霉，朱黄青霉，山地青霉，黑青霉，草酸青霉，松木青霉，嗜松青霉，产紫青霉，甘蓝青霉菌株，诸如ATCC 201836、FRR 4717、FRR4719和N93/47267，雷斯特里克青霉菌菌株，诸如ATCC 10490，皱褶青霉，简青霉，离生青霉，变幻青霉，绒状青霉，纯绿青霉)、鞘氨醇杆菌属、伏革菌属(例如，大伏革菌)、发光杆菌属、叶杆菌属(例如，勃艮第叶杆菌、油菜叶杆菌、墓穴叶杆菌、内生叶杆菌、黄芪叶杆菌、豆科植物叶杆菌、百脉根叶杆菌、紫金牛叶杆菌、槐叶杆菌、三叶草叶杆菌)、毕赤酵母属(例如，异常毕赤酵母菌株，诸如WRL-076)、豆马勃属(例如，彩色豆马勃)、拟浮丝藻属、织线藻属、侧链孢属、普可尼亚菌属(例如，厚垣孢普可尼亚菌)、丛赤壳菌属、多头霉属、原绿球藻属(例如，海洋原绿球藻)、原绿藻属(例如，原绿藻)、原绿发藻属、拟球束梗孢属、假单胞菌属(例如，伞菊假单胞菌，南极假单胞菌，桔黄假单胞菌，致金色假单胞菌，固氮假单胞菌，生氮假单胞菌，巴利阿里假单胞菌，布拉奇福特假单胞菌，油菜假单胞菌，布氏假单胞菌，大麻假单胞菌，松柏假单胞菌，洋葱假单胞菌，绿针假单胞菌菌株，诸如MA 342，结冰假单胞菌，起皱假单胞菌，康氏假单胞菌，脱氮假单胞菌，喜昆虫假单胞菌，荧光假单胞菌菌株，诸如ATCC27663、CL 145A和A506，莓实假单胞菌，褐鞘假单胞菌，黄褐假单胞菌，盖氏假单胞菌，杰氏假单胞菌菌株，诸如PS06，基尔假单胞菌，韩国假单胞菌，黎巴嫩假单胞菌，里里假单胞菌，隆德假单胞菌，藤黄假单胞菌，浅黄假单胞菌，孟氏假单胞菌，边缘假单胞菌，地中海假单胞菌，子午线假单胞菌，米氏假单胞菌，摩拉维亚假单胞菌，霉味假单胞菌，东方假单胞菌，稻皮假单胞菌，帕氏假单胞菌，人参假单胞菌，副黄假单胞菌，烂泥假单胞菌，穿孔假单胞菌，香鱼假单胞菌，硫辛酸假单胞菌，解朊假单胞菌，恶臭假单胞菌，皮西那假单胞菌菌株，诸如ATCC 15958，罗氏假单胞菌，假单胞菌属种菌株，诸如DSM 13134，条纹假单孢菌，施氏假单胞菌，丁香假单胞菌，产黄假单胞菌，腐臭假单胞菌，西斯福瓦伦西斯假单胞菌，托拉假单胞菌，斡氏假单胞菌)、假酵母状菌属(例如，絮绒酵母状菌菌株，诸如PF-A22 UL)、腐霉属(例如，寡雄腐霉菌株，诸如DV 74)、根瘤菌属(例如，集结根瘤菌，奥氏根瘤菌，碱土根瘤菌，蜂房根瘤菌，阿齐根瘤菌，污泥根瘤菌，朱缨花根瘤菌，中国农大根瘤菌，解纤维素根瘤菌，大田根瘤菌，石内根瘤菌，内生根瘤菌，菜豆根瘤菌，蚕豆根瘤菌，黄色，费氏根瘤菌，弗莱雷根瘤菌，山羊豆根瘤菌，高卢根瘤菌，贾氏根瘤菌，葛拉汉米根瘤菌，海南根瘤菌，栖盐生植物中间根瘤菌，耐盐根瘤菌，贺兰山根瘤菌，草本根瘤菌，洪特拉根瘤菌，木蓝根瘤菌，雅瓜里根瘤菌，昆明根瘤菌，拉格雷根瘤菌，拉氏根瘤菌，豆根瘤菌菌株，诸如S012A-2(IDAC080305-01)，浮萍根瘤菌，银合欢根瘤菌，黄土根瘤菌，羽扇豆根瘤菌，葡萄牙根瘤菌，山楂花根瘤菌，中美洲根瘤菌，华中根瘤菌，汨罗江根瘤菌，蒙古根瘤菌，多宿主根瘤菌，食萘根瘤菌，内波特姆根瘤菌，水稻根瘤菌，巴基斯坦根瘤菌，北榄根瘤菌，巴拉那根瘤菌，石油根瘤菌，菜豆根瘤菌，解菲根瘤菌，豌豆根瘤菌，水黄皮根瘤菌，杨根瘤菌，假稻根瘤菌，普沙根瘤菌，祁连山根瘤菌，放射形根瘤菌，发根根瘤菌，水稻根根瘤菌，罗泽第福曼斯根瘤菌，悬钩子根瘤菌，塞尔尼地雷德赛斯根瘤菌，斯凯尔涅维采根瘤菌，鹿药根瘤菌，土壤根瘤菌，槐根瘤菌，槐根根瘤菌，苦马豆根瘤菌，稻杆根瘤菌，萨博拉尼斯根瘤菌，岩黄芪根瘤菌，太白山根瘤菌，塔里木根瘤菌，西藏根瘤菌，三叶草根瘤菌菌株，诸如RP113-7，热带根瘤菌菌株，诸如SEMIA 4080，吐蕃根瘤菌，居水根瘤菌，红河谷根瘤菌，野豌豆根瘤菌菌株，诸如PlNP3Cst、SU303和WSM 1455，绿豆根瘤菌，葡萄根瘤菌，杨凌根瘤菌，盐亭根瘤菌)、丝核菌属、须腹菌属(例如，须淀粉须腹菌、尔维氏须腹菌、浅黄根须腹菌、长毛须腹菌)、红球菌属、糖多孢菌属(例如，刺糖多孢菌)、硬皮马勃属(例如，光硬皮马勃、橙黄硬皮马勃)、隔担耳属、沙雷氏菌属、申氏菌属(例如，鸡眼草申氏菌)、中华根瘤菌属(例如，岩穴中华根瘤菌，粘着中华根瘤菌，美洲中华根瘤菌，木本树中华根瘤菌，恰帕斯中华根瘤菌，费氏中华根瘤菌菌株，诸如CCBAU114和USDA 205，格拉马提卡斯中华根瘤菌，印度中华根瘤菌，柯斯第中华根瘤菌，鸡眼草中华根瘤菌，苜蓿中华根瘤菌，草木樨中华根瘤菌菌株，诸如MSDJ0848，墨西哥中华根瘤菌，努米底亚中华根瘤菌，补骨脂中华根瘤菌，萨赫靳中华根瘤菌，田菁中华根瘤菌，大豆中华根瘤菌，好客中华根瘤菌，新疆中华根瘤菌)、小团孢属、球壳属(例如，真菌寄生球壳菌株，诸如IDAC 301008-01)、灰翅夜蛾属(例如，海灰翅夜蛾)、拟小孢霉属、斯氏线虫属(例如，小卷蛾斯氏线虫、夜蛾斯氏线虫、克劳瑟斯氏线虫菌株，诸如L137)、寡养单胞菌属、链霉菌属(例如，链霉菌属NRRL B-30145，链霉菌属M1064，链霉菌属WYE 53(保藏为ATCC 55750)，可可链霉菌菌株，诸如ATCC 19093，鲜黄链霉菌菌株，诸如NRRL 30232，灰绿链霉菌菌株，诸如K61，利迪链霉菌菌株，诸如WYEC 108(保藏为ATCC 55445)，紫黑链霉菌菌株，诸如YCED-9(保藏为ATCC 55660))、链孢子囊菌属、小束梗孢菌属、斯瓦米纳坦氏菌属、踝节菌属(例如，棘孢踝节菌、黄色踝节菌菌株，诸如Vl l7b)、四臂壳孢属、硫杆菌属、多头束霉属、弯颈霉属、单歧藻属、虫壳菌属、有孢圆酵母属、特雷诺真菌属、木霉属(例如，棘孢木霉菌株，诸如SKT-l，深绿木霉菌株，诸如LC52和CNCM 1-1237，顶孢木霉菌株，诸如JM41R，盖姆斯木霉菌株，诸如ICC 080，钩状木霉菌株，诸如ATCC 52198，哈茨木霉菌株，诸如ATCC52445、KRL-AG2、T-22、TH-35、T-39和ICC012，多孢木霉，里氏木霉菌株，诸如ATCC 28217，子座木霉，绿木霉菌株，诸如ATCC 58678、GL-3、GL-21和G-41，绿色木霉菌株，诸如ATCC52440、ICC080和TV1)、核瑚菌属、细基格孢属(例如，奥德曼细基格孢菌株，诸如HRU3)、拟锈菌属、贪噬菌属、轮枝孢属(例如，厚垣孢轮枝孢，蜡蚧轮枝孢菌株，诸如ATCC 46578)、弧菌属、黄色杆菌属、黄单胞菌属、致病杆菌属、耶尔森氏菌属(例如，嗜虫耶尔森氏菌菌株，诸如082KB8)和虫瘟霉属。
细菌可从以下中获得：任何一般陆地环境，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)和其他生物群，包括沉积物、水以及湖泊和河流的生物群；海洋环境、其生物群和沉积物(例如，海水、海洋泥、海洋植物、海洋无脊椎动物(例如，海绵)、海洋脊椎动物(例如，鱼类))；陆地和海洋地圈(风化层和岩石，例如，地下碎岩石、砂和粘土)；冰冻圈和其融水；大气(例如，过滤的空中灰尘、云和雨滴)；城市、工业和其他人造环境(例如，积聚在混凝土、路边排水沟、屋顶表面和路面上的有机物质和矿物质)。
可通过从植物的表面或组织提取微生物来获得可用于本文所公开的方法和组合物中的微生物。可通过研磨种子以分离出微生物来获得微生物。可通过在不同的土壤样品中播种种子并从组织中回收微生物来获得微生物。另外，可通过给植物接种外源微生物并确定哪些微生物出现在植物组织中来获得微生物。植物组织的非限制性实例可包括种子、幼苗、叶、插条(cutting)、植株、鳞茎(bulb)或块茎。
获得微生物的方法可以是通过从土壤中分离细菌。可从各种土壤类型中收集细菌。在一些实例中，土壤可由诸如高或低的肥力、水分水平、矿物质水平和各种耕种实践的性状来表征。例如，土壤可能与作物轮作有关，在作物轮作情况下，不同的作物在连续的播种季节播种在同一土壤中。不同作物在同一土壤上的相继生长可防止某些矿物质的不成比例耗乏。可从在所选择的土壤中生长的植物中分离出细菌。可在生长2-6周时收获幼苗植株。例如，可在一轮收获中收集至少400个分离物。土壤和植物类型揭示植物表型以及允许某些表型在下游富集的条件。
可从植物组织中分离出微生物以评估微生物性状。用于处理组织样品的参数可变化以分离不同类型的缔合型微生物(associative microbe)，诸如根际细菌、附生菌或内生菌。可在含有作为唯一磷酸盐来源的磷酸钙的培养基中培养所述分离物，以富集能够使磷酸钙增溶的细菌。替代地，可从全球菌株库获得微生物。
执行植物体中的分析以评估微生物的性状。在一些实施方案中，可对植物组织进行处理，以用于通过高通量处理DNA和RNA来进行筛选。另外，非侵入性测量可用于评估植物特征，诸如定殖。可在逐株的基础上获得对野生微生物的测量。还可使用中通量方法在田间获得对野生微生物的测量。可随时间连续进行测量。可使用模式植物系统，包括但不限于狗尾草属(Setaria)。
可经由植物系统中微生物的转录谱分析(profiling)来筛选植物系统中的微生物。通过转录谱分析进行筛选的实例包括使用定量聚合酶链式反应(qPCR)、用于转录物检测的分子条形码、下一代测序和用荧光标记对微生物加标签的方法。
可利用自动化温室来进行植物体中的分析。对微生物暴露作出反应的植物度量包括但不限于生物量、叶绿体分析、CCD相机、体积断层摄影测量。
富集微生物群体的一种方式是根据基因型。例如，可使用具有靶向引物或特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)测定来筛选表达磷酸盐增溶基因的微生物。还可经由单细胞、培养无关的途径和趋化性引导的分离途径来富集微生物群体。替代地，可通过在选择培养基上培养微生物来执行微生物的靶向分离。针对期望性状富集微生物群体的经事先计划的途径可由生物信息学数据来指导并且描述于本文中。
利用生物信息学富集具有磷酸盐增溶能力的微生物
生物信息学工具可用于鉴别和分离植物生长促进微生物(PGPM)，PGPM基于其进行磷酸盐增溶的能力来选择。具有高磷酸盐增溶能力的微生物可促进植物的有利性状。用于鉴别PGPM的生物信息学分析模式包括但不限于基因组学、宏基因组学、靶向分离、基因测序、转录组测序和建模。基因组分析可用于使用如本文所述的下一代测序方法和微生物版本控制方法来鉴别PGPM并确认突变的存在。
宏基因组学可用于使用针对定殖的预测算法来鉴别和分离PGPM。元数据也可用于鉴别环境和温室样品中工程改造的菌株的存在。
转录组测序可用于预测导致PGPM表型的基因型。另外，转录组数据用于鉴别用于改变基因表达的启动子。转录组数据可结合全基因组序列(WGS)加以分析，以生成代谢和基因调控网络模型。
微生物的驯化
可对从自然界分离出来的微生物执行驯化过程，在驯化过程中微生物被转化为遗传上可追踪和可鉴别的形式。驯化微生物的一种方式是用抗生素抗性对它进行工程改造。工程改造抗生素抗性的过程可从确定野生型微生物菌株中的抗生素敏感性开始。如果细菌对抗生素敏感，则该抗生素可能是抗生素抗性工程改造的良好候选物。随后，可使用重组工程方法将抗生素抗性基因或反选择性自杀载体掺入到微生物的基因组中。反选择性自杀载体可由目的基因的缺失、选择性标记和反选择性标记sacB组成。反选择可用于将原生微生物DNA序列与抗生素抗性基因交换。中通量方法可用于同时评价多种微生物，以允许平行驯化。替代的驯化方法包括使用归巢核酸酶来防止自杀载体序列环出或获得间插的载体序列。
可经由几种方法(包括电穿孔和化学转化)将DNA载体引入到细菌中。可以使用标准的载体文库进行转化。基因编辑方法的实例是CRISPR，在此之前进行Cas9测试以确保微生物中Cas9的活性。
微生物的非转基因工程改造
可经由定向演化获得具有有利性状的微生物群体。定向演化是一种模仿自然选择过程以使蛋白质或核酸朝向用户限定的目标演化的途径。定向演化的实例是当将随机突变引入到微生物群体中时，选择具有最有利性状的微生物，所选择的微生物的生长将会继续。植物生长促进微生物(PGPM)中的最有利性状可能是磷酸盐增溶。基于每次迭代之后的选择过程，定向演化的方法可以是迭代的和自适应的。
可产生具有高磷酸盐增溶能力的植物生长促进微生物(PGPM)。可经由引入遗传变异来进行PGPM的演化。可经由聚合酶链式反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变以及它们的组合引入遗传变异。这些途径可在微生物群体中引入随机突变。例如，可经由寡核苷酸定向诱变使用合成DNA或RNA产生突变体。可使用质粒上所含的工具生成突变体，稍后将其固化。可使用来自具有改善的性状的其他物种的文库来鉴别目的基因，所述改善的性状包括但不限于改善的PGPM性质、改善的谷物定殖和增加的磷酸盐增溶。可基于这些文库，使用诸如Geneious或Platypus设计软件的软件设计属内基因修饰。可借助于机器学习来设计突变。可借助于代谢模型来设计突变。突变的自动化设计可使用a la Platypus来完成并且将引导用于Cas定向诱变的RNA。属内基因修饰的实例可以是使用来自生物体内的高表达基因的启动子来控制与生物体中的磷酸盐增溶相关的基因的表达。
可将属内基因修饰转移至宿主微生物中。另外，还可将报告系统转移至微生物。报告系统表征启动子，确定转化成功，筛选突变体并充当阴性筛选工具。
携带突变的微生物可经由连续传代培养。微生物菌落含有该微生物的单一变体。借助自动化菌落挑取器和液体处理器筛选微生物菌落。具有基因重复和增加的拷贝数的突变体表达期望性状的较高基因型。
修饰
在一个方面，本公开提供了一种非属间细菌，其包含一种或多种被引入到一个或多个与磷增溶相关的基因或非编码多核苷酸中的遗传变异，使得所述细菌能够对有机磷和/或无机增溶。
本公开进一步提供了一种通过磷酸盐增溶微生物改善磷酸盐增溶的方法。在一些实施方案中，所述方法包括选择出已知参与磷酸盐增溶的基因，或与已知参与磷酸盐增溶的基因同源的基因。在一些情况下，微生物可通过释放低分子量有机酸来增溶磷酸盐，所述低分子量有机酸螯合结合至磷酸盐的阳离子，由此将它转化为可溶形式。可能与有机磷的增溶相关的基因包括非特异性的酸性磷酸酶(NSAP)，诸如phoC、napA、napD、napE、acpA和appA，以及植酸酶，诸如phy和appA。可能与无机磷的增溶相关的基因包括葡糖酸生物合成基因，诸如pqq生物合成基因(pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE)、gcd和gabY。可能与磷酸盐增溶相关的基因还包括碱性磷酸酶，诸如phoA、phoC和phoD。可能与磷酸盐增溶相关的基因的另一实例是葡萄糖脱氢酶(例如，gcd)。可能与磷增溶负相关的基因包括gntT(葡糖酸转运蛋白)和gad(葡糖酸脱氢酶)。gad基因的实例包括gad1和gad2。葡糖酸转运蛋白基因的实例包括gntT和gntU。可通过对编码序列进行密码子随机化以去除调控序列，并且将密码子随机化的编码序列重新引入在质粒中来增加参与磷酸盐增溶的基因的表达水平。所述质粒还可包含启动子、RBS、复制起点、选择性标记，以及控制编码序列的表达水平或质粒的拷贝数的其他元件。所述质粒可以是高拷贝数质粒、中拷贝数质粒或低拷贝数质粒。
可将引入到微生物中的遗传变异分类为转基因、同源转基因(cisgenic)、基因组内、属内、属间、合成、演化、重排或SNP。
可将遗传变异引入到微生物内的众多代谢通路中，以诱发磷酸盐增溶的改善。代表性通路包括磷酸盐增溶、有机酸转运和有机酸产生。
CRISPR/Cas9(成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats))/CRISPR相关(Cas)系统可用于引入期望的突变。CRISPR/Cas9通过使用CRISPR RNA(crRNA)引导侵袭核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。Cas9蛋白质(或其功能等同物和/或变体，即Cas9样蛋白质)天然含有DNA内切核酸酶活性，该活性取决于该蛋白质与两种天然存在或合成的RNA分子(称为crRNA和tracrRNA(也称为引导RNA))的缔合。在一些情况下，这两种分子共价连接从而形成单一分子(也称为单引导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白质与DNA靶向RNA(该术语涵盖两分子引导RNA构型和单分子引导RNA构型)缔合，所述DNA靶向RNA活化Cas9或Cas9样蛋白质并将该蛋白质引导至靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白质保留它的天然的酶促功能，它将切割靶DNA从而产生双链断裂，这可导致基因组改变(即编辑、缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、替代等)，由此改变基因表达。Cas9的一些变体(所述变体被术语Cas9样涵盖)已被改变，使得它们具有降低的DNA切割活性(在一些情况下，它们切割靶DNA的单条链而不是两条链，而在其他情况下，它们已被严重地降低至没有DNA切割活性)。
本公开的微生物可通过一种或多种已被引入到微生物中的遗传修饰或改变来鉴别。可鉴别遗传修饰或改变的一种方法是经由参考含有足以鉴别遗传修饰或改变的微生物基因组序列的一部分的SEQ ID NO。
在某些方面，本公开提供了序列，其与选自由SEQ ID NO:1-93组成的组的任何序列共有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在某些方面，本公开提供了序列，其与选自由SEQ ID NO:3、4、15-21、29-48和52-54组成的组的任何序列共有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在某些方面，本公开提供了微生物，其包含与选自由SEQ ID NO:1-71组成的组的任何序列共有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。
在某些方面，本公开提供了微生物，其包含与选自由SEQ ID NO:3、4、15-21、29-48和52-54组成的组的任何序列共有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列。
在一些方面，本公开提供了微生物，其包含与选自由SEQ ID NO:72-93组成的组的任何序列共有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
连续传代
可通过连续传代来实现用于改善植物性状(例如，磷酸盐增溶)的细菌的产生。这些细菌的产生可通过选择出具有受微生物区系影响的特定改善性状的植物，外加鉴别能够将一种或多种改善性状赋予给一种或多种植物的细菌和/或组合物来完成。一种产生细菌以改善植物性状的方法包括以下步骤：(a)从第一植物的组织或土壤中分离出细菌；(b)将遗传变异引入到一种或多种所述细菌中以产生一种或多种变体细菌；(c)将多个植物暴露于所述变体细菌中；(d)从所述多个植物中的一个的组织或土壤中分离出细菌，其中从其中分离出细菌的植物相对于所述多个植物中的其他植物具有改善的性状；以及(e)利用从所述具有改善的性状的植物中分离出来的细菌(步骤(d))重复步骤(b)至(d)。步骤(b)至(d)可重复任何次数(例如，一次、两次、三次、四次、五次、十次或更多次)，直至植物中的改善性状达到期望水平。进一步地，多种植物可以是超过两种的植物，诸如10至20种植物，或20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、300种或更多种、500种或更多种、或1000种或更多种植物。
除了获得具有改善的性状的植物之外，还获得细菌群体，所述细菌群体包含含有一种或多种被引入到一种或多种基因(例如，调控磷酸盐增溶的基因)中的遗传变异的细菌。通过重复上述步骤，可获得细菌群体，其包含与目的植物性状相关的群体中最适当的成员。可诸如通过遗传和/或表型分析来鉴别该群体中的细菌并确定它们的有益性质。可对步骤(a)中分离的细菌进行遗传分析。可使用包括以下的技术获得表型和/或基因型信息：植物来源的化学组分的高通量筛选、测序技术(包括遗传材料的高通量测序)、差异显示技术(包括DDRT-PCR和DD-PCR)、核酸微阵列技术、RNA测序(全转录组鸟枪法测序)和qRT-PCR(定量实时PCR)。所获取的信息可用于获得关于所存在的细菌的身份和活性的群落谱分析信息，诸如编码rRNA操纵子或其他分类学信息基因座的组分的核酸的系统发育分析或基于微阵列的筛选。分类学信息基因座的实例包括16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、12S rRNA基因、18S rRNA基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、coxl基因和nifD基因。用于确定存在于群体中的分类群的示例性分类谱分析过程描述于美国专利申请公布第2014/0155283号中。细菌鉴别可包括表征一种或多种基因或一种或多种信号传导通路(诸如与磷酸盐增溶相关的基因)的活性。不同细菌物种之间的协同相互作用(其中两种组分借助于它们的组合将期望作用增加至超过加和量)也可存在于细菌群体中。
经引导微生物重塑——概述
经引导微生物重塑是用于系统性地鉴别和改善作物微生物组内物种的作用的方法。在一些方面并且根据特定的分组/分类方法学，所述方法包括三个步骤：1)通过对植物-微生物相互作用作图并预测与特定表型相关的调控网络来选择候选物种，2)通过微生物基因组内调控网络和基因簇的物种内杂交来实用且可预测地改善微生物表型，以及3)筛选和选择出产生期望作物表型的新的微生物基因型。
为了系统地评估菌株的改善，创建了将微生物群落的定殖动力学与关键物种的遗传活性联系起来的模型。该模型用于预测用于非属间遗传重塑(即，以非转基因方式工程改造微生物的遗传架构)的遗传靶标。作物微生物组的合理改善可用于增加土壤生物多样性、调整关键物种的影响和/或改变重要代谢通路的定时和表达。
可对目的物种的代谢进行作图并将其与遗传学联系起来。例如，可表征与磷酸盐增溶相关的基因。可在一系列环境条件下检查被表征的通路。例如，可检查微生物在其环境中存在不同水平和类型的可溶和不溶性磷酸盐时固定增溶磷酸盐的能力。上文列出了与磷酸盐增溶相关的基因的实例。
随后，可使用包括但不限于接合和重组、化学诱变、适应性演化和基因编辑的方法将靶向的非属间基因组改变引入到微生物基因组中。靶向的非属间基因组改变可包括基因组的插入、破坏、缺失、改变、扰动、修饰等。
然后将衍生的重塑微生物(其包含由重塑的潜在基因型产生的期望表型)用于接种作物。
在某些实施方案中，本公开提供了能够增溶磷酸盐的非属间重塑微生物。在一些方面，这些非属间的重塑微生物能够以比未重塑的微生物更大的水平增溶磷酸盐。在一些实施方案中，本公开找到具有期望定殖特征的微生物物种，然后在随后的重塑过程中利用这些物种。
在一些实施方案中，GMR平台包括以下步骤：
A.分离-从目的作物植物的土壤、根际、表面等中获得微生物。
B.表征-涉及表征分离的微生物的目的基因型/表型(例如，基因组序列、定殖能力、磷酸盐增溶能力等)。
C.驯化–开发用于微生物的非属间遗传修饰的分子方案。
D.非属间工程改造活动(Campaign)和优化–产生在关键通路(例如，磷酸盐增溶基因)中具有遗传修饰的衍生的非属间微生物菌株。
E.分析-在体外(例如，磷酸盐增溶)以及植物体中(例如，定殖测定)评价衍生的非属间菌株的目的表型。
F.迭代工程改造活动/分析–迭代步骤D和E以进一步改善微生物菌株。
微生物的分离
可从土壤和/或植物的根中分离出微生物。在一个实例中，可使植物在实验室或温室中在小盆中生长。可从各个农业地区获得土壤样品。例如，可收集具有不同质地特征的土壤，包括壤土(例如，泥炭质壤土或砂质壤土)、粘质土壤(例如，重质粘土或粉质粘土)、砂质土壤、粉质土壤、泥炭质土壤、白垩质土壤等。
可将诱饵植物(bait plant)(目的植物，例如玉米、小麦、水稻、高粱、粟、大豆、蔬菜、水果等)的种子播种至每种土壤类型中。在一个实例中，可在各种土壤类型中播种不同品种的诱饵植物。例如，如果目的植物是玉米，则可在如上文所述的各种土壤类型中播种不同品种的玉米(诸如非甜质玉米(field corn)、甜玉米、传统玉米(heritage corn)等)的种子。
植物可在生长数周(例如，2-4周)后通过将它们连根拔起来收获。作为使植物在实验室/温室中生长的替代，可直接从具有不同土壤类型的田间收集目的植物的土壤和/或根。
为了分离根际微生物和附生菌，可通过用蒸馏水浸透土壤或用手轻轻松驰土壤以免损伤根来轻轻移出植物。如果存在较大的土壤粒子，则可通过将根浸入一池平静的蒸馏水中和/或通过轻轻振荡根来去除这些粒子。可切割根，并且可通过将根置于具有少量蒸馏水的板或管中并在振荡器上轻轻振荡该板/管或者以低速度离心该管来制备粘附于根的土壤的浆液。可如下所述的那样处理该浆液。
为了分离内生菌，可用去离子水去除根表面上的多余土壤。在去除土壤后，可对植物进行表面灭菌，并在无菌水中剧烈冲洗。可从植物上切下清洁的1cm根段，并将其置于含有3mm钢珠的磷酸盐缓冲盐水溶液中。可通过用Qiagen TissueLyser II剧烈振荡所述溶液来产生浆液。
可以各种方式处理土壤和/或根的浆液，这取决于待分离微生物的期望的植物有益性状。例如，可将土壤和根的浆液稀释并接种至各种类型的筛选培养基上，以分离根际微生物、内生微生物、附生微生物和其他植物相关的微生物。例如，如果期望的植物有益性状是磷酸盐增溶，则可将土壤/根浆液平铺在含有磷酸钙作为唯一磷源的培养基上。磷酸盐增溶细菌(PSB)可对磷酸钙增溶并使磷酸盐同化并释放出来。该反应表现为板上的晕轮区或清晰区，并且可用作用于分离PSB的初始步骤。
可将在前一步骤中获得的微生物群体划线以获得单个菌落(纯培养物)。可将一部分纯培养物再悬浮于适合的培养基(例如，R2A和甘油的混合物)中，并进行PCR分析以筛选一种或多种目的基因的存在。例如，为了鉴别可能能够增溶磷酸盐的细菌，可对分离的微生物的经纯化培养物进行PCR分析以检测与磷酸盐增溶相关的基因的存在。分离的菌株的经纯化培养物可例如在-80℃下储存，用于将来的参考和分析。
分离的微生物的表征
可分析分离的微生物以用于系统发育表征(属和种的分配)，并且可对微生物的整个基因组进行测序。对于系统发育表征，可使用简并16S rDNA引物对分离的微生物的16SrDNA进行测序以产生系统发育特性(identity)。可将16S rDNA序列读段(read)作图至数据库，以初始分配所分离微生物的属、种和菌株名称。全基因组测序可用作最终步骤以将系统发育属/种分配给微生物。
可对分离的微生物的全基因组进行测序以鉴别关键通路。对于全基因组测序来说，可使用基因组DNA分离试剂盒(例如，来自QIAGEN的QIAmp DNA微型试剂盒)来分离基因组DNA，并且可使用本领域已知的方法来制备总DNA文库。可使用本领域已知的高通量测序(也称为下一代测序)方法来对全基因组测序。例如，Illumina公司、Roche和PacificBiosciences提供了可用于制备总DNA文库和执行全基因组测序的全基因组测序工具。
可组装每个分离的菌株的全基因组序列；可对目的基因进行鉴别；加以注释；并且将其标注为用于重塑的潜在靶标。可将全基因组序列存储在数据库中。
可表征分离的微生物在温室中对宿主植物的定殖。为此，可将分离的微生物的培养物单独或组合地接种到期望宿主植物(例如，玉米、小麦、水稻、高粱和大豆)的种子中，并将该种子播种至土壤中。替代地，可通过将土壤直接接种于根上而将分离的微生物的培养物单独或组合地施加至宿主植物的根上。可例如使用下面更详细描述的定量PCR(qPCR)方法来测定所述微生物的定殖潜力。
可在小规模的田间试验中评估分离的微生物对期望的宿主植物的定殖。另外，可从定殖的根样品中分离出RNA以获得田间环境中菌株的转录组数据。这些小规模的田间试验在本文中被称为CAT(定殖和转录)试验，因为这些试验提供了田间环境中菌株的定殖和转录数据。
对于这些试验，可将分离的微生物的培养物单独或组合地接种在宿主植物(例如，玉米、小麦、水稻、高粱和大豆)的种子中，并将该种子播种至土壤中。替代地，可通过将土壤直接接种于根上而将分离的微生物的培养物单独或组合地施加至宿主植物的根上。可在各种土壤中以及/或者在各种温度以及/或者湿度条件下进行CAT试验，以在各种土壤类型和环境条件下评估微生物的定殖潜力并获得微生物的转录组谱。
可例如使用qPCR方法来评估一种或多种接种的微生物对宿主植物的根的定殖。
在一种方案中，可如下评估分离的微生物的定殖潜力。在播种玉米种子后一天，可将1ml微生物过夜培养物(SOB培养基)刚好浸入在种子所处位置处。1mL的这种过夜培养物可能含有大约10^9cfu，在彼此的3倍内变化，这取决于所用的菌株。每株幼苗可每周用50mL补充有2.5mM或0.25mM硝酸铵的改良霍格兰氏溶液(modified Hoagland’s solution)施肥3x。在播种后四周，可收集根样品用于DNA提取。可使用加压水喷雾冲掉土壤碎屑。然后可使用QIAGEN Tissuelyzer对这些组织样品进行均质化，并根据推荐方案使用QIAmp DNA微型试剂盒(QIAGEN)提取DNA。可例如使用Stratagene Mx3005P RT-PCR，使用被设计(例如，使用NCBI的Primer BLAST)为对每个微生物基因组中的基因座特异的引物对DNA提取物进行qPCR测定。
可对每个微生物基因组的拷贝数进行定量，这可反映出微生物的定殖潜力。可通过对PCR扩增产物进行测序来确认微生物物种的身份。
另外，可从定殖的根和/或土壤样品中分离出RNA并测序。与DNA谱不同，RNA谱根据环境条件而变化。因此，从定殖的根和/或土壤中分离出来的RNA的测序可反映出植物体中的基因在根际中的转录活性。可在不同的时间点从定殖的根和/或土壤样品中分离出RNA，以分析在这些时间点定殖的微生物的RNA谱的变化。例如，可在正好在田间施肥之后以及在田间施肥之后数周，从定殖的根和/或土壤样品中分离出RNA，并对其进行测序以产生对应的转录谱。类似地，可在高磷酸盐条件和低磷酸盐条件下进行RNA测序，以了解哪些基因在这些条件下具有转录活性或被阻遏。
用于转录组/RNA测序的方法是本领域已知的。简单地说，可从分离的微生物的经纯化培养物中分离出总RNA；可使用逆转录酶来制备cDNA；并且可使用上述高通量测序工具对所述cDNA进行测序。可将来自转录组分析的测序读段作图至基因组序列，并且可鉴别用于目的基因的转录启动子。
可评估分离的微生物的植物有益活性。例如，可针对磷酸盐增溶测定磷酸盐增溶微生物。在一些情况下，可通过在缺乏可溶性磷酸盐的培养基中培养微生物时测量培养基的pH来测定磷酸盐增溶微生物。pH值的下降可指示磷酸盐增溶酸的分泌。可利用任何目的参数，并为此开发适当的测定。例如，测定可包括针对定殖度量的生长曲线。该步骤可确认目的表型并消除任何假阳性。
在上述步骤中产生的数据可用于选择用于进一步开发的微生物。例如，可选择表现出定殖潜力、磷酸盐增溶和/或相关的DNA和RNA谱的期望组合的微生物用于驯化和重塑。
所选择的微生物可被驯化；其中，可将所述微生物转化为遗传上可追踪(tractable)且可鉴别的形式。驯化微生物的一种方式是用抗生素抗性对它们进行工程改造。为此，可测试野生型微生物菌株对各种抗生素的敏感性。如果菌株对抗生素敏感，则该抗生素可能是用于在用于重塑该菌株的遗传工具/载体中使用的良好候选物。
可构建对它们的复制有条件的载体(例如，自杀质粒)以驯化所选择的微生物(宿主微生物)。例如，可构建自杀质粒，其含有适当的抗生素抗性标记、反选择性标记、用于在供体微生物(例如，大肠杆菌)中维持的复制起点、用于对通过荧光的插入进行筛选的编码荧光蛋白质(GFP、RFP、YFP、CFP等)的基因、用于接合至宿主微生物中的转移起点，以及包含具有期望遗传变异的宿主基因组同源臂的多核苷酸序列。载体可包含SceI位点和其他附加元件。
示例性的抗生素抗性标记包括氨苄西林(ampicillin)抗性标记、卡那霉素(kanamycin)抗性标记、四环素抗性标记、氯霉素抗性标记、红霉素抗性标记、链霉素抗性标记、壮观霉素抗性标记等。示例性的反选择性标记包括sacB、rpsL、tetAR、pheS、thyA、lacY、gata-1、ccdB等。
在一种方案中，可将自杀质粒转化至大肠杆菌ST18(氨基酮戊酸(ALA)营养缺陷型)中以产生供体微生物，所述自杀质粒含有适当的抗生素抗性标记、反选择性标记、用于在大肠杆菌ST18中维持的λpir复制起点(其含有pir复制起始子基因)、用于对通过荧光的插入进行筛选的编码绿色荧光蛋白质(GFP)的基因、用于接合至宿主微生物中的转移起点，以及包含具有期望遗传变异的宿主基因组同源臂的多核苷酸序列(例如，来自微生物自身基因组内的用于插入到例如邻近磷酸盐增溶基因的异源位置中的启动子)。
可将供体微生物与宿主微生物(来自步骤B5的所选择的候选微生物)混合，以允许所述质粒接合地整合至宿主基因组中。可将供体和宿主微生物的混合物平铺在含有抗生素而不含ALA的培养基上。自杀质粒能够在供体微生物(大肠杆菌ST18)中复制，但不能在宿主中复制。因此，当将含有供体和宿主微生物的混合物平铺在含有抗生素而不含ALA的培养基上时，可选择使质粒整合至其基因组中的宿主细胞。
含有荧光蛋白质标记、抗生素抗性标记、反选择性标记等的自杀质粒在宿主微生物的预期基因座处的适当整合可通过板上的菌落荧光并使用菌落PCR来确认。
宿主微生物中的第二轮同源重组可环出(去除)质粒骨架，留下整合至特定百分比的宿主微生物的宿主基因组中的期望遗传变异(例如，来自微生物自身基因组内的用于插入到异源位置中的启动子)，同时使特定百分比的宿主微生物恢复至野生型。
已环出质粒骨架(并因此环出反选择性标记)的宿主微生物菌落可通过使它们在适当的培养基上生长来回收。
例如，如果使用sacB作为反选择性标记，则可通过使菌落在含有蔗糖的培养基上生长来测试由于丢失质粒骨架而导致的该标记的丢失(sacB赋予对蔗糖的敏感性)。在该培养基上生长的菌落将失去sacB标记和质粒骨架，并且将含有期望的遗传变异或者被恢复至野生型。可挑取在含蔗糖的培养基(或其他适当的培养基，这取决于所用的反选择性标记)上生长得更好的菌落，并可通过使用菌落PCR筛选菌落来确认遗传变异在预期基因座处的存在。
在一些分离物中，sacB或其他反选择性标记可能不赋予对蔗糖或其他反选择机制的完全敏感性，这使得需要筛选大量的菌落以分离出成功的环出物。在那些情况下，可通过使用“辅助质粒”来辅助环出，所述“辅助质粒”在宿主细胞中独立复制并表达识别整合的自杀质粒骨架中的位点的限制性内切核酸酶，例如SceI。可用辅助质粒转化具有整合的自杀质粒的菌株，所述辅助质粒含有抗生素抗性标记、与宿主菌株相容的复制起点，以及编码由组成型或诱导型启动子控制的限制性内切核酸酶的基因。由限制性内切核酸酶在整合的质粒骨架中诱导的双链断裂可促进同源重组以环出自杀质粒。这可以增加反选择板上环出的菌落的数量，并减少需要筛选以发现含有期望突变的菌落的数量。可在不存在对质粒的抗生素选择的情况下，通过培养和连续传代从该菌株中去除辅助质粒。可将传代的培养物针对单菌落划线，挑取菌落并筛选它们对用于选择辅助质粒的抗生素的敏感性，并通过菌落PCR确认所述质粒的不存在。最后，可对基因组进行测序，并且可确认辅助质粒DNA的不存在。
尽管该实施例描述了一种用于驯化微生物并将遗传变异引入到微生物中的方案，但本领域普通技术人员将理解，所述遗传变异可使用本领域已知的各种其他技术引入到所选择的微生物中，所述其他技术诸如：聚合酶链式反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、ZFN、TALENS、CRISPR系统(Cas9、Cpf1等)、化学诱变以及它们的组合。
非属间工程改造活动和优化
可对所选择的微生物进行工程改造/重塑以改善植物有益活性的表现。为此，可鉴别用于改善植物有益活性的基因靶标。
可以各种方式鉴别基因靶标。例如，可在注释来自分离的微生物的全基因组测序的基因的同时鉴别目的基因。
用于改善植物有益活性的期望遗传变异可包括启动子交换，其中用来自微生物基因组内的更强或更弱的启动子(当与原生启动子比较时)或不同地调控的启动子替代用于靶基因的原生启动子。如果靶基因的表达增加了植物有益活性(例如，phoC，其表达可增强磷酸盐增溶微生物)，则用于启动子交换的期望启动子是更强的启动子(与靶基因的原生启动子相比)，其与原生启动子相比将进一步增加靶基因的表达水平。如果靶基因的表达可降低植物有益活性(例如，可降低磷酸盐增溶的葡糖酸脱氢酶)，则用于启动子交换的期望启动子是弱启动子(与靶基因的原生启动子相比)，其与原生启动子相比将显著降低靶基因的表达水平。可将启动子插入到基因中以“敲除”基因的表达，同时上调下游基因的表达，或“敲除”操纵子中的第一编码序列并增加操纵子中的第二编码序列的表达。
可基于RNA测序数据选择用于启动子交换的启动子。例如，RNA测序数据可用于鉴别强启动子和弱启动子，或组成型活性启动子与诱导型启动子。
例如，为了鉴别用于与磷酸盐增溶相关基因一起使用的强启动子和弱启动子，或组成型活性启动子与诱导型启动子，可在磷酸盐耗乏和磷酸盐充足条件下体外培养所选择的微生物，可从这些培养物中分离出微生物的RNA，并对该RNA进行测序。
在示例方案中，可比较微生物在磷酸盐耗乏和磷酸盐充足条件下的RNA谱，并且可鉴别具有期望转录水平的活性启动子。
还可使用RNA测序数据来选择启动子，所述RNA测序数据反映出植物体中的微生物在宿主植物根际中的RNA谱。各种条件下的RNA测序允许选择：a)在施肥的田间条件下在宿主植物生长周期期间在根际中具有活性的启动子，和b)在相关的体外条件下也具有活性的启动子，因此它们可被快速筛选。
在示例性方案中，来自定殖测定的植物体中的RNA测序数据可用于测量分离的微生物中基因的表达水平。在一个实施方案中，基因表达水平可计算为每百万个作图读段中每千个碱基(RPKM)的读段数。可将各种基因的表达水平与靶基因的表达水平进行比较，并且选择与显示出与靶基因相比最高或最低的表达水平的各种基因相关的至少前10、20、30、40、50、60或70个启动子作为用于启动子交换的可能候选物。
例如，如果靶基因是phoC的上调，则选择显示出与phoC相比最高的表达水平的基因的前10、20、30、40、50或60个启动子作为用于启动子交换的可能候选物。
可基于体外RNA测序数据进一步缩列这些候选物。例如，对于作为靶基因的phoC，通过选择在体外磷酸盐耗乏与磷酸盐充足条件下与phoA相比具有相似或增加的基因表达水平的启动子，进一步选择基于植物体中的RNA测序数据选择的可能的启动子候选物。
在该步骤中选择的启动子集用于交换靶基因(例如，phoA)的原生启动子。在体外测定中测试具有经交换的启动子的重塑菌株，消除具有低于预期活性的菌株，并且在田间测试具有预期或高于预期活性的菌株。可在重塑菌株上重复启动子选择的循环，以进一步改善它们的植物有益活性。
基于先前鉴别基因靶和鉴别用于启动子交换的启动子的步骤，可设计非属间遗传变异。
术语“非属间”指示待引入到宿主中的遗传变异不含有来自宿主属外部的核酸序列(即，没有转基因DNA)。尽管载体和/或其他遗传工具可用于将遗传变异引入到宿主微生物中，但本公开的方法包括将引入到宿主微生物中的骨架载体序列或其他遗传工具环出(去除)而仅将期望的遗传变异留入宿主基因组中的步骤。因此，所得微生物是非转基因的。
示例性的非属间遗传变异包括目的基因的突变，其可改善由该基因编码的蛋白质的功能；组成活性启动子，其可替代目的基因的内源启动子以增加基因的表达；可使目的基因失活的突变；将来自宿主基因组内的启动子插入异源位置中，例如将启动子插入导致基因失活和下游基因上调的基因中；等等。突变可以是点突变、插入和/或缺失(基因的全部或部分缺失)。例如，在一种方案中，为了改善宿主微生物的磷酸盐增溶活性，期望的遗传变异可包括对磷酸盐增溶产生负面影响的基因的失活突变，以及用更高表达的启动子替代对磷酸盐增溶产生正面影响的基因的内源启动子。
在设计非属间遗传变异之后，可如上文所述的那样产生重塑菌株。
可将重塑微生物的经纯化培养物保存在库中，使得可提取gDNA用于全基因组测序。
可提取重塑微生物的基因组DNA并使用前述方法对基因组DNA进行全基因组测序。可将所得读段作图至先前存储在实验室信息管理系统(LIMS)中的读段，以确认：a)期望的遗传变异的存在和b)作图至用于产生重塑微生物的载体序列(例如，质粒骨架或辅助质粒序列)的读段的完全不存在。
该步骤可允许灵敏地检测可在环出载体骨架(例如，自杀质粒)方法后保留在菌株中的非宿主属DNA(转基因DNA)，并且可提供对遗传变异的意外脱靶插入的控制等。
对重塑微生物的分析
可在体外评估重塑微生物的植物有益活性和生长动力学。
例如，可通过体外测定和定殖测定来评估为改善磷酸盐增溶功能而重塑的菌株的磷酸盐增溶活性和适合性。
该步骤允许快速、中至高通量筛选重塑菌株的目的表型。
可使用前述步骤评估重塑菌株在温室中或在田间中对宿主植物的定殖。另外，可从定殖的根和/或土壤样品中分离出RNA并对其进行测序以分析靶基因的转录活性。靶基因包括含有所引入的遗传变异的基因，并且还可包括在微生物的磷酸盐增溶活性中起作用的其他基因。
该步骤允许确定根际中最佳体外表现菌株的适合性，并允许测量植物体中的改变的基因的转录活性。
迭代工程改造活动/分析
来自体外和植物体中的分析的数据可用于迭代地堆叠有益突变。
此外，可重复上述步骤以微调微生物的磷酸盐增溶活性。例如，可使用在第一轮中重塑的微生物菌株对植物进行接种；在生长数周后收获；并且可分离来自植物的土壤和/或根的微生物。可表征分离的微生物的功能活性(磷酸盐增溶活性和定殖潜力)以及DNA谱和RNA谱，以便选择具有改善的磷酸盐增溶活性和定殖潜力的微生物。所选择的微生物可被重塑以进一步改善磷酸盐增溶活性。可针对功能活性(例如，磷酸盐增溶活性和定殖潜力)筛选重塑的微生物，并且可选择表现最佳的菌株。如果期望，可重复整个过程或该过程的部分，以进一步改善来自第二轮的重塑微生物的植物有益活性。该过程或该过程的部分可重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多轮。
组合物
包含根据本文所述方法产生以及/或者具有如本文所述的特征的微生物或微生物群体的组合物可呈液体、泡沫或干燥产品的形式。在一些实例中，包含微生物群体的组合物可呈干粉、粉末和水的浆液或可流动种子处理剂的形式。
所述组合物可在生物反应器(诸如连续搅拌槽反应器、间歇反应器)中和农场里制作。在一些实例中，可将所述组合物储存在容器(诸如缸)中，或以小型散装储存。在一些实例中，可将组合物储存在选自由以下组成的组的物体内：瓶、罐、安瓿、包装、器皿、袋、盒、料箱、包膜(envelope)、纸箱、容器、筒仓、运输容器、车厢和/或箱子。
所述组合物还可用于改善植物性状。在一些实例中，可将一种或多种所述组合物包衣至种子上。在一些实例中，可将一种或多种所述组合物包衣至幼苗上。在一些实例中，可将一种或多种所述组合物包衣至种子的表面上。在一些实例中，可将一种或多种所述组合物包衣为种子表面上方的层。在一些实例中，包衣至种子上的组合物可呈液体形式，呈干产品形式，呈泡沫形式，呈粉末和水的浆液形式或呈可流动种子处理剂形式。在一些实例中，可通过以下方式将一种或多种组合物施加至种子和/或幼苗上：用一种或多种组合物对种子和/或幼苗进行喷雾、浸渍、包衣、包封和/或撒粉。在一些实例中，可将多种微生物(例如，细菌)或微生物的(例如，细菌的)群体包衣至植物的种子和/或幼苗上。在一些实例中，细菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌可选自以下属中的一者：食酸菌属、土壤杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、大肠杆菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、糖杆状菌属(Saccharibacillus)、鞘氨醇单胞菌属和寡养单胞菌属。
内生组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌群体选自以下科中的一者：芽孢杆菌科(Bacillaceae)、伯克霍尔德菌科(Burkholderiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillileae)、假单胞菌科(Pseudomonnaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、日规壳科(Gnomoniaceae)、位置未定(Incertae sedis)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)、丛赤壳科(Netriaceae)和格孢腔菌科(Pleosporaceae)。
在一些实例中，内生组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌群体选自以下科中的一者：芽孢杆菌科、伯克霍尔德菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、甲基杆菌科、微杆菌科、类芽孢杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘氨醇单胞菌科、黄单胞菌科、枝孢霉科、日规壳科、位置未定(Incertae sedis)、毛球壳科、丛赤壳科和格孢腔菌科。
组合物的实例可包括用于商业上重要的农业作物的种子包衣，所述农业作物例如高粱、坎诺拉油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉蜀黍和小麦。组合物的实例还可包括用于玉米、大豆、坎诺拉油菜、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷物和油籽的种子包衣。如本文所提供的种子可以是遗传修饰的生物体(GMO)、非GMO、有机或常规的。在一些实例中，可将组合物喷洒在植物地上部分上，或通过如下方式施加至根上：插入至播种有植物种子的犁沟中、向土壤中浇水或将根浸入组合物的悬液中。在一些实例中，可以以维持细胞活力以及人工接种并定殖宿主植物的能力的合适方式使组合物脱水。微生物(例如，细菌)物种可以108至1010CFU/ml之间的浓度存在于组合物中。在一些实例中，组合物可补充有痕量金属离子，诸如钼离子、铁离子、锰离子或这些离子的组合。如本文所述的组合物的实例中的离子浓度可在约0.1mM与约50mM之间。组合物的一些实例还可与诸如以下的载剂一起配制：β-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、细菌细胞外聚合物质(EPS)、糖、动物乳或其他适合的载剂。在一些实例中，泥炭或播种材料可以用作载剂，或者生物聚合物可以用作载剂，其中组合物包覆在所述生物聚合物中。
可将包含本文所述的微生物(例如，细菌)群体的组合物包衣至种子的表面上。因此，还考虑了包含用本文所述的一种或多种细菌包衣的种子的组合物。可通过将细菌群体与多孔的、化学惰性的颗粒载剂混合来形成种子包衣。替代地，可将组合物直接插入到播种了种子的犁沟中，或喷洒至植物叶上，或通过将根浸入组合物的悬浮液中来进行施加。有效量的组合物可用于使邻近植物的根的底土区域充满活的细菌生长或者使植物的叶充满活的细菌生长。一般来说，有效量是足以产生具有改善性状(例如，期望的磷增溶水平)的植物的量。
可使用农业上可接受的载剂来配制本文所述的微生物(例如，细菌)组合物。可用于这些实施方案的制剂可包含至少一个选自由以下组成的组的成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调控剂、肥料、杀啮齿动物剂(rodenticide)、干燥剂、杀细菌剂、营养素或它们的任何组合。在一些实例中，组合物可以是贮存稳定的。例如，本文所述的任何组合物可包含农业上可接受的载剂(例如，肥料(诸如非天然存在的肥料)、粘合剂(诸如非天然存在的粘合剂)和杀虫剂(诸如非天然存在的杀虫剂)中的一种或多种)。非天然存在的粘合剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，本文所述的任何包衣的种子、幼苗或植物可在种子包衣中含有此类农业上可接受的载剂。在本文所述的任何组合物或方法中，农业上可接受的载剂可以是或者可包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘合剂(诸如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的杀虫剂)。下面描述了农业上可接受的载剂的非限制性实例。农业上可接受的载剂的其他实例是本领域已知的。
在一些情况下，将微生物(例如，细菌)与农业上可接受的载剂混合。载剂可以是固体载剂或液体载剂，并且呈各种形式，包括微球、粉末、乳液等。载剂可以是赋予各种性质，诸如增加的稳定性、可润湿性或可分散性的许多载剂中的任一种或多种。组合物中可包含润湿剂，诸如天然或合成的表面活性剂(其可为非离子或离子型表面活性剂或其组合)。油包水乳液也可用于配制包含分离的细菌的组合物(参见例如美国专利第7,485,451号)。可制备的适合的制剂包括可润湿的粉末、颗粒、凝胶、琼脂条或团粒、增稠剂等；微胶囊化的粒子等；液体，诸如水性可流动物(flowables)、水性悬浮液、油包水乳液等。该制剂可包括谷粒或豆荚类产品，例如磨碎的谷粒或豆类，来源于谷粒或豆类的肉汤(broth)或面粉，淀粉，糖或油。
在一些实施方案中，农业载剂可以是土壤或植物生长培养基。可使用的其他农业载剂包括水、肥料、基于植物的油、湿润剂或其组合。替代地，农业载剂可以是固体，诸如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其他植物和动物产品或其组合，包括颗粒、团粒或悬浮液。还考虑了任何前述成分的混合物作为载剂，诸如但不限于派什陶(pesta)(面粉和高岭粘土)，壤土、砂土或粘土中基于琼脂或面粉的团粒等。制剂可包含细菌的食物源，诸如大麦、水稻或其他生物材料，诸如种子、植物部分、甘蔗渣、来自谷粒加工的壳或茎杆、来自建筑场所废弃物的磨碎植物材料或木材、锯末或来自纸、织物或木材回收的小纤维。
例如，肥料可用于帮助促进种子、幼苗或植物生长或者向种子、幼苗或植物提供营养素。肥料的非限制性实例包括氮、有机磷、无机磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯化物、锰、铁、锌、铜、钼和硒(或其盐)。肥料的另外实例包括一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母菌提取物、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸氢钾、木糖、来苏糖和卵磷脂。在一个实施方案中，制剂可包含增粘剂或粘附剂(称为粘合剂)，以帮助将其他活性剂结合至物质(例如，种子的表面)。此类剂可用于将细菌与可含有其他化合物(例如，非生物控制剂的控制剂)的载剂组合以产生包衣组合物。此类组合物可帮助在植物或种子周围产生包衣，以维持微生物和其他剂与植物或植物部分之间的接触。在一个实施方案中，粘合剂选自由以下组成的组：藻酸盐、树胶、淀粉、卵磷脂、芒柄花黄素(formononetin)、聚乙烯醇、碱式芒柄花黄素酸盐(alkaliformononetinate)、橙皮素、聚乙酸乙烯酯、脑磷脂、阿拉伯树胶(gum Arabic)、黄原酸胶、矿物油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖(arabino-galactan)、甲基纤维素、PEG 400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甘油、三乙二醇、乙酸乙烯酯、结冷胶(gellan gum)、聚苯乙烯、聚乙烯、羧甲基纤维素、盖提胶(gum ghatti)和聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。
在一些实施方案中，粘合剂可以是例如蜡，诸如巴西棕榈蜡、蜂蜡、中国蜡、虫胶蜡、鲸蜡、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡和米糠蜡、多糖(例如，淀粉、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐和壳聚糖)、脂肪、油、蛋白质(例如，明胶和玉米醇溶蛋白)、阿拉伯树胶(gumarable)和虫胶。粘合剂可以是非天然存在的化合物，例如聚合物、共聚物和蜡。例如，可用作粘合剂的聚合物的非限制性实例包括：聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙纤维素和羧甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸类共聚物、聚丙烯酸乙烯酯、聚氧化乙烯、酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酸羟乙基酯、甲基丙烯酰胺单体和聚氯丁烯。
在一些实例中，粘合剂、抗真菌剂、生长调控剂和杀虫剂(例如，杀昆虫剂)中的一种或多种是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农业上可接受的载剂的另外实例包括分散剂(例如，聚乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘结剂和填充剂。
制剂还可含有表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括氮-表面活性剂共混物，诸如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm)和Patrol(Helena)；酯化种子油包括Sun-It II(AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)；并且有机硅酮表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic(Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)。在一些实施方案中，表面活性剂以0.01％v/v至10％v/v的浓度存在。在一些其他实施方案中，表面活性剂以0.1％v/v至1％v/v的浓度存在。
在某些情况下，制剂可包含微生物稳定剂。此类剂可包括干燥剂，其可包括可分类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合物，而不管所述一种或多种化合物是否以它们实际上对液体接种剂具有干燥作用的浓度使用。此类干燥剂理想地与所用的细菌群体相容，并且应当促进微生物群体在施加至种子上时存活以及在干燥时存活的能力。适合的干燥剂的实例包括以下中的一种或多种：海藻糖、蔗糖、甘油和亚甲基二醇。其他适合的干燥剂包括但不限于非还原糖和糖醇(例如，甘露醇或山梨醇)。引入到制剂中的干燥剂的量按重量/体积计可在约5％至约50％(例如，约10％至约40％、约15％至约35％，或约20％至约30％)范围内。在一些情况下，制剂含有诸如杀真菌剂、抗细菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调控剂、杀啮齿动物剂、杀细菌剂或营养素的剂是有利的。在一些实例中，剂可包括提供针对种子表面传播的病原体的保护的保护剂。在一些实例中，保护剂可提供对土传病原体的一定程度的控制。在一些实例中，保护剂可主要对种子表面有效。
在一些实例中，杀真菌剂可包括可抑制真菌生长或杀灭真菌的化合物或剂，无论是化学的还是生物的。在一些实例中，杀真菌剂可包括可抑制真菌或杀真菌的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂，或主要对种子表面有效，从而提供针对种子表面传播的病原体的保护并提供对土传病原体的一定程度的控制的剂。保护性杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹(captan)、代森锰(maneb)、福美双(thiram)或咯菌腈(fludioxonil)。
在一些实例中，杀真菌剂可以是系统性杀真菌剂，其可被吸收到新生幼苗中并抑制或杀灭宿主植物组织内部的真菌。用于种子处理的系统杀真菌剂包括但不限于以下：嘧菌酯、萎锈灵(carboxin)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵(metalaxyl)、噻苯咪唑、肟菌酯(trifloxystrobin)和各种三唑杀真菌剂，包括苯醚甲环唑、种菌唑(ipconazole)、戊唑醇(tebuconazole)和灭菌唑(triticonazole)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉真菌腐霉属和疫霉属(Phytophthora)。根据植物物种，一些杀真菌剂优于其他杀真菌剂，这是因为病原真菌物种的敏感性的细微差异，或者因为杀真菌剂分布或植物敏感性的差异。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物控制剂，诸如细菌或真菌。此类生物体可能寄生于病原性真菌，或者分泌毒素或其他可杀灭或以其他方式阻止真菌生长的物质。任何类型的杀真菌剂，特别是通常用于植物上的杀真菌剂，可用作种子组合物中的控制剂。
在一些实例中，种子包衣组合物包含具有抗细菌性质的控制剂。在一个实施方案中，具有抗细菌性质的控制剂选自本文别处所述的化合物。在另一实施方案中，所述化合物是链霉素、土霉素、噁喹酸或庆大霉素(gentamicin)。可用作种子包衣组合物一部分的抗细菌化合物的其他实例包括基于二氯苯和苄醇半缩甲醛(来自ICI的
Figure BDA0002982851130000831
或来自ThorChemie的
Figure BDA0002982851130000832
RS和来自Rohm&Haas的
Figure BDA0002982851130000833
MK25)和异噻唑啉酮衍生物(诸如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的
Figure BDA0002982851130000834
MBS))的那些。
在一些实例中，生长调控剂选自由以下组成的组：脱落酸、先甲草胺(amidochlor)、环丙嘧啶醇(ancymidol)、6-苄氨基嘌呤、油菜素内酯、比达宁(butralin)、矮壮素(chlormequat)(氯化矮壮素(chlormequat chloride))、氯化胆碱、环丙酰草胺(cyclanilide)、丁酰肼(daminozide)、敌草克(dikegulac)、噻节因(dimethipin)、2,6-二甲基嘌啶(2,6-dimethylpuridine)、乙烯利(ethephon)、氟节胺(flumetralin)、呋嘧醇(flurprimidol)、氟噻乙草酯(fluthiacet)、氯吡脲(forchlorfenuron)、赤霉酸、抗倒胺(inabenfide)、吲哚-3-乙酸、马来酰肼、氟磺酰草胺(mefluidide)、助壮素(mepiquat)(氯化助壮素(mepiquat chloride))、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑(paclobutrazol)、调环酸三硫代磷酸酯(prohexadione phosphorotrithioate)、2,3,5-三碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑(uniconazole)。生长调控剂的另外的非限制性实例包括油菜素类固醇、细胞分裂素(cytokinine)(例如，激动素和玉米素)、生长素(例如，吲哚乙酸和吲哚乙酰基天冬氨酸)、类黄酮和异类黄酮(例如，芒柄花黄素和香叶木素(diosmetin))、植物抗毒素(phytoaixin)(例如，大豆抗毒素(glyceolline))和诱导植物抗毒素的寡糖(例如，果胶、几丁质、壳聚糖、聚半乳糖醛酸(polygalacuronic acid)和寡半乳糖醛酸)和吉贝素(gibellerin)。此类剂理想地与施加了制剂的农业种子或幼苗相容(例如，其应当对植物的生长或健康无害)。此外，所述剂理想地是不会引起对人、动物或工业用途的安全担忧的剂(例如，没有安全问题，或所述化合物足够不稳定以至于来自于植物的商品植物产品含有可忽略量的所述化合物)。
线虫拮抗性生物控制剂的一些实例包括ARF18；节丛孢属某些种；毛壳属某些种；柱孢霉属某些种；外瓶霉属某些种；镰刀菌属某些种；粘帚霉属某些种；被毛孢属某些种；蚧霉属某些种；单顶孢属某些种；漆斑菌属某些种；新赤壳属某些种；拟青霉属某些种；普可尼亚菌属某些种；壳多孢属某些种；泡囊-丛枝状菌根真菌、伯克霍尔德菌属某些种；巴斯德氏芽菌属某些种、短芽孢杆菌属某些种；假单胞菌属某些种；和根际细菌。线虫拮抗性生物控制剂可包括ARF18、少孢节丛孢、指状节丛孢、球毛壳菌、异丝藻柱孢霉、甄氏外瓶霉、嗜鱼外瓶霉、镰刀菌属曲霉属、茄镰刀菌、链孢粘帚霉、粉红粘帚霉、绿粘帚霉、洛斯里被毛孢、明尼苏达被毛孢、蜡蚧霉、掘氏单顶孢、哺噬单顶孢、疣孢漆斑菌、侵管新赤壳、淡紫色拟青霉、厚垣孢普可尼亚菌、异皮壳多孢、菜豆壳多孢、泡囊-丛枝状菌根真菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、穿刺巴斯德氏芽菌、索恩巴斯德氏芽菌、西泽巴斯德氏芽菌、分支巴斯德氏芽菌、乌沙格巴斯德氏芽菌、侧孢短芽孢杆菌菌株G4、荧光假单胞菌和根际细菌。
营养素的一些实例可选自由以下组成的组：氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫包衣尿素、尿素-甲醛、IBDU、聚合物包衣尿素、硝酸钙、尿素甲醛(ureaform)和亚甲基尿素，磷肥，诸如磷酸氢二铵、磷酸一铵、多磷酸铵、浓过磷酸钙和三重过磷酸钙，以及钾肥，诸如氯化钾、硫酸钾、硫酸镁钾、硝酸钾。此类组合物可作为游离的盐或离子存在于种子包衣组合物内。替代地，营养素/肥料可被复合或螯合以提供随时间推移的持续释放。
杀啮齿动物剂的一些实例可包括选自由以下组成的组的物质：2-异戊酰基茚满-1,3-二酮、4-(喹喔啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯醇、磷化铝、ANTU、砷氧化物、碳酸钡、双鼠脲(bisthiosemi)、溴鼠隆(brodifacoum)、溴敌隆(bromadiolone)、溴鼠胺(bromethalin)、氰化钙、氯醛糖(chloralose)、氯鼠酮(chlorophacinone)、胆钙化醇(cholecalciferol)、氯杀鼠灵(coumachlor)、克灭鼠(coumafuryl)、杀鼠迷(coumatetralyl)、鼠立死(crimidine)、鼠得克(difenacoum)、噻鼠灵(difethialone)、敌鼠(diphacinone)、麦角钙化醇(ergocalciferol)、氟鼠灵(flocoumafen)、氟乙酰胺、氟鼠啶(flupropadine)、盐酸氟鼠啶(flupropadine hydrochloride)、氰化氢、碘甲烷、林丹(lindane)、磷化镁、溴甲烷、鼠特灵(norbormide)、毒鼠磷(phosacetim)、膦、磷、杀鼠酮(pindone)、亚砷酸钾、灭鼠优(pyrinuron)、红海葱苷(scilliroside)、亚砷酸钠、氰化钠、氟乙酸钠、士的宁(strychnine)、硫酸铊、华法林(warfarin)和磷化锌。
在液体形式(例如，溶液或悬浮液)中，可将细菌群体混合或悬浮在水中或水溶液中。适合的液体稀释剂或载剂包括水、水溶液、石油馏出物或其他液体载剂。
可通过将细菌群体分散于适当划分的固体载剂之中或之上来制备固体组合物，所述固体载剂诸如泥炭、小麦、糠、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土(Fuller’searth)、巴氏灭菌土壤等。当此类制剂用作可润湿粉末时，可使用生物相容的分散剂，诸如非离子型、阴离子型、两性或阳离子型的分散剂和乳化剂。
在配制时使用的固体载剂包括例如矿物载剂，诸如高岭粘土、叶蜡石、膨润土、蒙脱石、硅藻土、酸性白土、蛭石和珍珠岩，以及无机盐，诸如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙。此外，可使用诸如小麦面粉、麦麸、米糠的有机细粉。液体载剂包括植物油(诸如大豆油和棉籽油)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。
微生物(例如，细菌)群体在作物上的施加
本文所述的微生物(例如，细菌)或微生物(例如，细菌)群体的组合物可施加于犁沟中、施加于滑石中或作为种子处理剂施加。可将组合物以散装、以小型散装、于袋中或于滑石中施加于种子包装中。
播种机可根据常规方式、双行或不需要耕作的方式来播种经处理的种子并种植作物。可使用控制漏斗或单个的漏斗分配种子。还可使用加压空气或以手动方式分配种子。可使用可变速率技术进行种子放置。另外，本文所述的细菌或细菌群体的施加可使用可变速率技术(variable rate technologies)来实施。在一些实例中，可将细菌施加至玉米、大豆、坎诺拉油菜、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷物、假谷物和油籽的种子上。谷物的实例可包括大麦、福尼奥(fonio)、燕麦、帕尔默草、黑麦、珍珠粟、高粱、斯佩耳特小麦(spelt)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、黑小麦和小麦。假谷物的实例可包括面包坚果(breadnut)、荞麦、香蒲、鼠尾草(chia)、亚麻、谷粒苋、汉杂(hanza)、藜麦和芝麻。在一些实例中，种子可以是遗传修饰的生物体(GMO)、非GMO、有机的或常规的。
可另外使用诸如微肥、PGR、除草剂、杀昆虫剂和杀真菌剂的添加剂来处理作物。添加剂的实例包括作物保护剂，诸如杀昆虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂，增强剂，诸如着色剂、聚合物、制粒剂、底涂剂(priming)和消毒剂，以及其他剂，诸如接种剂(inoculant)、PGR、软化剂和微量营养素。PGR可以是影响根生长、开花或茎伸长的天然或合成植物激素。PGR可包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯和脱落酸(ABA)。
可将组合物与液体肥料组合施加在犁沟中。在一些实例中，液体肥料可存放在罐中。NPK肥料含有钠、磷、钾的大量营养素。
所述组合物可改善植物性状，诸如促进植物生长、维持叶中的高叶绿素含量、增加果实或种子数量，以及增加果实或种子单位重量。本公开的方法可用于引入或改善各种期望性状中的一种或多种。可引入或改善的性状的实例包括：根生物量、根长、高度、芽长、叶数、水分利用效率、总生物量、产率、果实大小、谷粒大小、光合作用速率、耐旱性、耐热性、耐盐性、对低磷胁迫的耐受性、磷利用效率、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物的水平、代谢物水平的调节和蛋白质组表达。可利用包括高度、总生物量、根和/或枝生物量、种子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数量或质量、植物谷粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长度或它们的任何组合在内的期望的性状来衡量量生长，并且将它们与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改善的性状的植物)的生长速率进行比较。在一些实例中，可利用包括高度、总生物量、根和/或枝生物量、种子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数量或质量、植物谷粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长度或它们的任何组合在内的期望的性状来衡量生长，并且将它们与在类似条件下生长的参考农业植物(例如，没有引入和/或改善的性状的植物)的生长速率进行比较。
宿主植物的农艺性状可包括但不限于以下：与在没有所述种子处理制剂的情况下的由种子生长的等值线植物相比，改变的油含量、改变的蛋白质含量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成、耐化学性、耐寒性、延迟的衰老、抗病性、耐旱性、穗重、生长改善、健康增强、耐热性、除草剂耐受性、草食动物抗性、改善的固氮、改善的氮利用、改善的磷酸盐利用、改善的根系架构、改善的水分利用效率、增加的生物量、增加的根长、增加的种子重量、增加的芽长、增加的产量、在水受限条件下增加的产量、仁粒质量、仁粒含水量、金属耐受性、穗数、每只穗的仁粒数、荚数、营养增强、病原体抗性、害虫抗性、光合能力改善、耐盐性、滞绿、活力改善、增加的成熟种子的干重、增加的成熟种子鲜重、增加的每株植物成熟种子的数目、提高的叶绿素含量、增加的每株植物的荚数、增加的每株植物的荚长、减少的每株植物枯萎叶片的数目、减少的每株植物严重枯萎叶片的数目，和增加的每株植物非枯萎叶片的数目、代谢物水平的可检测调节、转录物水平的可检测调节以及蛋白质组中的可检测调节。
在一些情况下，用从与被接种植物的植物元素相同的植物物种分离出来的细菌或细菌群体接种植物。例如，通常在一个玉蜀黍(Zea mays)(玉米(corn))品种中发现的细菌或细菌群体与在其天然状态下缺乏所述细菌和细菌群体的另一玉米品种的植物的植物元素相关联。在一些实施方案中，细菌和细菌群体来源于作为被接种植物的植物元素的相关植物物种的植物。例如，可将通常在二倍体多年生大刍草(Zea diploperennis)中发现的细菌和细菌群体施加至玉蜀黍中，或反之亦然。在一些情况下，用与被接种植物的植物元素异源的细菌和细菌群体接种植物。在一个实施方案中，细菌和细菌群体来源于另一物种的植物。例如，将通常在双子叶植物中发现的细菌和细菌群体施加至单子叶植物(例如，用大豆来源的细菌和细菌群体接种玉米)，或反之亦然。在其他情况下，待接种至植物上的细菌和细菌群体来源于被接种植物的相关物种。在一个实施方案中，细菌和细菌群体来源于相关的分类单元，例如来源于相关的物种。另一物种的植物可以是农业植物。在另一实施方案中，细菌和细菌群体是接种至任何宿主植物元素中的经设计组合物的一部分。
在一些实例中，细菌或细菌群体是外源性的，其中所述细菌或细菌群体是从与被接种植物不同的植物中分离。例如，在某些实施方案中，细菌或细菌群体可从与被接种植物相同物种的不同植物中分离。在一些情况下，细菌或细菌群体可从与被接种植物相关的物种中分离。
在一些实例中，本文所述的细菌和细菌群体能够从一种组织类型移动至另一种组织类型。例如，本公开在包衣于种子外部之后对植物的成熟组织内的细菌和细菌群体的检测和分离可证实它们从种子外部移动至成熟植物的营养组织中的能力。因此，在各种实施方案中，细菌和细菌群体能够从种子外部移动至植物的营养组织中。在一些实施方案中，包衣至植物种子上的细菌和细菌群体能够在种子萌发成营养状态后定位至植物的不同组织。例如，细菌和细菌群体能够定位至植物中的任一种组织，其包括：根、不定根、种子根、根毛、枝(shoot)、叶、花、芽(bud)、穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水器、花瓣、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在某些实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根和/或根毛。在一些实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于光合组织，例如植物的叶和枝。在其他情况下，细菌和细菌群体定位于植物的维管组织，例如木质部和韧皮部中。在又一实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊或果实)。在某些实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根、枝、叶和生殖组织。在各种实施方案中，细菌和细菌群体定殖于植物的果实或种子组织。在某些实施方案中，细菌和细菌群体能够定殖于植物，使得它们存在于植物的表面上(即，其存在可检测地存在于植物外部或植物的表层(episphere)上)。在一些实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于植物的基本上所有或全部组织。在某些实施方案中，细菌和细菌群体不定位于植物的根。在其他情况下，细菌和细菌群体不定位于植物的光合组织。
还可通过测量作物的相对成熟度或作物加热单元(CHU)来评估组合物的有效性。例如，可将细菌群体施加至玉米，并且可根据玉米仁的相对成熟度或玉米仁达到最大重量的时间来评估玉米生长。作物加热单元(CHU)也可用于预测玉米作物的成熟。CHU通过测量作物生长的每日最高温度来确定热量积累量。
在一些实例中，细菌可定位于植物中的任一种组织，其包括：根、不定根、种子根、根毛、枝、叶、花、芽、穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、排水器、花瓣、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部和木质部。在某些实施方案中，细菌或细菌群体能够定位于光合组织，例如植物的叶和枝。在其他情况下，细菌和细菌群体定位于植物的维管组织，例如木质部和韧皮部中。在另一实施方案中，细菌或细菌群体能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊或果实)。在另一实施方案中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根、枝、叶和生殖组织。在另一实施方案中，细菌或细菌群体定殖于植物的果实或种子组织。在又一实施方案中，细菌或细菌群体能够定殖于植物，使得其存在于植物的表面中。在另一实施方案中，细菌或细菌群体能够定位于植物的基本上所有或全部组织。在某些实施方案中，细菌或细菌群体不定位于植物的根。在其他情况下，细菌和细菌群体不定位于植物的光合组织。
施加至作物的微生物(例如，细菌)组合物的有效性可通过测量作物生长的各种特征来评估，所述特征包括但不限于种植速率、播种活力、根强度、耐旱性、植株高度、干化(dry down)和测试重量。
植物物种
本文所述的方法和细菌适合于多种植物中的任一种，诸如大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)和小麦族(Triticeae)中的植物。适合植物的其他非限制性实例包括苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，植物具有经济、社会和/或环境价值，诸如粮食作物、纤维作物、油料作物、林业或纸浆和造纸工业中的植物、用于生物燃料生产的原料和/或观赏植物。在一些实例中，植物可用于生产具有经济价值的产品，诸如谷粒、面粉、淀粉、糖浆、粗粉、油、膜、包装、营养食物产品、纸浆、动物饲料、鱼饲料、用于工业化学品的散装材料、谷物产品、经加工的人类食品、糖、酒精和/或蛋白质。作物植物的非限制性实例包括玉蜀黍、水稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓和芦笋。
在一些实例中，可使用本文所公开的方法和组合物获得或改善的植物可包括对于农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其他化学品的生物质和/或林业来说重要或引人关注的植物。这些植物的一些实例可包括菠萝、香蕉、椰子、百合、草豌豆(grass pea)、苜蓿、粘果酸浆、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、小扁豆、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝、油菜、苹果树、葡萄、棉花、向日葵、拟南芥、坎诺拉油菜、柑橘属(包括橙子、橘子、金橘、柠檬、酸橙、葡萄柚、红橘(tangerine)、橘柚、香橼和柚子)、胡椒、豆类、生菜(lettuce)、柳枝稷(Panicum virgatum)(风倾草(switch))、高粱(Sorghum bicolor)(高粱(sorghum))、苏丹草(sudan))、奇岗(Miscanthus giganteus)(芒属植物(miscanthus))、甘蔗属(Saccharum)种(能源甘蔗(energycane))、香脂杨(Populus balsamifera)(白杨木(poplar))、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(大豆(soybean))、欧洲油菜(Brassica napus)(坎诺拉油菜(canola))、小麦(Triticum aestivum)(小麦(wheat))、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花(cotton))、稻(Oryza sativa)(水稻(rice))、向日葵丈菊(Helianthus annuus)(向日葵)、紫苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿(alfalfa))、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜(sugarbeet))、珍珠狼尾草(Pennisetum glaucum)(珍珠粟(pearlmillet))、黍属(Panicum)某些种、高粱属某些种、芒属(Miscanthus)某些种、甘蔗属某些种、蔗茅属(Erianthus)某些种、白杨属(Populus)某些种、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属(Salix)某些种(柳树)、桉属(Eucalyptus)某些种(桉树)、小黑麦属(Triticosecale)某些种(小麦属(triticum)-25小麦X黑麦)、竹子、红花(Carthamustinctorius)(红花(safflower))、麻风树(Jatropha curcas)(麻风树属(Jatropha))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻(castor))、油棕(Elaeis guineensis)(油椰(oil palm))、海枣(Phoenix dactylifera)(椰枣(date palm))、肯氏椰子(Archontophoenixcunninghamiana)(帝王假槟榔(king palm))、金山葵(Syagrus romanzoffiana)(皇后葵(queen palm))、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(flax))、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta)(木薯(cassaya))、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄(tomato))、生菜(Lactuca saliva)(生菜(lettuce))、香蕉(Musa paradisiaca)(香蕉(banana))、马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯(potato))、甘蓝(Brassica oleracea)(西蓝花、花椰菜和芽甘蓝菜)、茶(Camellia sinensis)(茶(tea))、草莓(Fragariaananassa)(草莓(strawberry))、可可(Theobroma cacao)(可可(cocoa))、小粒咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、葡萄(Vitis vinifera)(葡萄(grape))、凤梨(Ananas comosus)(菠萝)、辣椒(Capsicum annum)(辣胡椒和甜椒)、洋葱(Alliumcepa)(洋葱(onion))、甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜(melon))、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜(cucumber))、笋瓜(Cucurbita maxima)(笋瓜(squash))、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜(squash))、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(Citrullus lanatus)(西瓜(watermelon))、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵)、茄(Solanum melongena)(茄子)、罂粟(Papaver somniferum)(罂粟(opium poppy))、鬼罂粟(Papaver orientale)、浆果紫杉(Taxus baccata)、短叶紫杉(Taxus brevifolia)、黄花蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis saliva)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、玫瑰红长春花(Vinca rosea)、正鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Coichicumautumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、紫花洋地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属(Dioscorea)某些种、穿心莲(Andrographispaniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属(Berberis)某些种、三尖杉属(Cephalotaxus)某些种、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属(Ephedra)某些种、古柯(Erythroxylum coca)、沃诺瑞雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属(Scopolia)某些种、千层塔(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属(Lycopodium)某些种、萝芙木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属(Rauwolfia)某些种、加拿大血根草(Sanguinaria canadensis)、天仙子属(Hyoscyamus)某些种、金盏花(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)、短舌匹菊(Tanacetum parthenium)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(银胶菊(guayule))、橡胶树属(Hevea)某些种(橡胶)、留兰香(Mentha spicata)(薄荷属植物(mint))、辣薄荷(Mentha piperita)(薄荷属植物)、红木(Bixa orellana)、六出花属(Alstroemeria)某些种、蔷薇属(Rosa)某些种(蔷薇)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)(香石竹)、碧冬茄属(Petunia)某些种(矮牵牛)、一品红(Poinsettia pulcherrima))(一品红(poinsettia))、烟草(Nicotiana tabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(Lupinusalbus)(羽扇豆)、海燕麦(Uniola paniculata)(燕麦)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦(barley))和黑麦草属(Lolium)某些种(黑麦)。
在一些实例中，可使用单子叶植物。单子叶植物属于以下目：泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、槟榔目(Arecales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯心草目(Juncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Najadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物门(Gymnospermae)的植物是苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)和松柏目(Pinales)。在一些实例中，单子叶植物可选自由玉蜀黍、水稻、小麦、大麦和甘蔗组成的组。
在一些实例中，可使用双子叶植物，其包括属于以下目的那些：马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapensales)、五桠果目(Dilleniales)、川绿断目(Dipsacales)、柿目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、山毛榉目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、Middles、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、塞子木目(Leitneriales)、木兰目(Magniolales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前草目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumbaginales)、河苔草目(Podostemales)、花葱目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆栏树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)和万乐目(Violates)。在一些实例中，双子叶植物可选自由棉花、大豆、胡椒和番茄组成的组。
在一些情况下，待改善的植物不容易适合于实验条件。例如，作物植物可能花费过长时间才能生长到足以在多个迭代中连续地实际评定改善的性状。因此，最初从中分离出细菌的第一植物以及/或者其中施加了经遗传操作的细菌的多个植物可以是模式植物，诸如更适合于在期望条件下评价的植物。模式植物的非限制性实例包括狗尾草属、短柄草属(Brachypodium)和拟南芥属(Arabidopsis)。然后可将根据本公开的方法使用模式植物分离的细菌的能力应用于另一类型的植物(例如，作物植物)以确认改善性状的赋予。
虽然本文已示出和描述本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员明显的，此类实施方案仅以举例的方式提供。在不偏离本发明的情况下本领域技术人员将可以作出许多变型、变化和替换。应当理解，可采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。意图所附权利要求限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。
实施例
实施例1–重构phoC1和phoC2的表达
为了改善CI019对有机磷酸盐的增溶，设计并构建了多个含有CI019 phoC基因重构表达盒的质粒。首先，对编码phoC1和phoC2的开放阅读框进行密码子随机化以去除任何内部调控序列(SEQ ID NO:3和4)。接着，设计三个异源启动子-RBS部件：1)如先前所公布的含有工程改造的组成型lac启动子和优化的合成核糖体结合位点(RBS aggagg)(Vick等，2011，SEQ ID NO:5)的部件，2)含有来自标准生物部件登记处(Registry of StandardBiological Parts)的启动子BBa_J23110和RBS BBa_B0032(parts.igem.org/Catalog，SEQID NO:6和7)的部件，和3)含有蔗糖肠杆菌菌株的组成型和高表达的lpp基因的启动子和RBS(CI006,SEQ ID NO:8)的部件。最后，将含有每个启动子-RBS部件和phoC密码子-随机化基因组合的构建体组装至具有KanR抗性标记和CloDF13复制起点(SEQ ID NO:9和10)的质粒骨架中。将CI019用每种所得质粒转化，并且储备转化体并用于下游温室实验。
实施例2–植物体中的重构的phoC1和phoC2的表达的分析
为了评估植物体中的菌株转录活性，量取600g经高压灭菌的砂置于656mL盆中，将该盆用无菌DI H2O浸透并让其沥干24小时，此时将玉米种子(DKC 66-40)播种在1cm深处。将植物在荧光灯下在平均22℃(夜间)至26℃(白天)的室温下维持4周，其中日长16小时。在播种后5天，将1ml细胞悬浮液通过直接淋洒在新生胚芽鞘上来接种在幼苗上。从5ml在SOB中的过夜培养物制备接种物，将所述过夜培养物旋转沉淀并再悬浮于PBS中以最终稀释至1.0的OD590(大约109CFU/ml)。用无菌PBS处理对照植物，并将每种处理剂施加至5株重复植物上。根据需要给植物浇水，并在周一-周三-周五用25mL改良霍格兰氏溶液进行施肥。在17天后，收获根并将沙子振荡掉，然后将根浸入RNA稳定化溶液中30分钟，并在-80℃下储存以用于随后的根和微生物RNA和DNA提取。
在解冻后，然后用无菌去离子水短暂冲洗根。在组织裂解仪(TissueLyser II,Qiagen P/N 85300)中使用利用1/2英寸不锈钢球轴承的珠粒击打，将样品在2ml裂解缓冲液(Qiagen P/N 79216)中均质化。用ZR-96Quick-gDNA试剂盒(Zymo Research P/N D3010)执行基因组DNA提取并且使用RNeasy试剂盒(Qiagen P/N 74104)执行RNA提取。
通过qPCR用设计成扩增野生型亲本菌株的独特区域的引物测量根定殖。使用由已知量的来自靶基因组的gDNA产生的标准曲线测量qPCR反应效率。使用组织重量和提取体积将数据以每克鲜重的基因组拷贝数作归一化。图1中标绘的数据显示，表达phoC1和phoC2的菌株以与野生型亲本(CI019)相似的水平定殖于玉米根。
通过Nanostring分析测量靶基因的转录物水平。在nCounter Sprint(CoreDiagnostics,Hayward,CA)上处理纯化的RNA。将拷贝数以持家基因rpsL作归一化，以说明总RNA产率和来自根组织样品的微生物定殖的差异。在图2A(表达突变体19-1235和19-1237(phoC1))和图2B(表达突变体19-1234(phoC2))中标绘的数据显示，植物体中的phoC转录物水平与它们的野生型亲本(CI019)相比增加。
实施例3：变栖克雷伯菌菌株对磷酸盐的增溶
对变栖克雷伯菌137的一个野生型(WT)和7个突变菌株进行了磷酸盐增溶筛选。简单地说，该测定包括在不溶形式的磷酸盐存在下培养每个菌株，收集经培养的微生物的上清液，以及对上清液执行比色测定以确定可溶性磷酸盐的含量。
每个所测定菌株的列表和简要说明提供于表1中。每个菌株的序列提供于表9中。
表1：变栖克雷伯菌菌株说明
Figure BDA0002982851130000971
将所有菌株从在超优肉汤(super optimal broth,SOB)板上的冷冻储备液中划出来(streaked out)。将板在30℃下孵育过夜。对于每个菌株，将3个来自过夜板的单个菌落接种至5mL液体SOB中。使这些培养物在振荡下在30℃下生长过夜。测量了每种过夜SOB培养物在590nm处的光密度(OD590)。为了使各菌株的起始光密度归一化，在125mL锥形烧瓶中的25mL国家植物研究所的磷酸盐-溴酚蓝(National Botanical Research Institute’sPhosphate-Bromo,NBRIP-BPB)生长培养基中添加足够体积的每种培养物，使得每种培养物的起始OD590为0.03(修改自Dash,N.,Pahari,A.,Dangar,T.,2017.Functionalities ofPhosphate-Solubilizing Bacteria of Rice Rhizosphere:Techniques andPerspectives.Recent Advances in Applied Microbiology,151-163.)。NBRIP-BPB含有5g/L Ca3(PO4)2(不溶形式的无机磷酸盐)。将烧瓶转移至设定为30℃温度并以200rpm振荡的振荡器/孵育箱中。将两个含有25mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基的烧瓶与培养烧瓶一起作为阴性对照孵育。
在接种日(D0)，对于每种培养物，将1.5mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基转移至两个2mL离心管中的每一个中。将这些离心管在台式离心机中以13.2krpm旋转沉淀5分钟。取出上清液并测试可溶性磷酸盐浓度。在D0，测得的背景可溶性磷酸盐为约3μg/mL。
在随后的时间点，接种后第1天(D1)、接种后第4天(D4)、接种后第7天(D7)和接种后第10天(D10)，从振荡器/孵育箱中移出烧瓶，如上文所述的那样收集样品，并如上文所述的那样通过离心收集上清液。在收集上清液后，将烧瓶各自放回以继续孵育。
使用修改版本的抗坏血酸方法(Murphy,J.,Riley,J.P.,1962.A modifiedsingle solution method for determination of phosphate in naturalwaters.Analytica Chimica Acta 27,31-36)对上清液样品的可溶性磷酸盐含量进行定量。通过将已知浓度的磷酸钾溶解于分子水中来在0.5μg/mL P至10μg/mL P的范围内制备标准曲线。使用分子水稀释样品，直至它们的可溶性磷酸盐浓度落在标准曲线的范围内。将200μL每种标准品和样品添加至透明微孔板的孔中，并且将40μL活性试剂添加至每个孔中并通过用移液管吹吸进行混合。在进行比色测定的每天，将活性试剂新鲜制备为25mL 5N硫酸、7.5mL 40g/L钼酸铵、15mL0.1M抗坏血酸和2.5mL酒石酸氧锑钾(1mg Sb/mL)。将板在RT下孵育，并测量每个孔在882nm处的吸光度。通过从拟合至直角双曲线的标准浓度进行外推来计算样品浓度。
表2给出了变栖克雷伯菌137和重塑菌株的三个重复培养物的平均可溶性磷酸盐。在第7天，在所有重塑菌株中都观察到平均可溶性磷酸盐的>10％增加，并且在第10天，观察到所有重塑菌株的平均可溶性磷酸盐的>20％增加。
表2：所产生的变栖克雷伯菌平均可溶性磷酸盐
Figure BDA0002982851130000991
变栖克雷伯菌(137)和重塑菌株的三个重复培养物中的可溶性磷酸盐示于图3中。所有菌株均增溶高于约3μg/mL的D0背景水平的磷酸盐。在第10天，与野生型137相比，观察到137-1914(p＝0.04)、137-1916(p＝0.02)和137-2311(p＝0.04)培养物中的可溶性磷酸盐的统计学显著增加。P值是使用双尾双样本不等方差T检验确定的。
实施例4：水生拉恩菌菌株对磷酸盐的增溶
对水生拉恩菌CI019的一个野生型(WT)和3个突变菌株进行了磷酸盐增溶筛选。简单地说，该测定包括在不溶形式的磷酸盐存在下培养每个菌株，收集经培养的微生物的上清液，以及对上清液执行比色测定以确定可溶性磷酸盐的含量。
每个所测定菌株的列表和简要说明提供于表3中。每个菌株的序列提供于表9中。
表3：水生拉恩菌菌株说明
Figure BDA0002982851130000992
Figure BDA0002982851130001001
将所有菌株从在超优肉汤(super optimal broth,SOB)板上的冷冻储备液中划出来(streaked out)。将板在30℃下孵育过夜。对于每个菌株，将3个来自过夜板的单个菌落接种至5mL液体SOB中。使这些培养物在振荡下在30℃下生长过夜。测量了每种过夜SOB培养物在590nm处的光密度(OD590)。为了使各菌株的起始光密度归一化，在125mL锥形烧瓶中的25mL国家植物研究所的磷酸盐-溴酚蓝(National Botanical Research Institute’sPhosphate-Bromo,NBRIP-BPB)(修改自Dash等人,2017)生长培养基中添加足够体积的每种培养物，使得每种培养物的起始OD590为0.03。NBRIP-BPB含有5g/L Ca3(PO4)2(不溶形式的无机磷酸盐)。将烧瓶转移至设定为30℃温度并以200rpm振荡的振荡器/孵育箱中。将两个含有25mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基的烧瓶与培养烧瓶一起作为阴性对照孵育。
在接种日(D0)，对于每种培养物，将1.5mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基转移至两个2mL离心管中的每一个中。将这些离心管在台式离心机中以13.2krpm旋转沉淀5分钟。取出上清液并测试可溶性磷酸盐浓度。在D0，测得的背景可溶性磷酸盐为约3μg/mL。
在随后的时间点，接种后第1天(D1)、接种后第4天(D4)、接种后第7天(D7)和接种后第10天(D10)，从振荡器/孵育箱中移出烧瓶，如上文所述的那样收集样品，并如上文所述的那样通过离心收集上清液。在收集上清液后，将烧瓶各自放回以继续孵育。
使用修改版本的抗坏血酸方法(Murphy和Riley,1962)对上清液样品的可溶性磷酸盐含量进行定量。通过将已知浓度的磷酸钾溶解于分子水中来在0.5μg/mL P至10μg/mLP的范围内制备标准曲线。使用分子水稀释样品，直至它们的可溶性磷酸盐浓度落在标准曲线的范围内。将200μL每种标准品和样品添加至透明微孔板的孔中，并且将40μL活性试剂添加至每个孔中并通过用移液管吹吸进行混合。在进行比色测定的每天，将活性试剂新鲜制备为25mL 5N硫酸、7.5mL40g/L钼酸铵、15mL 0.1M抗坏血酸和2.5mL酒石酸氧锑钾(1mg Sb/mL)。将板在RT下孵育，并测量每个孔在882nm处的吸光度。通过从拟合至直角双曲线的标准浓度进行外推来计算样品浓度。
表4给出了水生拉恩菌CI019和重塑菌株的三个重复培养物的平均可溶性磷酸盐。在第1天和第7天，与WT CI019相比，所有重组菌株均显示出可溶性磷酸盐的至少10％增加
表4：水生拉恩菌菌株CI019和所产生的衍生物平均可溶性磷酸盐
Figure BDA0002982851130001011
水生拉恩菌CI019和重塑菌株的三个重复培养物中的可溶性磷酸盐示于图4中。所有菌株均增溶高于约3μg/mL的D0背景水平的磷酸盐。在第1天，与WT CI019相比，所有三个菌株均显示出可溶性磷酸盐的显著增加(p<0.03)。P值是使用双尾双样本不等方差T检验确定的。
实施例5：此外的水生拉恩菌菌株对磷酸盐的增溶
对水生拉恩菌63的一个野生型(WT)和8个突变菌株进行了磷酸盐增溶筛选。简单地说，该测定包括在不溶形式的磷酸盐存在下培养每个菌株，收集经培养的微生物的上清液，以及对上清液执行比色测定以确定可溶性磷酸盐的含量。
每个所测定菌株的列表和简要说明提供于表5中。每个菌株的序列提供于表9中。已产生但尚未针对磷酸盐增溶进行筛选的一些此外的菌株列于表7中。
表5：水生拉恩菌说明
Figure BDA0002982851130001021
将所有菌株从在超优肉汤(super optimal broth,SOB)板上的冷冻储备液中划出来(streaked out)。将板在30℃下孵育过夜。对于每个菌株，将3个来自过夜板的单个菌落接种至5mL液体SOB中。使这些培养物在振荡下在30℃下生长过夜。测量了每种过夜SOB培养物在590nm处的光密度(OD590)。为了使各菌株的起始光密度归一化，在125mL锥形烧瓶中的25mL国家植物研究所的磷酸盐-溴酚蓝(National Botanical Research Institute’sPhosphate-Bromo Phenol Blue,NBRIP-BPB)(修改自Dash等人,2017)生长培养基中添加足够体积的每种培养物，使得每种培养物的起始OD590为0.03。NBRIP-BPB含有5g/L Ca3(PO4)2(不溶形式的无机磷酸盐)。将烧瓶转移至设定为30℃温度并以200rpm振荡的振荡器/孵育箱中。将两个含有25mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基的烧瓶与培养烧瓶一起作为阴性对照孵育。
在接种日(D0)，对于每种培养物，将1.5mL未接种的NBRIP-BPB生长培养基转移至两个2mL离心管中的每一个中。将这些离心管在台式离心机中以13.2krpm旋转沉淀5分钟。取出上清液并测试可溶性磷酸盐浓度。在D0，测得的背景可溶性磷酸盐为约3μg/mL。
在随后的时间点，接种后第1天(D1)、接种后第4天(D4)、接种后第7天(D7)和接种后第10天(D10)，从振荡器/孵育箱中移出烧瓶，如上文所述的那样收集样品，并如上文所述的那样通过离心收集上清液。在收集上清液后，将烧瓶各自放回以继续孵育。
使用修改版本的抗坏血酸方法(Murphy和Riley,1962)对上清液样品的可溶性磷酸盐含量进行定量。通过将已知浓度的磷酸钾溶解于分子水中来在0.5μg/mL P至10μg/mLP的范围内制备标准曲线。使用分子水稀释样品，直至它们的可溶性磷酸盐浓度落在标准曲线的范围内。将200μL每种标准品和样品添加至透明微孔板的孔中，并且将40μL活性试剂添加至每个孔中并通过用移液管吹吸进行混合。在进行比色测定的每天，将活性试剂新鲜制备为25mL 5N硫酸、7.5mL40g/L钼酸铵、15mL 0.1M抗坏血酸和2.5mL酒石酸氧锑钾(1mg Sb/mL)。将板在RT下孵育，并测量每个孔在882nm处的吸光度。通过从拟合至直角双曲线的标准浓度进行外推来计算样品浓度。
表6给出了水生拉恩菌63和重塑菌株的三个重复培养物的平均可溶性磷酸盐。在第7天和第10天，除63-1570以外的所有菌株均显示出平均增溶磷酸盐增加。
表6：水生拉恩菌菌株63和衍生物平均可溶性磷酸盐
Figure BDA0002982851130001041
水生拉恩菌63和重塑菌株的三个重复培养物中的可溶性磷酸盐示于图5中。所有菌株均增溶高于约3μg/mL的D0背景水平的磷酸盐。在第1天，与WT 63相比，63-1647显示出增溶的磷酸盐的统计学显著增加(p＝0.04)。在第10天，与WT 63相比，63-1479显示出增溶的磷酸盐接近显著的增加(p＝0.06)。P值是使用双尾双样本不等方差T检验确定的。
表7：此外的水生拉恩菌菌株
Figure BDA0002982851130001042
Figure BDA0002982851130001051
Figure BDA0002982851130001061
表8：本公开中引用的序列
SEQ ID NO： 说明
1 PhoC1原生序列
2 PhoC2原生序列
3 PhoC1密码子随机化
4 PhoC2密码子随机化
5 Plac'+RBS
6 Bba_J23110
7 Bba_B0032
8 Plpp+RBS
9 CloDF13
10 KanR
表9：此外的序列
Figure BDA0002982851130001062
Figure BDA0002982851130001071
Figure BDA0002982851130001081
序列表
<110> 皮沃特生物股份有限公司(PIVOT BIO, INC.)
<120> 用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物
<130> 47736-711.601
<140>
<141>
<150> 62/734,777
<151> 2018-09-21
<160> 93
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 1
gtgcgcaaga ccctcgttgc tctgctgctt ttcaccctcg gttccacgtt tgccgtccag 60
gccgctgacg aagccaaacc ctttatcacc agtcaggaac tggatctgac caaatatctg 120
cccgcgccac cggcggatga ttcggcgcag accaaagcgg aactgaaaga attgctggaa 180
attcaggcca cccgtacacc ggagcaggaa aaagcggcga ttgccgatgc tgaggaaaac 240
gtctggcgtt ttgccgacgt gatggggccg gactttgatg ccgcaaaact gccgaaaacc 300
gcggcactgt ttgatcgtat tgttgcgacc gaagatgtgg tggacgatca cgccaagaaa 360
gcctttaacc gcccgcgtcc ttacatgctg gatgaacaga tccatccgct gctgaaaaaa 420
tccaaatccg gctcatggcc ttccggtcat tcgactatcg gttacctgat ggcgaccgtg 480
ctcggtgaaa tggtgccgga aaaacgtaat gcgctgttta cccgtgcagc cggttatgcc 540
gaaaaccgtc tggtggctgg tttccattac cgttctgata ccgtgatgag ccgcaccggt 600
gctgcgctga ttgcccagaa aatggaagag caaccggatt tcaaaaccga attcgacgcg 660
gcgaaagcgg aagttcgtgc acagcttggt ctgaaataa 699
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 2
atgaaaatta ttactacttt ttgcctcgcc agcttttttt ctgtcagctc gtttgccctg 60
accggcaatg atgcaaccac caaaccagac ctttactact taaaaaatga tcaggcgatt 120
aacagcctgg cgctgctgcc gccaccacct gcggtgggca gtatcgcttt cctaaacgat 180
caggccatgt atgaacaggg gcgtctgctg cgctcaactg aacgtggcaa actggctgcc 240
gaagatgcca acctgagtgc cggtggcgtc gcgaacgctt tctcgggcgc attcggttcg 300
ccgatcaccg ctaaagacac accggaattg cacaaactgc tgaccaatat gattgaagat 360
gcaggtgacc ttgcgacacg ttctgctaaa gaaaagtaca tgcgcatccg cccgtttgcc 420
ttctatggtg tgccgacctg taacaccact gagcaggata agctgtccaa aaacggttcg 480
tatccttccg ggcacacttc tattggctgg gctacggcgc tggtactcac agaaattaac 540
ccgcagcgcc aggatcaaat cctgcaacgt ggtttcgatt taggacaaag ccgtgtgatt 600
tgtggctacc actggcaaag tgatgtcgat gcggcccgta tcgtgggctc cgctgtggtc 660
gctaccttgc atacgaattc ggctttccag caacagttgc aaaaagccaa agaagagttt 720
gcgaaacagc atccgtaa 738
<210> 3
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 3
atgcgcaaaa ccctggtggc gctgctgctg tttaccctgg gcagcacctt tgcggtgcag 60
gcggcggatg aagcgaaacc gtttattacc agccaggaac tggatctgac caaatatctg 120
ccggcgccgc cggcggatga tagcgcgcag accaaagcgg aactgaaaga actgctggaa 180
attcaggcga cccgcacccc ggaacaggaa aaagcggcga ttgcggatgc ggaagaaaac 240
gtgtggcgct ttgcggatgt gatgggcccg gattttgatg cggcgaaact gccgaaaacc 300
gcggcgctgt ttgatcgcat tgtggcgacc gaagatgtgg tggatgatca tgcgaaaaaa 360
gcgtttaacc gcccgcgccc gtatatgctg gatgaacaga ttcatccgct gctgaaaaaa 420
agcaaaagcg gcagctggcc gagcggccat agcaccattg gctatctgat ggcgaccgtg 480
ctgggcgaaa tggtgccgga aaaacgcaac gcgctgttta cccgcgcggc gggctatgcg 540
gaaaaccgcc tggtggcggg ctttcattat cgcagcgata ccgtgatgag ccgcaccggc 600
gcggcgctga ttgcgcagaa aatggaagaa cagccggatt ttaaaaccga atttgatgcg 660
gcgaaagcgg aagtgcgcgc gcagctgggc ctgaaatga 699
<210> 4
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 4
atgaaaatta ttaccacctt ttgcctggcg agctttttta gcgtgagcag ctttgcgctg 60
accggcaacg atgcgaccac caaaccggat ctgtattatc tgaaaaacga tcaggcgatt 120
aacagcctgg cgctgctgcc gccgccgccg gcggtgggca gcattgcgtt tctgaacgat 180
caggcgatgt atgaacaggg ccgcctgctg cgcagcaccg aacgcggcaa actggcggcg 240
gaagatgcga acctgagcgc gggcggcgtg gcgaacgcgt ttagcggcgc gtttggcagc 300
ccgattaccg cgaaagatac cccggaactg cataaactgc tgaccaacat gattgaagat 360
gcgggcgatc tggcgacccg cagcgcgaaa gaaaaatata tgcgcattcg cccgtttgcg 420
ttttatggcg tgccgacctg caacaccacc gaacaggata aactgagcaa aaacggcagc 480
tatccgagcg gccataccag cattggctgg gcgaccgcgc tggtgctgac cgaaattaac 540
ccgcagcgcc aggatcagat tctgcagcgc ggctttgatc tgggccagag ccgcgtgatt 600
tgcggctatc attggcagag cgatgtggat gcggcgcgca ttgtgggcag cgcggtggtg 660
gcgaccctgc ataccaacag cgcgtttcag cagcagctgc agaaagcgaa agaagaattt 720
gcgaaacagc atccgtga 738
<210> 5
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 5
acaggctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 60
gtggaattgt gagcgtctag tagaaggagg agatctggat ccat 104
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 6
tttacggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 7
tcacacagga aag 13
<210> 8
<211> 313
<212> DNA
<213> 蔗糖肠杆菌(Enterobacter sacchari)
<400> 8
acagtaataa ccggacaatt cggactgatt aaaaaagcgc ccttgtggcg ctttttttat 60
attcccgcct ccatttaaaa taaaaaatcc aatcggattt cactatttaa actggccatt 120
atctaagatg aatccgatgg aagctcgctg ttttaacacg cgttttttaa ccttttattg 180
aaagtcggtg cttctttgag cgaacgatca aatttaagtg gattcccatc aaaaaaatat 240
tctcaaccta aaaaagtttg tgtaatactt gtaacgctac atggagatta actcaatcta 300
gagggtatta ata 313
<210> 9
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成载体序列"
<400> 9
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atcttttgcc ctgtaaacga 60
aaaaaccacc tggggaggtg gtttgatcga aggttaagtc agttggggaa ctgcttaacc 120
gtggtaactg gctttcgcag agcacagcaa ccaaatctgt ccttccagtg tagccggact 180
ttggcgcaca cttcaagagc aaccgcgtgt ttagctaaac aaatcctctg cgaactccca 240
gttaccaatg gctgctgcca gtggcgtttt accgtgcttt tccgggttgg actcaagtga 300
acagttaccg gataaggcgc agcagtcggg ctgaacgggg agttcttgct tacagcccag 360
cttggagcga acgacctaca ccgagccgag ataccagtgt gtgagctatg agaaagcgcc 420
acacttcccg taagggagaa aggcggaaca ggtatccggt aaacggcagg gtcggaacag 480
gagagcgcaa gagggagcga cccgccggaa acggtgggga tctttaagtc ctgtcgggtt 540
tcgcccgtac tgtcagattc atggttgagc ctcacggctc ccacagatgc accggaaaag 600
cgtctgttta tgtgaactct ggcaggaggg cggagcctat ggaaaaacgc caccggcgcg 660
gccctgctgt tttgcctcac atgttagtcc cctgcttatc cacggaatct gtgggtaact 720
ttgtatgtgt ccgcagcgc 739
<210> 10
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成载体序列"
<400> 10
ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60
accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120
aagaatggca aggtcctggt aacggtctgc gattccgacc cgtccaacat caatacaacc 180
tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240
tgaatccggt gagaatggca agagcttgtg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300
gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca tgcgtgattg 360
cgcctgagca agacgaaata cacgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420
atgtaaccgg cgcaggaaca cggccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480
ttcttctaat acctggaagg ctgttttccc aggaatcgcg gtggtgagta accacgcatc 540
atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cgggagaggc ataaactccg tcagccagtt 600
gagacggacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660
caactctggc gcatcgggct tcccatacaa gcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720
attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcgtcc atgttggagt ttaagcgcgg 780
acgggagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 840
gtaagcagac ag 852
<210> 11
<211> 5215
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 11
tggcaattgt tgcgggcatg tgaatttatg cttgccccag gagataaatc cgttaccgtg 60
gcaggcattt ttcaccactt aagaacgcag gaacccgcta tggcgatttt tgatggtcac 120
aatgacctgc tgttgaatct ctggcttcac catcgtgagg atccggtaag cgccttcttt 180
gtcgggatag aaaacggcca tctcgactat ccgcgtatcc gccagggcgg gctggccggc 240
ggcctgttcg ccctctttgt gccgccgcag gagtatatcg cccgcgtggc gccgcagtac 300
gccagcgagg cgtgggatcc gctggcgatc ctctggcagc agttggctat cctcaaggcg 360
atttgcgccc atgacgccag ccgcgcgcgg ctgtgcctga gcgcggcgga tatcgaacgc 420
tgtcgccagg ataacgcgct ggcgatggtg gcgcacatcg aaggtgctgg cgggttcgac 480
gcgcaaggcg aagatctgca ggccttttat cgcgccgggg tgcgcagcat tggtccgttc 540
tggaacatcg ccaatcgctt cggctgcggg gtcaccggcg cctttcccgg cagcccggac 600
agcgggccgg gtctcactcg cgagggcatt gcgctcatcg ctcaggccaa cgccctgaag 660
atgcagatcg atgtttcgca catgaatgaa caggcctttt gggataccgc ccaccactcc 720
accgccccac tggtggccac ccactctaat gcccacgccc tgtgcccaca gccgcgcaat 780
ctgaccgacc ggcaactgcg ggcgatccgc gacagcggcg gcgtagtggg cgtcaatttc 840
ggcaatgctt tcctgcgcgc cgacggacgg cgcgacagcg acacgccctt aaccaccatt 900
gtccggcata tcgactatct tattaacata atgggtgagg atcatgtggc tctcggctcg 960
gattttgacg gcatcaccct gcccgacgag ctgggcgatg tggccggctt accgcggctt 1020
atcaatgcct tgcgggacaa tggctatgat caattggtgc tggataagct gctgtggaac 1080
aactggctgc gggtattaaa aaaggtttgg caacaatagg ttatattgta aacataaagt 1140
taattcctta cagattccgg gttgatctct ctcccggtga agcgcaatat gcggcggccg 1200
tcacagatcc agcattatcc gtgaggcctg tcgtcatttt taagaggaac aaaacatgtg 1260
gaagaaacct gcttttatcg atttacgtct cggtctggaa gtgacgctgt acatttctaa 1320
ccgttaatcg ccccgcccgc cgttcgcgcg ggcaccttca ttcattaccc ggtccgtctt 1380
catgttcatt aaagtcctcg gctccgccgc cggcggcggt ttcccgcaat ggaactgcaa 1440
ctgcgccaac tgtcagggtc tgcgcaacgg caccattcag gccagtgccc gcacccagtc 1500
gtcgatcatc gtcagcgata acggcaaaga gtgggtgctg tgcaatgcct cgccggatat 1560
cagccagcag attgcccata cccccgagtt aaataaaccc ggcgtactgc gcgggacgtc 1620
tatcggcggc attattctca ccgacagcca gatcgaccac accaccgggt tgctgagcct 1680
gcgcgaaggc tgcccgcacc aggtgtggtg cacgccggag gttcatcagg atctctccac 1740
cggcttcccg gtgtttacca tgctgcgaca ctggaacggc ggcctggtgc atcatcccat 1800
cgcgccgcag cagcctttta ccgttgacgc ctgccctgat ttgcagttta ccgccgtgcc 1860
tatcgccagc aacgcgccgc cctattcgcc gtatcgcgac cggccgctgc cgggccataa 1920
cgtggcgctg tttatcgaaa accgccgcaa cgggcagacg ctgttctatg ccccggggct 1980
gggtgagccg gatgaagccc ttctgccgtg gctgcaaaaa gcggactgtc tgctgatcga 2040
tggcaccgtc tggcaggatg acgagctgca ggccgccggc gtcgggcgca ataccggtcg 2100
cgatatggga cacctggcgc tcagcgatga gcacgggatg atggccttgc tggcctccct 2160
gccggcaaaa cgcaaaattc tcattcatat taataacacc aacccgatcc ttaacgaaca 2220
gtctccccag cgccaggcgc taacgcaaca ggggattgaa gtgagctggg acgggatggc 2280
aatcaccctt caggataccg catgctgatc accgacacgc tgtcgccgca ggcctttgca 2340
gaggctctgc gggctaaagg cgccttctac catattcacc acccttacca catcgccatg 2400
cataacggcg aagcgacccg cgagcaaatt cagggttggg tggcgaaccg gttttattac 2460
cagaccacca ttccgctgaa agacgcggcg attatggcta actgcccgga tgcgcagacc 2520
cggcgcaaat gggtgcagcg gatcctcgac cacgacggta gccacggcga agatggcggg 2580
attgaagcct ggctgcggct gggggaagcg gtcggtttga gccgcgacga cctgctcagc 2640
gagcgtcacg tgctgcccgg cgtgcgcttc gcggtggatg cctatcttaa tttcgctcgt 2700
cgcgcctgct ggcaggaggc ggcctgcagc tccctgaccg agctgttcgc cccacagatc 2760
catcagtcgc gcctcgacag ctggccgcag cactatccgt ggatcaaaga ggaaggctat 2820
ttttacttcc gcagtcgtct gagccaggct aaccgcgacg ttgagcatgg tctggcgctg 2880
gcgaagacct actgtgacag cgctgaaaaa cagaaccgga tgctggagat cctgcagttt 2940
aagctcgaca tcctgtggtc gatgctcgat gccatgacca tggcctacgc tctgcagcgc 3000
ccgccctatc acacggtcac cgacaaggcg gcctggcaca cgacccgact ggtgtaatca 3060
tgcaaaaaac gtccatcgtt gcctttcgtc gcggctaccg actgcagtgg gaagccgccc 3120
aggagagcca tgtgatcctc tatccggagg gaatggctaa actcaatgag accgccgcgg 3180
cgatcctcga gctggtcgat ggccggcgcg acgtcgcggc gattatcgcc atgcttaacg 3240
aacgtttccc ggaagccggc ggcgtcgatg acgacgtcgt cgagttcctg cagatcgcct 3300
gtcaacagaa gtggatcacc tgccgtgagc cagaataaac ccgccgtcaa tccgccgctg 3360
tggctgctgg cggagctgac ctaccgctgc ccgctgcagt gtccctactg ttccaatccg 3420
ctggacttcg cccggcagga aaaggagctg accaccgaac aatggatcga ggtctttcgc 3480
caggcgcgag cgatgggcag cgtacagctg ggcttttccg gcggcgagcc gctgacccgt 3540
aaagatctgc cggagctgat ccgcgccgcg cgcgacctcg ggttctatac caacctgatc 3600
acctcgggaa ttgggctaac cgagagcaaa ctcgacgcct tcagcgaggc cggactggac 3660
catatccaga ttagcttcca ggccagcgat gaggtgctca acgccgctct tgccggcaat 3720
aaaaaagcct tccagcagaa gctggcgatg gccagagcgg tgaaagcgcg cgactacccg 3780
atggtgctga acttcgtcct ccaccggcat aacatcgacc agctcgataa aattatcgag 3840
ctgtgcattg agctggaagc cgatgacgtc gagctcgcca cctgccagtt ttacggctgg 3900
gcgtttctta atcgcgaggg gttactgccg acccgggaac agatcgcccg cgccgagcag 3960
gtggtcgccg attaccggca gaaaatggcc gccagcggta acctcaccaa cctgctattc 4020
gtcaccccgg actattacga ggaacgcccg aaaggctgta tgggcggctg gggatcgatt 4080
ttcctcagcg tcactccgga aggcactgcg ttgccgtgcc acagcgcgcg ccagctgccg 4140
gtggcgttcc cgtcggtgct ggagcagagt ctggaatcga tctggtatga ctcgttcggc 4200
ttcaaccgtt atcgcgggta tgactggatg ccggagccgt gccgctcctg tgatgaaaaa 4260
gagaaagact tcggcggctg ccgctgtcag gcctttatgc tgaccggcag cgccgataac 4320
gccgacccgg tgtgcagcaa atccccacat catcacaaaa tccttgaggc ccggcgcgaa 4380
gcggcctgca gcgacatcaa agtcagccag ctgcagttcc gcaaccgtac ccgctcgcag 4440
cttatctaca aaacccggga actgtaatga cgctggcgac ccgcactgtc actctgccgg 4500
gcggcctgca ggctaccctg gttcatcagc cgcaggccga tcgcgcggcg gccctggtgc 4560
gggttgccgc cggcagccac catgaaccgt cgtgcttccc cggtctggcg cacctgctgg 4620
aacacctgct gttttacggc ggtgagcgct accgcaatga tgaacggctg atgagctggg 4680
tgcagcgcca ggcagggaat gtgaatgcca ccaccctgtc ccgccacagc gctttctttt 4740
tcgaggtcgc cgccgaggat ctggctgacg gcgtcgcgcg cctgcaggag atgctgcagg 4800
cgccgctgct gctcagggac gatattcaac gcgaagtcgc ggttatcgac gccgaaaacc 4860
gcctgatcca acagcatgag ttgtcgcgac gggaagccgc cgtgcgtcac gccgccatcg 4920
cgcccgcggc gtttcgccgc tttcaggtcg gcgacgccgg gtcgctgggg gaggatttcc 4980
tcgcgctaca ggcggcctta cgtgactttc accgcagcca ctacgtcgcc cgccggatgc 5040
aactctggct gcaggggccg cagtcgctgg aggtgctcgg cgaactggcg acccgtttcg 5100
ccaccgggct tgccccgggc gaggcaccgc cgccagcgcc gccgctcact ctgggcgagc 5160
cccctcaact gcagctggcc gtctccagcc agcccgcgct gtggcgctgc ccgct 5215
<210> 12
<211> 1020
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 12
atggcgattt ttgatggtca caatgacctg ctgttgaatc tctggcttca ccatcgtgag 60
gatccggtaa gcgccttctt tgtcgggata gaaaacggcc atctcgacta tccgcgtatc 120
cgccagggcg ggctggccgg cggcctgttc gccctctttg tgccgccgca ggagtatatc 180
gcccgcgtgg cgccgcagta cgccagcgag gcgtgggatc cgctggcgat cctctggcag 240
cagttggcta tcctcaaggc gatttgcgcc catgacgcca gccgcgcgcg gctgtgcctg 300
agcgcggcgg atatcgaacg ctgtcgccag gataacgcgc tggcgatggt ggcgcacatc 360
gaaggtgctg gcgggttcga cgcgcaaggc gaagatctgc aggcctttta tcgcgccggg 420
gtgcgcagca ttggtccgtt ctggaacatc gccaatcgct tcggctgcgg ggtcaccggc 480
gcctttcccg gcagcccgga cagcgggccg ggtctcactc gcgagggcat tgcgctcatc 540
gctcaggcca acgccctgaa gatgcagatc gatgtttcgc acatgaatga acaggccttt 600
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 13
atgttcatta aagtcctcgg ctccgccgcc ggcggcggtt tcccgcaatg gaactgcaac 60
tgcgccaact gtcagggtct gcgcaacggc accattcagg ccagtgcccg cacccagtcg 120
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<210> 14
<211> 756
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 14
atgctgatca ccgacacgct gtcgccgcag gcctttgcag aggctctgcg ggctaaaggc 60
gccttctacc atattcacca cccttaccac atcgccatgc ataacggcga agcgacccgc 120
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<210> 15
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<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 15
atgcaaaaaa cgtccatcgt tgcctttcgt cgcggctacc gactgcagtg ggaagccgcc 60
caggagagcc atgtgatcct ctatccggag ggaatggcta aactcaatga gaccgccgcg 120
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<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 16
gtgagccaga ataaacccgc cgtcaatccg ccgctgtggc tgctggcgga gctgacctac 60
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<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 17
aagagcgtaa cctgggcctg gtcttccagt cctatgccct gtggccgcac aaaacggtgt 60
tcgacaacgt ggcctatccg ctgaagctgc gtaaagtcgc cgccggggag ataaaagagc 120
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cggtgatcct gctggatgaa ccgctctcca accttgacgc caaactgcgc gaagaggcgc 300
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atcagaatga agcaatggcc atctccgatc gtattctgct gctgaacaat ggcgtcattg 420
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acagcctcca gctaccgctg ctgaccagca tgtacctcgg cgaccgctgg gagtacctgt 720
tccgtaccga aggcgacgac tttccgctgc gcgcctacgg aacggcgctg cgcgatgccg 780
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ccgttaagac gccagatggc acacggcttc aatattgtgt ccgtctggcg caatcacaaa 900
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<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 18
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cgccgcgacg gttcaggtat ggtgtttgtg ccgtaccttg tagacccccg ctgatgggcg 480
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cagcgcttta cctagcgtca gatcgccgct ttcccagtag ccgcggaggg tgggcaggtc 3300
gtgcgtcgtc gccacagcca ttgattgctc cgggtacagc gccggcgcgc ggaacgtttt 3360
ctctgcatca ctctcaaaat agagcacctt ataagaatag acgccgctgt tgcgtaactt 3420
gctgacaatc tccaccggta ccgtgcccag gtcttcgccg atcaccatgc agcgatgacg 3480
ctggctttcc agcgccagaa gcgacagcag atcgtcgacg ggatactgaa cgtaagcgcc 3540
atggtcggcg gtttcaccat aggggatcca ccacaaacgc agcaccgaca tcacgtgatc 3600
gatgcgcagc gcgccgcagt tctgcatatt ggcgcgcagc agatcaataa acggctcata 3660
ggcgcgagcg gcaataatat gcggatccat cggcggcagg ccccagttct ggcccagcgg 3720
gcccagaata tccggcggcg cgcccacgga cgctttcagg cagtacagct cacggtcgca 3780
ccaggtctcc gacccgcctt cggcgacgcc caccgccaga tcgcggtaga ggccaatcgg 3840
catcccgtcg cgctggctgg tttcccagca ggcggcgaac tggctccagg ccagccactg 3900
cagccagaga tagaaactga cgtcgtcctc atgctcaatg cagaaggctt tcacctccgg 3960
gctgtcgata tcctgaaagg ccttcggcca ggccggccag ccccagcgca gcgggtcctg 4020
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ctcttcgcta cgctggaaat cttcaaccgc attaacgtcg atgtagatga cgttcagcca 4320
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tatcgggtta aggccaataa acgacccgcc gcggcgggcg atttccggca acatggcccg 4440
cagatcgcca aaatcgccga tcccccagtt tttctccgag cgcagggtat aaagctgcac 4500
gcaggtgccc cacagctttt tcccctcttt cagcggctgc ggttcgtagc agcgcgccgg 4560
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cccctccggc agtttagccg gcagcggcag cgtctcgccg ccgcgggttt tcccttgata 4680
ctgcttaccg tcctcagtgg tcaggatcca ctgatactca ccgcgtcctg ccaccggcag 4740
cgacattttt ttgccgtggg tgaaaatttt cacgttcggc agcgggttaa ccgccacttt 4800
cgtggcggcg gtagagcgat gcatcgcatc cagcaggcgc tgtttggtga cagccgcgat 4860
agactgcggc ttaccgtgcg cgttgatata gctggggctg atgcccgccg ccagcgcggc 4920
attatcgagg cgtttactct ccataggcct tccttta 4957
<210> 19
<211> 4865
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 19
cgaacgggtt gaagttaaat tcctgcggca ccaggccaag ctgacgcttg gcattgacga 60
cgtctttttc cagatcgtag ccaaagacat tgacctgacc ggaggtttta ttcaccagcg 120
aactgatgat gccgatagtc gtggattttc cggccccgtt cggccccagc agggcataga 180
aatcccccgc ctcgacctgc aggtcgattc cccgcagcgc ctgaaccccg ccggggtagg 240
tttttttgag ctgttttaat tccagagcaa tggtcattaa atatctcttc tcgtgtcgtg 300
acacgtcatt aacccgcctg actcacgttt gcgttctact ggcgctggcg ccgccaacgc 360
atcggtagcc tgacgtatca cgggttaaga tggttttaaa aaaggtgagc ttaccctata 420
ttagcgcaac gcacttactt ggttacaggc cgataacgtc catgaatgat atagatacac 480
tcatcagcaa taatgcacta tggtcaaaaa tgctggtgga agaggacccc ggcttttttg 540
agaaactgtc gcagacgcag aaaccgcgct tcctttggat tggctgctct gacagccgcg 600
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acggcatctc caacctcaag atcaagcaca tcaaccacaa atagccttca ggcttagccc 1140
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cttggtttat ccagcagcgt acaaatggcc agcgatttcg gctcgcgcag gctgaggatc 1380
tcacgcactt tagacagggt attgccggaa tcgatgatgt cttccacgat cagtacatct 1440
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cacaggtcgg ccatgaacat aaatgagccg cgaagcagcc ccaccagcac catttcgctg 1620
ccgctgtcct gataatgttc gttgatttga cgacccagtt ccgcgatgcg cgctttgatc 1680
tcggattccg ggatcatcac ttctacagta tgtttcataa gactaaccat ttgattctaa 1740
atataaatca tcaaagccgc tgctttcgcc ccgacgatga ccggcaagcc atccagtata 1800
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caaacgcgct gcgctgtggc tgtacgctgc gctgctgctg gcgacgatga tctggggcgt 2160
ctgggaagtc ggcttcgact tctgggcgct gacgccgcgt agcgacatcc tcgtcttctt 2220
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cagctcgatt gtggcgctga acgccaccac cggtaagctg gcctggagct accagaccgt 3300
ccaccacgat ctgtgggata tggatatgcc ctcccagccg acgctggctg acattgaggt 3360
taatggtaaa accgtaccgg tcgtctatgc cccggcgaaa accggcaaca tcttcgtact 3420
ggatcgccgt aatggcgagc tggtggtccc ggccccggaa aaaccggttc cgcagggcgc 3480
tgccaaaggg gattacgtcg ccaaaaccca gccgttctcc gatctgagct tccgtccgaa 3540
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cgtgatcttc caccagatgc gctatgaagg tatcttcacc ccgccatctg agcagggcac 3660
tctcgtcttc ccgggtaacc tggggatgtt tgaatggggc ggtatctccg tcgatccgaa 3720
ccgtcaggtg gctattgcca acccgatggc gctgccgttc gtctctaaac tgatcccacg 3780
cggcccgggc aacccgatgg agccgccgaa agatgcgaaa ggctctggca ccgagtccgg 3840
cgtgcagcca cagtacggtg tcccgtacgg cgtcactctg aatccgttcc tgtcgccgtt 3900
cggtctgccg tgcaaacaac cggcctgggg ctatatctcc gcgctggatc tgaaaaccaa 3960
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ggttaagctg ccgttcacca tggggatgcc gatgcttggc ggcccgatct ctacggccgg 4080
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cgaagtgaat ggcaaacagt atgttgtcat ctctgccggc ggtcacggct cgttcggtac 4260
caaaatgggc gattacatcg tcgcctatgc gctcccggat gacgccaaat aaaacgcaaa 4320
acggcaacga aagttgccgt tttttttgtg tttatccctt ctccccatgg aagatggcag 4380
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aggtggcagt gggccatata ggcaaactcc ttcggcgccg gatgatcaaa cttcaccaac 4500
acttcactga cgtcaccttc cacgcggaca gtatctttcc agccgctgcg gtgcgcggct 4560
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aacatcggca cattcatgtc gaaggctttg ccgttgatgc ggttggcgtt atggaaatca 4740
aaccccttgc ctgacgacat gccatgatcc cgaccagcct cgtggttcat attgctcata 4800
ttgctcatgt cgccatggtg catattgctc atgtcgccca tgccgccatg ccccatcatg 4860
ccgtg 4865
<210> 20
<211> 299
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 20
cgccgtcctc gcagtaccat tgcaaccgac tttacagcaa gaagtgattc tggcacgcat 60
ggaacaaatt cttgccagtc gggctttatc cgatgacgaa cgcgcacagc ttttatatga 120
gcgcggagtg ttgtatgata gtctcggtct gagggcatta gcgcgaaatg atttttcaca 180
agcgctggca atccgacccg atatgcctga agtattcaat tacttaggca tttacttaac 240
gcaggcaggc aattttgatg ctgcctatga agcgtttgat tctgtacttg agcttgatc 299
<210> 21
<211> 300
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 21
acgaccaaac tgcacgtaca tgacgagaac aacgaatgcg gtatcggtga cgtggttgaa 60
atccgcgaat gccgtccgct gtccaagact aagtcctgga cgctggttcg cgttgtagag 120
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gtttattttt tctacccata tctggtttgt ggtgttataa tgccgcgccc tcgatatggg 240
gctttttaac gaccctaatt ttcgggactc agtagtagtt gacattagcg gagcactaaa 300
<210> 22
<211> 71
<212> DNA
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 22
gaatttactt acattaaggc ggcgaggggc gcctatactt gatagttctg ataccagaag 60
aaggaagaac t 71
<210> 23
<211> 6770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 23
aacgcgctgg cgatggtggc gcacatcgaa ggtgctggcg ggttcgacgc gcaaggcgaa 60
gatctgcagg ccttttatcg cgccggggtg cgcagcattg gtccgttctg gaacatcgcc 120
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cgggacaatg gctatgatca attggtgctg gataagctgc tgtggaacaa ctggctgcgg 660
gtattaaaaa aggtttggca acaatagacg accaaactgc acgtacatga cgagaacaac 720
gaatgcggta tcggtgacgt ggttgaaatc cgcgaatgcc gtccgctgtc caagactaag 780
tcctggacgc tggttcgcgt tgtagagaaa gcggttctgt aatagagtac gcattctcga 840
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ggccgaggac gtggcgctga actggctgta tcaggatcag cacttcggct ggctggcgct 5100
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<210> 24
<211> 4012
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 24
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<210> 25
<211> 3385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 25
aacgcgctgg cgatggtggc gcacatcgaa ggtgctggcg ggttcgacgc gcaaggcgaa 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 26
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<210> 27
<211> 3858
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
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aaccggtaac atcttcgtgc tggatcgccg tgacggtaag ctgattgttg atgcgcctga 4320
gaaacctgtt ccgcaaggcg cggcgaaagg cgaccatgtg tctccgaccc agccattctc 4380
caaactgact ttccgtcctg aagccaaact gaccggtaaa gacatgtggg gcgctacgat 4440
ctacgaccaa ctgatgtgtc gtgtgatctt ccacaaactg cgttatgaag gcaccttcac 4500
gccgccatcc gagcagggca ctctggtgtt cccgggcaac ctcggtatgt tcgagtgggg 4560
cggtatttct gtggatacag accgtcaggt ggctatcgcg aacccgattg cgctgccatt 4620
cgtgtctaaa ctgatcccac gcggtccggg caaccctatc gagccagatg cgaacgataa 4680
aggcggttcc ggtactgaga ctggcattca gccgcagtac ggcgtgccat ttggcgtgac 4740
gctgaatccg ttcctgtctc cgctgggctt cccatgtaaa cagcctgcat ggggttacat 4800
ttccggtgtt gacctgaaaa ccaacgatat cgtgtggaaa aaacgtatcg gtaccgtgcg 4860
cgacagctca ccattaccgc tgccgttcaa aatgggtatg ccaatgctgg gcgcaccggt 4920
ttctaccgcc ggtaacgtgt tcttcatcgc ggcaaccgca gataactacc tgcgcgcgtt 4980
caacatgagc aacggtgaca aactgtggga agcacgtctg ccagcaggcg gccaggcaac 5040
cccgatgact tactccgtca atggcaaaca gtacgttgtt atcgcggcag gcggtcacgg 5100
ttcgtttggc accaaactgg gcgattacat catcgcttac gcactgccag 5150
<210> 33
<211> 2571
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 33
aaaaggccgt tccctggccc ttgatgcagc gggtgattta cgggtcggtc tgaggtcagg 60
cgttcagtaa agacgctgtg ctctcatgca attcatcaag caaggtataa cgcttgcggt 120
attcagaacg tttcttgctg gcaatctctt ccatcggttt gcgcggcagt tccagtggaa 180
cgtgatataa ggctgaagat gcgggcgtgg cactgatgga atcccagaat tcgttataac 240
tggcgacaaa cacgttcttc ttgcggtgac ggtaacgcag gctgcggaat acgtgaccgg 300
tatcgctgac ggcaagaatg cgctgcacgc cggttccggc agcgacacgt tgcaggcttt 360
ccagcagcag acgtttcggg aacaagccgt aacaggattt agtcgcctgt ttaatcactt 420
catgtgccgt tgaacggtgc gcgccctgga atccgccgat aatcagtgtc ctcccttccg 480
ggcgctgcac aatgctaaac gtcagtgccg caagcagcgt gtcctccata taaaggaaca 540
tgttggcttc gccttcgcgc tcagatttgc cgatggaacc gagctccacc cggaaggctt 600
caccgtcttt gccggtgaac cgggtgatgg tattgccggt cgcgctcaga aaggtattgc 660
gcaggcgggc gttttccagg cttttgacga aggcgtagtg atcaaccagt gcgtcagctc 720
gtccggctga atgcagaccg agatacagat acggcttgtg aattttactc ggtagtttgg 780
tctgcacctg gaaagcttcc tgccagaggg tttccgccgc catcttattc agcactttca 840
gggtatcgag cggatgcagt aaggtgcgaa cggcatattt gacccggaac atccggtcgc 900
gccacagatt gtccggtacg cacgctccgc tcagaagatc gacaaacagg ctgaatccgc 960
tggttttttt tgtggtttgt tcaacgggat atgcttcgct gagggactcg gtttcattga 1020
gagggatatg ttccatgatc tgtttccgct gccagaaata atcacggtat cacctgattt 1080
ttaaacctct ttacaacgtt gttttaaaga gaagcgaggt tatctgaata agtgcaggct 1140
gtttagctgc cgtttattct ggctgactga aagcgtctca ctgtctgata tctattgata 1200
tgcgtgatga gtttctcgtt ttagtacatc atacgaacgt aattacgcag aatttggtta 1260
acttagaaat gttgggaaat gttacgaaaa tgaattcgtg atgatcattc agcagttgta 1320
aggaaacttt gatgaaaatt attactactt tttgcctcgc cagccttttt tctgtcaacg 1380
cgtttgccct gaccggtaac gatgcgacca ccaaacccga tctttactac ctgaaaaacg 1440
atcaggcgat taacagcctg gcgctgcttc cgcccccgcc tgcggtgggc agtatcgctt 1500
ttctaaacga tcaggccatg tatgaacagg gtcgtctgct gcgctcaaca gaacgtggaa 1560
aactggcggc agaagatgcc aacctgagtg ccggtggcgt ggcgaacgcc ttctcgggtg 1620
ccttcggttc gccaatcacc gccaaagaca gcccggaact gcataaactg ctgaccaata 1680
tgattgaaga tgcgggtgat ctggcgacac gctccgccaa agaaaagtat atgcgcattc 1740
gtccgtttgc cttctacggt gtgccgacct gtaacaccac cgagcaggat aagctgtcga 1800
aaaacggttc gtatccctcc ggtcacacct caattggctg ggccaccgcg ctggtgctca 1860
ccgaaattaa cccgcagcgc caggaccaaa tcctgcaacg cggtttcgat ttaggccaga 1920
gccgggtaat ttgcggctac cactggcaaa gtgatgtcga tgcagcgcgc atcgtcggtt 1980
ccgccgtagt ggctaccctg cacactaacc ctgctttcca gcaacaactg caaaaagcca 2040
aagaagaatt tgctaaacag catccgtaaa tattgggcct ccccgacctg gtcttcgtaa 2100
aagccgggga gtctgtaatg ccacatctct cattgatact aaatttctga aaattgcttt 2160
tttgcaacgg tcactaattg ttaactcccc ttcacaggca taacgtcatt cctcatttta 2220
aaaaggagtt tcattatggc tagccccgca tatctctggc tatacgatgc caatggcgca 2280
ctactttatg gcggttctga ggttttaagc cgtgaaggcg cgatcgagat ccaaagcttc 2340
acgcatggtc tttccgtacc cttcgatggt aataccggtc ggctgacatc tacccgtgtt 2400
catcaaacca tgggactggt aaaagagttc gataaatcta ctccctacct ctaccgtgcc 2460
gtcgccacca gcgaaaagct gcaaaaggcg gtgattaaat ggtatcgcat taatgcggct 2520
ggtatggagg aagagttttt gaatatgaca atggaagggg tgcgcatact t 2571
<210> 34
<211> 1922
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 34
ttccagattg agaaaaagtg acaggttaag ctctgatttc aactgaaccg gagcctgtca 60
tcatgaatac caccgcaaca attctgccct cgtcccctga acgctgcgtg attgtcatca 120
atcagcaact tgccgcagga catgccgcca atgccgccgc ggtcctggcg ctgacgctcg 180
gacaacgcca tccggcgctg gtgggcgcac cgctgattga tgccgataac cgcgaacatc 240
cggggctgat cccgattggt atcagcgtgt tagtcgctga tgctcaacaa ctcacacaac 300
ttcatcagca tctgctaaat gacgatgaaa tggacggcat tattttcccg gtcgaagggc 360
agcaaaccac cgattacgcc gcctttcgtg aggcggtatc ggttgtgccg accaacaacc 420
tgcaactgct cggcatcgcg ctggcgggga ataaaaaagt ggtgcgtaag ctgaccggca 480
aactgggatt actgggctga tgcctgtcat ttaagcgtca catttcttct ctattctcct 540
gatattcaaa ctaatatcag gagtttcacc gtgcgtaagt ccctcgtcgc tctgctgctt 600
ttcactctgg gttccacctt tgctgttcag gctactgaag aagccaaacc ctttatcacc 660
agtcaggaac tggatctgac ccaatatctg ccagcgccac cggcggatga ttcggcgcag 720
acccaagcgg agctgaaaga attgctccaa attcaggcca cccgcacgcc ggagcaggaa 780
aaagcggcga ttgctgatgc gcaagaaaac gtctggcgtt ttgccgatgt gatggggccg 840
ggctttgatg ccgagaaact gccgaaaacc gccgcgctgt ttgagcgtat tgtggcgaca 900
gaagacgtgg tggacgatca cgccaagaaa gcgtttaacc gtccgcgtcc ttatatgctg 960
gatgaacaaa ttcatccgct gctgaaaaag tctaaatccg gttcatggcc ttccggtcat 1020
tccaccatcg gttatctgat ggcgacggtg ctgggcgaaa tggtgccgga aaaacgcaat 1080
gcgctgtttg cccgtgcatc cggttatgcc gaaaaccgtc tggtggctgg tttccattac 1140
cgttctgata ccgtcatgag ccgcaccggt gccgcgctga ttgctcagaa aatggaagaa 1200
cagccagatt tcaaaaccga attcgacgcg gcgaaagcgg aactgcgtac gcagctgggc 1260
ctgaaataat tttcgtcagt ttctgccttt ccggtaaagt atggaacgta aaacttgcag 1320
aggaagggac tgatggaata cagattcaag cggatggcat caccggtcgg gttactcaca 1380
ctggcggcga aaggcgacaa gctgaccgcc attttgtggg aatgtgaaat cgacgggcgc 1440
gtgcctttgg gtgaaatgct ggaagacccg gcgtttccga ttttgctgaa aaccgaacaa 1500
cagctgaacg agtatttcgc gggtaaacgc acgtgctttg agctggacct tgatttcacc 1560
ggcaccgcat tccagaagga agtctgggcg gcgttgctgg aaattccgtt tggtgagacg 1620
cgcagctacg gcgacatcgc ccgccgcatc ggccgcccga aagcggttcg cgccgtgggc 1680
gctgccaatg gtcgtaatcc gatttctatc gtagcaccct gtcaccgggt gatcggttct 1740
tccggcaaat taaccggctt tgccggcgga ctggagaaca agttgttatt actgaggctg 1800
gaaggccgta aatcgtaagg ttttttatgg gggaataaat tgcttgatgt ccggttgtca 1860
gtcgatgcat agtcaaaaaa taagcagtaa ataaaaaaga caacatcact tacagacgga 1920
gt 1922
<210> 35
<211> 2643
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 35
tggcggcgat aggccgcccc ccaagtcggt gtgggccgac gcccacggtc ttgaccttga 60
cctggacatt gattttaaaa tcgccccctt tgcaccgatc cgtgcaaaaa aaccaaaact 120
tacataattc cccatgtttc aacatgcttt tataaagtac cattaacatc atgaacacca 180
tccctcatcc ccctgtcttt gatggtcata acgacctgtt actccgccta tggctgcatg 240
atgcagcaga tcctgctgcc ttgtttcttg atggctcact ggaaggacat ctcgatttca 300
ggcgctgtcg tctgggtggt ttcgcaggtg ggttatttgc cattttcgta ccacctgctt 360
catatatgcc acaactgaag cccgattcac ctgcggaacc tcatgacgct tttgccatta 420
ctcgggcaca gatttcactg ctggaacgcc ttgaaacgca gtccgccggg cgggcaaaaa 480
tctgccggac ggtcggtgaa attgaagcgt gtattacaca gaatgtgctg gcgatggtga 540
tgcatatcga aggggcggaa gcactcggcg atgatttctc gcggctggag cgctggtatg 600
aaaaggggct gcgcagcatc ggcccgttat ggaacttacc caaccagttt ggtaccggcg 660
ttaagggcga tttcccggga tcaccggata ccggagatgg cctgacgccc gccgggcttg 720
gattgctgca tgaatgtaac cggaaaagga ttctgttcga tgtctcgcac atgaacgaaa 780
aagccttctg gcagacggca aaattcagcg atgcgccgct ggttgccacc cattcaaatg 840
tgcacgcgtt atgtccgcaa ccgcgtaatc tgaccgataa acaactggct gccattgccg 900
aaagcaacgg cttcgttggc gttaatttcg gcacggcttt tctgcgggcg gatggaaaac 960
gcaacggcga cacccccatc accgaaattg ttaaacatct tgataacctt gttggtaaac 1020
tgggggaaga aaatgtcggt tttggttcgg atttcgacgg tatcaatgtg ccggatacgc 1080
tcggtgatgt cgccggatta ccgttgctgc ttcaggctat gtctgatgcg ggatacggcg 1140
atgcattgat cgaaaaaatc gcgtaccgca actggctgaa agtattaaag caaacctggg 1200
gtgaatagtt tttcatccga tattttgcgc taatccctgt ggcttacagg gcaatatcgg 1260
tttgagctca tcgcaacaat tttttagcca aaccagcgat atttgacaat aagccgatca 1320
cctgccgcaa taaaaggggc agtgaactta acactgtaat catcaagagg acgttattat 1380
gtggactaaa ccttcattcg aagacctgcg tttaggctta gaagtgacac tgtacatttc 1440
taaccgctaa gcctttatgc ccacggttaa ctgtgggcat cttccttccc tttcccctgg 1500
ttctcacatg cagattatcg tacttggttc cgcggcaggc ggcggcttcc cgcagtggaa 1560
ctgcaattgc agcaactgtc agggtgtgcg taatggcacc atgaaaacgt ccccccgcac 1620
gcaatcttcg attgccgtca gcgacaatgg caccgactgg gtgctgtgta acgcctcgcc 1680
ggatatttgc caccagattg ccgccacgcc ggaactgata aaacaagacg ttttacgcgg 1740
caccgccatt ggttccatta tcctgactga cagccagatt gatcactgca ccggcctgct 1800
gaatttgcgt gaaggctgtc cgcatcaggt gtggtgtacg ccggaagtcc acgaagacct 1860
caccaccggt ttcccgattt tcaccatgct ttctcactgg aatggcggcc tgcaacacca 1920
cgctatcagg ccggagaacc gcttctccgt tgccgtctgc ccgaatctta cattcactgc 1980
cattccgctg ctgagcaacg cgccaccgta ttcgaaatac cgcggcaaac cgctccccgg 2040
ccacaatatc gcgctcttta ttgaagacac aaaaaccggc acctcgctgc tgtacgcacc 2100
gggtctgggc gaaccggacg atgaactgct gaaatggctg cataaagccg attgcctgct 2160
gattgacggc acgctgtggc aggacaacga gctggcgacc accggcgtcg gccgcaatac 2220
cggcaaagac atgggccatc tggcgcttgc cgaagaacaa gggctgatcg ccctgctgtc 2280
gtcacttccg gcaaaacgca aaattctcat ccatattaat aataccaacc cgatcctcaa 2340
tgaatcctct gccgagcggc aggcgctgac gcaacaaaac atcgaagtca gccgggacgg 2400
gatgcgcatc gaactgtagg gcaaaacgac catgagcata tcgacaacac agacgtcacc 2460
gatgacgccg caagaatttg aacaggcgct gcgtgccaaa ggcgcgtttt atcacatcca 2520
tcatccctac catattgcga tgcataacgg tcaggcgacc cgcgagcaaa ttcagggctg 2580
ggtggcgaac cgtttctatt atcagaccag cattccgctg aaagacgcgg cgattatggc 2640
caa 2643
<210> 36
<211> 1038
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 36
atgaacacca tccctcatcc ccctgtcttt gatggtcata acgacctgtt actccgccta 60
tggctgcatg atgcagcaga tcctgctgcc ttgtttcttg atggctcact ggaaggacat 120
ctcgatttca ggcgctgtcg tctgggtggt ttcgcaggtg ggttatttgc cattttcgta 180
ccacctgctt catatatgcc acaactgaag cccgattcac ctgcggaacc tcatgacgct 240
tttgccatta ctcgggcaca gatttcactg ctggaacgcc ttgaaacgca gtccgccggg 300
cgggcaaaaa tctgccggac ggtcggtgaa attgaagcgt gtattacaca gaatgtgctg 360
gcgatggtga tgcatatcga aggggcggaa gcactcggcg atgatttctc gcggctggag 420
cgctggtatg aaaaggggct gcgcagcatc ggcccgttat ggaacttacc caaccagttt 480
ggtaccggcg ttaagggcga tttcccggga tcaccggata ccggagatgg cctgacgccc 540
gccgggcttg gattgctgca tgaatgtaac cggaaaagga ttctgttcga tgtctcgcac 600
atgaacgaaa aagccttctg gcagacggca aaattcagcg atgcgccgct ggttgccacc 660
cattcaaatg tgcacgcgtt atgtccgcaa ccgcgtaatc tgaccgataa acaactggct 720
gccattgccg aaagcaacgg cttcgttggc gttaatttcg gcacggcttt tctgcgggcg 780
gatggaaaac gcaacggcga cacccccatc accgaaattg ttaaacatct tgataacctt 840
gttggtaaac tgggggaaga aaatgtcggt tttggttcgg atttcgacgg tatcaatgtg 900
ccggatacgc tcggtgatgt cgccggatta ccgttgctgc ttcaggctat gtctgatgcg 960
ggatacggcg atgcattgat cgaaaaaatc gcgtaccgca actggctgaa agtattaaag 1020
caaacctggg gtgaatag 1038
<210> 37
<211> 912
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 37
atgcagatta tcgtacttgg ttccgcggca ggcggcggct tcccgcagtg gaactgcaat 60
tgcagcaact gtcagggtgt gcgtaatggc accatgaaaa cgtccccccg cacgcaatct 120
tcgattgccg tcagcgacaa tggcaccgac tgggtgctgt gtaacgcctc gccggatatt 180
tgccaccaga ttgccgccac gccggaactg ataaaacaag acgttttacg cggcaccgcc 240
attggttcca ttatcctgac tgacagccag attgatcact gcaccggcct gctgaatttg 300
cgtgaaggct gtccgcatca ggtgtggtgt acgccggaag tccacgaaga cctcaccacc 360
ggtttcccga ttttcaccat gctttctcac tggaatggcg gcctgcaaca ccacgctatc 420
aggccggaga accgcttctc cgttgccgtc tgcccgaatc ttacattcac tgccattccg 480
ctgctgagca acgcgccacc gtattcgaaa taccgcggca aaccgctccc cggccacaat 540
atcgcgctct ttattgaaga cacaaaaacc ggcacctcgc tgctgtacgc accgggtctg 600
ggcgaaccgg acgatgaact gctgaaatgg ctgcataaag ccgattgcct gctgattgac 660
ggcacgctgt ggcaggacaa cgagctggcg accaccggcg tcggccgcaa taccggcaaa 720
gacatgggcc atctggcgct tgccgaagaa caagggctga tcgccctgct gtcgtcactt 780
ccggcaaaac gcaaaattct catccatatt aataatacca acccgatcct caatgaatcc 840
tctgccgagc ggcaggcgct gacgcaacaa aacatcgaag tcagccggga cgggatgcgc 900
atcgaactgt ag 912
<210> 38
<211> 768
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 38
atgagcatat cgacaacaca gacgtcaccg atgacgccgc aagaatttga acaggcgctg 60
cgtgccaaag gcgcgtttta tcacatccat catccctacc atattgcgat gcataacggt 120
caggcgaccc gcgagcaaat tcagggctgg gtggcgaacc gtttctatta tcagaccagc 180
attccgctga aagacgcggc gattatggcc aactgcccgg atgcgcaaac ccgccgtaaa 240
tgggtgcagc gtattctcga tcacgacgga catggcggca gtgaaggcgg tatcgaagcc 300
tggctgcgtc tgggcgaagc ggtggggtta gaccgcgatg tgctgctttc agaagaaagg 360
gtgttaccgg gggtgcgttt tgcggtcgat gcctacgtca attttgcccg ccgcgccgtc 420
tggcaggaag ccgcgtgcag ctcgctcacc gaactgttcg ccccgcaaat ccatcaggcg 480
cgtctcgaca cctggccaca gcattacaca tggattgagg aagaaggtta cggttatttc 540
cgcagccgcc tgagccaggc taaccgcgac gtcgaacacg gcctgcaact ggccctggag 600
tattgcgata ccgtcgaaaa acaacagcgc atgctggaaa tcctgcaatt caaactcgat 660
attttgtgga gcatgctcga ttccatgagc atggcctacg aactgaaccg cccgccgtac 720
cacagcgtga cgcagcaggc ggtctggcat aaaggaagac tcctgtga 768
<210> 39
<211> 288
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 39
gtgatcacca ttaccgaaca ctacacgccg atgtttcgtc gcggctaccg catgcagttt 60
gagaaaacgc aggactgcca tgtgattttg tatccggaag ggatggcgaa actcaacgac 120
agtgcgacct tcattttaca actggtggat ggcgggcgga caattgccaa tattattgat 180
gaactgaatg cccgctttcc gcaggccggt ggcgtgaatg acgacgtcaa agacttcttt 240
gctcaggccc atgcccaaaa gtggattatc ttccgtgaac ctgcttaa 288
<210> 40
<211> 1134
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 40
gtgaacctgc ttaaacctgc ggtcaaaccg ccgctgtggt tgctggccga actgacctac 60
cgctgtccgc tgcaatgccc gtattgctcg aacccgctcg atttcgctaa gcaggaaaaa 120
gagctgacca ccgcgcagtg gatcaaagta ttcgaagaag cgcgggaaat gggcgcggtg 180
caaatcggtt tctccggcgg cgaaccgctg gtgcgtaaag atttgccgga gcttatccgt 240
gccgcgcggg atctcggttt ttacaccaac ctgatcacct ccggcatcgg gctgaccgaa 300
aagaaaattg atgcttttgc tgaggccgga ctggaccata tccagatcag ttttcaggcc 360
agcgatgaaa cgctgaacgc cgcgctggcc ggtaacgcca aagcgttccg gcaaaaactg 420
gtgatggcca aagcggtaaa ggcccacggt tatccgatgg tgctgaactt tgtgctgcac 480
cgtcataaca tcgatcagat cgacaagatt atcgacctca gtatcgaact ggaagccgat 540
gacgtcgagc tggcgacctg tcagttttac ggctgggcac agctcaaccg cgaaggtttg 600
ctgccgaccc gtgagcagat cgcccgtgcc gaacaggtgg tgcatcagta ccgcgaaaaa 660
atggccggaa ccggtaatct ggctaacctg ttgtttgtga cgccggatta ttacgaagag 720
cgtccgaaag gttgcatggg cggctggggg gcgattttcc tcagtgtgac gccggaaggc 780
atggcgctgc cgtgccacag cgcgcgccag ttgccggtgg aattcccgtc ggtgctggaa 840
aatacgttgc aggaaatctg gtacgactcc ttcggcttta acaaataccg cggcttcgac 900
tggatgccgg aaccctgccg ctcctgttct gaaaaagaga aagactttgg cggctgccgc 960
tgtcaggcat ttatgcttac cggcaatgcc gacaacgccg atccggtatg ctccaaatct 1020
gagcatcacg gcaaaatcct cgccgcgcgc gaacaggcca actgcaccaa cattcagatc 1080
aaccagttgc agttccgcaa ccgcgtgaac tctcagctga ttttcaaagg ctga 1134
<210> 41
<211> 5334
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4721)..(4721)
<223> a、 c、t、g、未知或其他
<400> 41
atcatcttct acaaaaacga ttttattcat tggcttgctg ctttaagaaa tccggtgatt 60
agcatagcgt gacccgcagg acgacgctat cgtgctagcg taatagaaca tgtcagtttc 120
cgttacgcaa agcaccggaa gcgactggca aagtgtcagt gaattatgcc attatatagc 180
tgaatatctt cggcgttata cattgattaa ataattgatt gaccctgacc aggaagagga 240
agaggggatg aatgaaaacc gcctggtacc cgatgcgcgc agtcaacaag cctcctttga 300
ctacatggaa tacttgtccg catcctgcaa aaagaaatgg agttttgttg acgctattta 360
tggcgtgatg ccgttctttg gcatggttct gaaatcccgt tcgataaaag aaaaatcccg 420
gcaggaagcg ttgcgcgcac tggccttaca ggtagtttcc acccaggtca gcgacgagac 480
caatattgtc cggctgattg aactggcaga gcagcaaaat atgtacaaca ttgatatcaa 540
cctgccgtac tcgctgaccg aagaacagct cactgcaata aaagtggaat gcaaacatct 600
ggtgcaatta agccagaata atgatcatct gttagtacag attatgcaga tgccttcccg 660
gcactgattt ctcggtgatg cattcaaaat aaaggccgct ttcgcggcct ttatcatttc 720
agtcgtttgc cgtttatttc ttcagttcgg cgcgtaagtc tttcacgtct gaggcagaaa 780
ccggcgcggc ggcatttccc cagctgttac ggatatacgt cagcacgtta gccacatcgg 840
catcgctcat attggcatca aacgatggca tcgacggcgc ggtaggtttg ctgtcggtag 900
ccacagggcg gctgcccgtc agcaccacgc ggataagcga cgtggcgttg gtctggttga 960
tgagcggtga atctgccagc cgtgggaaca gaccttcctg acccataccg cctggcgtat 1020
gacatgcgga acaccggtca gcgtagatat tcttcccggc aatcattgcc ttatcgtcag 1080
ctttcactgg cgcaggggcg ttattgccgc tgtcatgacc gctgtctttc agatagaccg 1140
ccacggcttc aaggtcggca tccgtccagt gccgggatga gttcgtcact tcctccgcca 1200
tcggaccgga agcaatatcg aaacggttag aaccggtttt cagatactgc atcagatctt 1260
cctgcgtcca gttaccgaca ccagtgtgct tgttgctggt gatgtccggt gcgacccagt 1320
tttctatcac cgccccttgc aggaactcgc tgtccttatc gccgccgagc atatttttcg 1380
gtgtatgaca ggtaccgcag tgtcccagac cttcaacgat gtaggcgccg cggttccatt 1440
gcgccgattt atccatctgc ggtttgaatt cgcctttgct gaagttcagc cagttccagc 1500
ccatcagact ggtacgcacg ttgaacggga acggcaactg gttagtttcg atttcgttgt 1560
gcaccggttg cagggtctgc aaatacgccc agatcgccgc gttatcttcg cgggtcactt 1620
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gcgtaatgtt tgcaccgact aaacggccga acggggtttc aattggcaca ccgccggcaa 1800
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tgatgctcat ggccagcaaa ccgagtgaga atgaggttaa ctttttcatg cgatcatctc 1980
tcccggtttt ttcagatagt aatgacggat cgcatgcgcg gctttgaatg ccagcgcacc 2040
cacggtaccg gtcgggttgt aacccggatt ttgcgggaag gcagacgcgc cgaccacgaa 2100
cagattaggc acgtcccaga cttgcagatg tttgttcact gagctggtgg acggatccgc 2160
gcccatcaca aaaccgccga cgacgtggga tgactggtac ggcgtaccgt tccagtgacc 2220
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cagcgggcga cccagacggt ctttgtagtt cggatccagc gacagatagt tggttttggt 2400
ggtgtagctg ctggcctcac aaccgatcga catcgagctg aggtagttgg cgaccgtcgc 2460
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gtcaaagttg tcattgttga aatcgtcaat gcccatcccg accgcacctg cgccgatgaa 2640
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cagtgccggt aatacggtag tgatagcgct ggccttggaa tagttcgcac agccgaagtt 3000
ggtgcagaac ccgcaaaatg tacatggccc cattttcacg ccgagcggat tggtgtaagg 3060
ctcggaaatc agggaagagg gtacagggaa cgctttataa cccatattgc gcgcggcttg 3120
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ggaaacgccg gccagacgct cgaaagaggc gtaatgcggt tccatttctt cccagtcggt 3300
gccccagtct tgcagcacca actcttccgg gatggcatta gcgccgtaac gttcggtcag 3360
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cgggtcagca aagaaacctt ccattgtgtt cttcagtgcg atggcgaaga acaatttaga 3960
atcgatccct tcaagggcaa tttttccgct ctcaagacct gacaggattt gatcctgctg 4020
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cgtgcctttg agcgtcaccg cgttggcggc tttggcggca cccagtactg cggaggcggc 4440
cgtgaacgag agaatctgtc tgcgggtcac gccgggcaag gtttttttgc tcatgtatgt 4500
tccctgtttg tatacatcac tttaaggtcc ggacgcgctc tgcaaaggca gtcgggtggc 4560
gtcgggataa tcgttaacct gctaaggata aatgaaaaca gactgtaaag ataaatggtt 4620
cgtttgttaa aaatgttatt aaatgtgtgc aattgatatc tttgatgtaa ttttaggtga 4680
tatttttgtg atgtggtgac atgttatcca tgtattcatc ntggaaatga attttcatga 4740
tttcacctaa tacaacgatg tatgtggccg ttcgtggcat gcaggttgaa ttatgctgtc 4800
tgtacgttaa gatcaaacct tactcataaa atgtgcaagg tatgactgaa gtcacagatt 4860
ttttttctga tttattgaag cgatttgcag gaaatccctg cgcctctttg cttattgccg 4920
ggggagctgc cttctatgct gtcagcgcca gtgcgctgac ggcagaaccc accgaatatg 4980
gcgtttccgg ttatcacctc agcggttttc tgcctgccag tgacgaaagt tccgttttta 5040
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gcaccaccac cacagacagc gatgatccct tacgtgtgca ggcggagacg ctggcactca 5220
gtcaggcggc gaaactggtg caaaaagaaa ccagcagttt gctttcgccg ctgggtaccg 5280
tcagcacctc gctggatatg agcggccgta atcttgacgg cagctccggg cggc 5334
<210> 42
<211> 500
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 42
tgaatatcac tgactcacaa gctacctatg tcgaagaatt aactaaaaaa ctgcaagatg 60
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ttgacaaact gctggcggaa atccgcagca gaagtcttca tcaactggag gaataaagta 300
ttaaaggcgg aaaacgagtt caaccggcgc gtcctaatcg cattaacaaa gagattcgcg 360
cgcaagaagt tcgcctcacc ggcgtcgatg gcgagcagat tggtattgtc agtctgaatg 420
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agccgccagt ttgtcgaatc 500
<210> 43
<211> 170
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 43
tacagtagcg cctctcaaaa atagataaac ggctcatgta cgtgggccgt ttattttttc 60
tacccataat cgggaaccgg tgttataatg ccgcgccctc atattgtggg gatttcttaa 120
cgacctatcc tgggtcctaa agttgtagtt gacattagcg gagcactaac 170
<210> 44
<211> 142
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 44
aatttttttt cacaaagcgt agcgttattg aatcgcacat tttaaactgt tggccgctgt 60
ggaagcgaat attggtgaaa ggtgcggttt taaggccttt ttctttgact ctctgtcgtt 120
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<210> 45
<211> 293
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 45
ttaaaaacgt gaccacgagc attaatgaac gctgcgaaat gtggcgttta tttattcaaa 60
aagtatcttc tttcataaaa agtgctaaat gcagtagccg caaaattggg ataagtccca 120
tggaatacgg ctgttttcgc tgcaattttt aactttttcg taaaaaaaga tgcttctttg 180
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gtgtaatact tgtaacgcta catggagatt aacttaatct agagggtttt ata 293
<210> 46
<211> 1786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 46
agaggtttta cgacggtctc atcgctcggg gaaagttaaa gaaagttgcg ctaacagcat 60
gcatccggaa actggtgaca atcctgaatg cgatggtgcg agatggccgt gaatgggcag 120
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caaaatgaac attttgactg cgtagtgagt cctaatatta ccatgttacc ggtatcatga 780
taccggtaac aaatggagat gtgactaata tcacaaagga atgcactgct gttttagcgg 840
tcgcggtctg tacccgtagc actgttaatt cctacaacat cttgaaaatt aaaacaatgc 900
ttcacccggt ttttagccat acccgggtga cagcgtgagg ggaagaatcg acaaattgtt 960
agcataaaaa ggcgagccag acggctcgcc tttttcgttt cttctgcctg ctaaatcttc 1020
agatacgccc tgatcccatc gaggaacatc tgcgttgaga gcatgaccag aatcagaccc 1080
atcaggcgtt cgagggcgct gacgcctttg tcgccgagca ggcgcagaaa caggtttgag 1140
agcagaagga tcgccatcga catgccccag gcgataaaca gcgccagcgt gagatgactc 1200
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atgcctgtta taagttgcgc tgctattaaa agctgcacta ttgattaaat tcacttgcca 1680
cttctactac attttgtaag gtggtagacc agcgcgttaa cggggcacag tgcatcaaaa 1740
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<210> 47
<211> 4740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 47
tgggaagccc cggagagaaa gagccaaatg ctcattgatg atttttgaaa gttcgcgttg 60
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gaatcccaat aaaaaaagcc tgaatttctt caggcccgat ctttgccatc ctgatgacag 240
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gttaaagccg acttgagaaa tgagaagatt ggctttaaaa ttcgcgaaca cacgctacgc 840
cgtgttcctt atatgttagt ttgtggcgat aaagaggtcg aagcaggcaa agttgctgtt 900
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ctggcggaaa tccgcagcag aagtcttcat caactggagg aataaagtat taaaggcgga 1020
aaacgagttc aaccggcgcg tcctaatcgc attaacaaag agattcgcgc gcaagaagtt 1080
cgcctcaccg gcgtcgatgg cgagcagatt ggtattgtca gtctgaatga agctcttgaa 1140
aaagctgagg aagcgggcgt cgatttagta gaaatcagtc cgaatgccga gccgccagtt 1200
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ggctggcagg tgacagggtc acgttttgtc catcgtcagc ctgttccggc gcaatcgggt 1680
gatatacagg ccacgtcgcc ggaaagcaac gactggcgct attacggcag gacagaagcc 1740
ggacaacgtt attcgccgct gacacagatt acacccgcta atgtcagtca gcttaaaccc 1800
gcctgggaat ttcacaccgg cgatgtgatg agaaagggtg aggataaaga cggacgggaa 1860
tttaatttcg aagtcacacc ggtcaaagtc gggaactcgc tgtttatctg tacgccgcac 1920
cgcgaagtga ttgcgctaaa cgccaccacc ggcgcgcagc gatggaaatt cgatcctaaa 1980
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accgaccata tgggcgacgt gccgccgggc ttccacttca ttacctcgca gccgatggtg 2220
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tccggcgtcg tccgggcttt cgatgtgaac accggccagc ttgcatgggc gtgggatatg 2340
ggccgggatc cgcaaaatgc gccgctcaaa ccgggtgaag tgtatacccg gggcacgcca 2400
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tcgctcgtcg cgctggatat tcacaccggc gaggaacgct ggcacttcca gactgtgcat 2580
catgatgtct gggactttga cttgccgatc ggaccgacac tggtggattt gccgtcaccg 2640
gaggggataa ccgtgcctgc gctggtgcag accaccaaaa tgggacagct tttcctgctc 2700
gaccggcgta ccggcaaacc gctggcgcag gtaaacgaaa aaccggtgaa tacctctccc 2760
tctttgccgg gcgaacatct gtcgccaacg cagccggatt ctgtcggcat gcccagtctc 2820
tctccgccag atctgaaaga aaccgacgcg tggggcgcga caccgattga tcagttgtat 2880
tgccgcatcc agttcaaaag tgcccgctat caggggcagt tcaccccgcc agcggaaggt 2940
aaatccattg cttatccggc ctttgacggc gtgatggact ggtacggcgc ttcggtggat 3000
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gcattaccgg ccagataggg ttggcactca aacgcaggat attcagaacc gtctgatgat 3660
gcccacaggc ggcgcagcat ggtctatttt taagatccct tcttttttaa ataaggagag 3720
tttatgaaca acaaaacaat cccgacatcc ctgaatgaac ctcatgttga tgcgtatccg 3780
accccgccgt ttgagcatca gaaacagcca ttcccggggc tggccagcaa aatgaacccg 3840
gtacccgatc acggcgagaa aacctacaaa ggcagtgccc ggctggaagg ccgtaaggcg 3900
ctgattaccg gcggtgactc cggtattggc cgtgcggtgg cgattgcctt cgcccgtgaa 3960
ggtgcacagg tcgccatcaa ttatctgccg gacgaagagg ccgatgccaa agaagtgatc 4020
gacctgctgt gggccgaagg gcggaaagtg attgccattc cgggggatat tcgcgacgag 4080
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gtcaataacg ccggtcgtca gcagttctgt gattcgatta aggatctgac caccgaagcc 4200
ttcgacgcca cgttcaaaac taacgtgtac gccatgttct ggataaccaa agcggcgctg 4260
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agtgataatt tgctcgatta ctcctccacc aaggcctcga tcatggcctt caccaaaggg 4380
ctggccaaac agctggcggg ggacggaatt cgggtgaacg gtgttgcgcc ggggccgtac 4440
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aggcagatat ccggcgtttt ttgccgacat cggcacgtca taaataatta cgttgctaat 4740
<210> 48
<211> 4382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 48
tgggaagccc cggagagaaa gagccaaatg ctcattgatg atttttgaaa gttcgcgttg 60
ttcgtccggc aatatggcgt tgaacactgc gtgaacctac cctgttcacg cataatgata 120
tgtttattta cttgatattt ccgctcttta ttactttcga aagtgatatt tccggcgcgg 180
gaatcccaat aaaaaaagcc tgaatttctt caggcccgat ctttgccatc ctgatgacag 240
attactggaa gtaaatatcg ccgttttcgg ctttgaggat cttgccgtcg gtgtcagtga 300
tcagtgcgta gctgccgccg atataagtcc agtggctacc cgcatccggt gccggcaggt 360
gacgttcctg ccagccgacg atctcatacg gcttggtacg gtacagcgca gggacctgat 420
cgccgatgga atacaatttg gaatcatcgt agaacgattt gatctcgtgt gagtttgacg 480
cggcaaacgc cgtgttggcc aggggtaaca acgatgaaac aaccagggct gataacataa 540
caattttaga atgacgcata gattatcccg ttaaaaccat caacttaatg cctgcctcgg 600
tgatatgccg ccagtccgtt gtatgagcag taaagccgaa gcctgtgctt tttctgtagg 660
acaggataat aacgagaaag tgagtgcagg ctgggagatt tttttgtgta attttttttc 720
acaaagcgta gcgttattga atcgcacatt ttaaactgtt ggccgctgtg gaagcgaata 780
ttggtgaaag gtgcggtttt aaggcctttt tctttgactc tctgtcgtta caaagttaat 840
atgcgcgccc tatgcgcaat gaacggtttt ttagctggtc gttcatgacc gggcttgtca 900
cggctgtcat cgggctggct tatctggtgc tgggcgtctg gctggcggcc ctcggcggct 960
caccctggta tgtgcttttt ggcagcggat atctgctcag cggcattttt atcgcgcgcc 1020
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tatgggaagt cggactggat ggctggcaac tgatgccgcg tttgtttgtg atggcgttat 1140
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at 4382
<210> 49
<211> 4334
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 49
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 来源
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<210> 52
<211> 3073
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 52
cgcgggcgtt tcaggcgctg catggcaggg atctgcgcat tgtgcgccag actgcgctcg 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 53
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<220>
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<210> 56
<211> 3344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 56
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<211> 3148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 57
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<220>
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<210> 61
<211> 3976
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 61
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<220>
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cgccgatgga atacaatttg gaatcatcgt agaacgattt gatctcgtgt gagtttgacg 480
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caattttaga atgacgcata gattatcccg ttaaaaccat caacttaatg cctgcctcgg 600
tgatatgccg ccagtccgtt gtatgagcag taaagccgaa gcctgtgctt tttctgtagg 660
acaggataat aacgagaaag tgagtgcagg ctgggagatt tttttgtgtt acagtagcgc 720
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aaggcctcga tcatggcctt caccaaaggg ctggccaaac agctggcggg ggacggaatt 4080
cgggtgaacg gtgttgcgcc ggggccgtac tggacgccgt tgcaaatttc cggcggacag 4140
cctcaggaaa aaatcgaatc ctttggtcag caggcaccgc tgaaacgtcc gggacagcca 4200
gcggaaatcg ccccgctgta cgtgacgctg gcctcaaatg aaaacagtta tgcctcaggg 4260
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<210> 65
<211> 4533
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 65
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gacgttcctg ccagccgacg atctcatacg gcttggtacg gtacagcgca gggacctgat 420
cgccgatgga atacaatttg gaatcatcgt agaacgattt gatctcgtgt gagtttgacg 480
cggcaaacgc cgtgttggcc aggggtaaca acgatgaaac aaccagggct gataacataa 540
caattttaga atgacgcata gattatcccg ttaaaaccat caacttaatg cctgcctcgg 600
tgatatgccg ccagtccgtt gtatgagcag taaagccgaa gcctgtgctt tttctgtagg 660
acaggataat aacgagaaag tgagtgcagg ctgggagatt tttttgtgtt taaaaacgtg 720
accacgagca ttaatgaacg ctgcgaaatg tggcgtttat ttattcaaaa agtatcttct 780
ttcataaaaa gtgctaaatg cagtagccgc aaaattggga taagtcccat ggaatacggc 840
tgttttcgct gcaattttta actttttcgt aaaaaaagat gcttctttga gcgaacgatc 900
aaaatatagc gcttaccgac aaaaaattat tctcattaga aaatagtttg tgtaatactt 960
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tttagctggt cgttcatgac cgggcttgtc acggctgtca tcgggctggc ttatctggtg 1080
ctgggcgtct ggctggcggc cctcggcggc tcaccctggt atgtgctttt tggcagcgga 1140
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ctgatgccgc gtttgtttgt gatggcgtta ttaggcgtct ggtgcagcct gccgttgatc 1320
acccgtcagg tgatggcaac gcggggcaat caccgcaccg gtacgttcgc cgggctggtg 1380
tatgtggtgg cgatcgtggg tattttttac agcggctggc aggtgacagg gtcacgtttt 1440
gtccatcgtc agcctgttcc ggcgcaatcg ggtgatatac aggccacgtc gccggaaagc 1500
aacgactggc gctattacgg caggacagaa gccggacaac gttattcgcc gctgacacag 1560
attacacccg ctaatgtcag tcagcttaaa cccgcctggg aatttcacac cggcgatgtg 1620
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accggcgcgc agcgatggaa attcgatcct aaatctgaca cctcggccaa tgagtatctg 1800
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ggcgaggaac gctggcactt ccagactgtg catcatgatg tctgggactt tgacttgccg 2400
atcggaccga cactggtgga tttgccgtca ccggagggga taaccgtgcc tgcgctggtg 2460
cagaccacca aaatgggaca gcttttcctg ctcgaccggc gtaccggcaa accgctggcg 2520
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gggcaggtct ggtgttctga tggcggtacc ggcacggtct gattaccggt cggaaacgcc 4440
aaagcccgtc atattgacgg gcttttttca tgcaggcaga tatccggcgt tttttgccga 4500
catcggcacg tcataaataa ttacgttgct aat 4533
<210> 66
<211> 6053
<212> DNA
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 66
cagttgcagt ttcagcggca ccgtttcgcc cggctgtaat gaccacggcg gcgtggccag 60
atacactgat aaggttttac gctgtttgaa ttccatcacc ggcatattat tgcggtcaac 120
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ggtttctttg ctgacccgat ttacggcggt aaccgcaata tggtgtcgtg gaaaatgctg 2220
ggcttccccg gtgcacgtta cgactaccgc gactatatcg gcaagcacaa tcagaaactc 2280
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ggcccgacat tgtttgctga agcggcgcgc aatatgggtt acaaagcgtt cccggtgccc 3000
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ggcgggtttg tgatgggtgc ggatccgtcc acgagttcgg tgaataaaca tctgcaggtc 3960
tgggatgtgc ctaatctgtt tgtggtcggc gcgtctgcct ttccgcaaaa cccgggctat 4020
aacccgaccg gaaccgtcgg cgcactggcg tttaaagccg cccatgcaat ccgtaactac 4080
tatctgaaaa aaccgggaga gatgatcgca tgaaaaagtt aacgtcattc tcactcggtt 4140
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 69
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cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc 3540
ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt 3600
tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc 3660
tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt 3720
gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa 3780
caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact 3840
ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct 3900
aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata gtttctgttg 3960
catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata tctcatttca 4020
ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcgac agcccatgca 4080
atccgtaact actatctgaa aaaaccggga gagatgatcg catgaaaaag ttaacgtcat 4140
tctcactcgg tttagtggct ttgagcatca gcggactgag ccacgcggcg ggcgatggct 4200
ctttcgaaca ggttgaacgg gggcgttacc tggcgaccct gggcgactgc gccgcctgtc 4260
ataccgcctc cacgccggac gccaaacctt ttgccggcgg ggtgccgatt gaaacgccat 4320
ttggccgttt agtcggtgca aacattacac cggatacgca aaccggtatc ggcagatgga 4380
gtttcgatga tttccagcgc gcaatgtcgg agggcatcgg tcacggcgga aaacgtcttt 4440
acggcgcgat gccattcacg gcgtacacga aagtgacacg cgaagataac gccgccatct 4500
gggcgtatct gcaaactttg caaccggtgc ataatgaaat tgaaaccaac cagttgccct 4560
tcccgttcaa cgtgcgtacc agtctgatgg gctggaactg gctgaacttc aacaaaggcg 4620
aatttaaacc gcagatggat aagtcggcgc aatggaatcg cggtgcttac atcgttgaag 4680
gtctgggaca ctgcggtacc tgtcatacgc cgaagaacct gctcggcggc gacaaagaca 4740
gtgaattcct gcaagggacc gtgatagaag gctgggtcgc gccggatatc accagcaaca 4800
aacacaccgg tgtcggtaac tggacgcagg aagatctgat gcaatatctg aaaaccggtt 4860
ctaaccgttt cgatattgct tccggtccga tggcggaaga agtcaccaat tcgtcccgtc 4920
actggacgga tgatgatctt aaggccgtgg cggtttatct gaaagacagc ggacatgaca 4980
gcggtaacaa cgcccctgag ccagtaaaag ctgacgataa ggcgatgata gctggcaaga 5040
atatttatgc tgatcgttgt tctgcctgcc ataccccaac cggtatgggc caggaaggtt 5100
tgttccctcg tctggccgat tcaccactta tcaaccagac cgacg 5145
<210> 70
<211> 5218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (42)..(42)
<223> a、 c、t、g、未知或其他
<400> 70
cacaacaact aataacagga actttccgtg cgcaattata tngatctaaa ttcagccagt 60
gaagacagac aatgatcttt gataactgat gctaatttaa tttgagtttt ggtaaatagg 120
aaatttataa ctatctgttt taaaaggatt taaaatctat tctatgatta tttaaaacca 180
ccacattagc caccgcacag ttcgcatgga atttattcat ttattttaga tgtagcagtg 240
atattataaa tttgtacccc aaaataataa taattaaccc aaacttaaca tcaggcatgt 300
gagagtcgta attctatgct ccttcaaaaa aaaacaaccc gtcgcaagtt tttacttggg 360
tcgctgatgg ctctgccggt cggcaccata atgatgaaag gattgtcggc ggcacaagct 420
gcggaaatgg ctgccccgga tttactcgat tataaaccca tatttttcag taccgatgag 480
tggcagttta ttatggccgc tgctgaccgc ctgatccctg ctggtggcaa aggtaaagca 540
ccgggcgcac tcgaaaccaa cgtgccgatt tttatcgacc agcaaatgca cggtgatttt 600
ggtgatgaaa tttacatgca gggcccgttc aatgtgcatg ctccggccac aatggggtat 660
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aaagtgctcc cctcgtcccg acacttccag atcgccatag cgcacagcgc ctcgagcggt 1140
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gttagatgca ctaagcacat aattgctcac agccaaacta tcaggtcaag tctgctttta 2220
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attgtccttg ttcaaggatg ctgtctttga caacagatgt tttcttgcct ttgatgttca 2340
gcaggaagct tggcgcaaac gttgattgtt tgtctgcgta gaatcctctg tttgtcatat 2400
agcttgtaat cacgacattg tttcctttcg cttgaggtac agcgaagtgt gagtaagtaa 2460
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tcatcacttt tttcagtgtg taatcatcgt ttagctcaat cataccgaga gcgccgtttg 2760
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gccagctgtc ccaaacgtcc aggccttttg cagaagagat atttttaatt gtggacgaat 3480
cgaattcagg aacttgatat ttttcatttt tttgctgttc agggatttgc agcatatcat 3540
ggcgtgtaat atgggaaatg ccgtatgttt ccttatatgg cttttggttc gtttctttcg 3600
caaacgcttg agttgcgcct cctgccagca gtgcggtagt aaaggttaat actgttgctt 3660
gttttgcaaa ctttttgatg ttcatcgttc atgtctcctt ttttatgtac tgtgttagcg 3720
gtctgcttct tccagccctc ctgtttgaag atggcaagtt agttacgcac aataaaaaaa 3780
gacctaaaat atgtaagggg tgacgccaaa gtatacactt tgccctttac acattttagg 3840
tcttgcctgc tttatcagta acaaacccgc gcgatttact tttcgacctc attctattag 3900
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ggatttgcag actacgggcc taaagaacta aaaaatctat ctgtttcttt tcattctctg 4020
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ccgttcagcc agcgctgggg catgcgcttc tggaactggg cgttcgcgtc tgacaaacca 4680
ttccagccaa tcggcggtgc gtccgcacag gttaaccgcg gcgcttatct ggtggaaagc 4740
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<210> 71
<211> 5236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 71
aaattccttc acaaatggcg attgccggtt ttcatggaca caacatggga caaacgatgg 60
agccaccgct cgccagcgtc ctgacgccgc gtgaaaaaat ggggcaaatc tccgccgaac 120
gcctgctggc gagacttcgc ggcgaagaag tggtgccgag aatggtggat gtagggttta 180
cgatttctgc gggcggaagt atctgatttc tttgcgcctt cccctctcac gaggggatgg 240
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ttcaatattg gcgcggggat gaagatcatc gccgtcgata aatttcgcgt taatttcacg 780
ggccagtgcc gcgccgacgg tggatttacc gctgcctgac acgcccatca gaatgatgct 840
ttgtcctgcc ataagtatga tctctatccc aaaatgaaca ttttgactgc gtagtgagtc 900
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ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct ttgttaaata aagattcttc 2880
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<210> 72
<211> 339
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 72
Met Ala Ile Phe Asp Gly His Asn Asp Leu Leu Leu Asn Leu Trp Leu
1 5 10 15
His His Arg Glu Asp Pro Val Ser Ala Phe Phe Val Gly Ile Glu Asn
20 25 30
Gly His Leu Asp Tyr Pro Arg Ile Arg Gln Gly Gly Leu Ala Gly Gly
35 40 45
Leu Phe Ala Leu Phe Val Pro Pro Gln Glu Tyr Ile Ala Arg Val Ala
50 55 60
Pro Gln Tyr Ala Ser Glu Ala Trp Asp Pro Leu Ala Ile Leu Trp Gln
65 70 75 80
Gln Leu Ala Ile Leu Lys Ala Ile Cys Ala His Asp Ala Ser Arg Ala
85 90 95
Arg Leu Cys Leu Ser Ala Ala Asp Ile Glu Arg Cys Arg Gln Asp Asn
100 105 110
Ala Leu Ala Met Val Ala His Ile Glu Gly Ala Gly Gly Phe Asp Ala
115 120 125
Gln Gly Glu Asp Leu Gln Ala Phe Tyr Arg Ala Gly Val Arg Ser Ile
130 135 140
Gly Pro Phe Trp Asn Ile Ala Asn Arg Phe Gly Cys Gly Val Thr Gly
145 150 155 160
Ala Phe Pro Gly Ser Pro Asp Ser Gly Pro Gly Leu Thr Arg Glu Gly
165 170 175
Ile Ala Leu Ile Ala Gln Ala Asn Ala Leu Lys Met Gln Ile Asp Val
180 185 190
Ser His Met Asn Glu Gln Ala Phe Trp Asp Thr Ala His His Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Leu Val Ala Thr His Ser Asn Ala His Ala Leu Cys Pro Gln
210 215 220
Pro Arg Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Arg Ala Ile Arg Asp Ser Gly
225 230 235 240
Gly Val Val Gly Val Asn Phe Gly Asn Ala Phe Leu Arg Ala Asp Gly
245 250 255
Arg Arg Asp Ser Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ile Val Arg His Ile Asp
260 265 270
Tyr Leu Ile Asn Ile Met Gly Glu Asp His Val Ala Leu Gly Ser Asp
275 280 285
Phe Asp Gly Ile Thr Leu Pro Asp Glu Leu Gly Asp Val Ala Gly Leu
290 295 300
Pro Arg Leu Ile Asn Ala Leu Arg Asp Asn Gly Tyr Asp Gln Leu Val
305 310 315 320
Leu Asp Lys Leu Leu Trp Asn Asn Trp Leu Arg Val Leu Lys Lys Val
325 330 335
Trp Gln Gln
<210> 73
<211> 308
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 73
Met Phe Ile Lys Val Leu Gly Ser Ala Ala Gly Gly Gly Phe Pro Gln
1 5 10 15
Trp Asn Cys Asn Cys Ala Asn Cys Gln Gly Leu Arg Asn Gly Thr Ile
20 25 30
Gln Ala Ser Ala Arg Thr Gln Ser Ser Ile Ile Val Ser Asp Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Trp Val Leu Cys Asn Ala Ser Pro Asp Ile Ser Gln Gln Ile
50 55 60
Ala His Thr Pro Glu Leu Asn Lys Pro Gly Val Leu Arg Gly Thr Ser
65 70 75 80
Ile Gly Gly Ile Ile Leu Thr Asp Ser Gln Ile Asp His Thr Thr Gly
85 90 95
Leu Leu Ser Leu Arg Glu Gly Cys Pro His Gln Val Trp Cys Thr Pro
100 105 110
Glu Val His Gln Asp Leu Ser Thr Gly Phe Pro Val Phe Thr Met Leu
115 120 125
Arg His Trp Asn Gly Gly Leu Val His His Pro Ile Ala Pro Gln Gln
130 135 140
Pro Phe Thr Val Asp Ala Cys Pro Asp Leu Gln Phe Thr Ala Val Pro
145 150 155 160
Ile Ala Ser Asn Ala Pro Pro Tyr Ser Pro Tyr Arg Asp Arg Pro Leu
165 170 175
Pro Gly His Asn Val Ala Leu Phe Ile Glu Asn Arg Arg Asn Gly Gln
180 185 190
Thr Leu Phe Tyr Ala Pro Gly Leu Gly Glu Pro Asp Glu Ala Leu Leu
195 200 205
Pro Trp Leu Gln Lys Ala Asp Cys Leu Leu Ile Asp Gly Thr Val Trp
210 215 220
Gln Asp Asp Glu Leu Gln Ala Ala Gly Val Gly Arg Asn Thr Gly Arg
225 230 235 240
Asp Met Gly His Leu Ala Leu Ser Asp Glu His Gly Met Met Ala Leu
245 250 255
Leu Ala Ser Leu Pro Ala Lys Arg Lys Ile Leu Ile His Ile Asn Asn
260 265 270
Thr Asn Pro Ile Leu Asn Glu Gln Ser Pro Gln Arg Gln Ala Leu Thr
275 280 285
Gln Gln Gly Ile Glu Val Ser Trp Asp Gly Met Ala Ile Thr Leu Gln
290 295 300
Asp Thr Ala Cys
305
<210> 74
<211> 251
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 74
Met Leu Ile Thr Asp Thr Leu Ser Pro Gln Ala Phe Ala Glu Ala Leu
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Arg Ala Lys Gly Ala Phe Tyr His Ile His His Pro Tyr His Ile Ala
20 25 30
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Asn Arg Phe Tyr Tyr Gln Thr Thr Ile Pro Leu Lys Asp Ala Ala Ile
50 55 60
Met Ala Asn Cys Pro Asp Ala Gln Thr Arg Arg Lys Trp Val Gln Arg
65 70 75 80
Ile Leu Asp His Asp Gly Ser His Gly Glu Asp Gly Gly Ile Glu Ala
85 90 95
Trp Leu Arg Leu Gly Glu Ala Val Gly Leu Ser Arg Asp Asp Leu Leu
100 105 110
Ser Glu Arg His Val Leu Pro Gly Val Arg Phe Ala Val Asp Ala Tyr
115 120 125
Leu Asn Phe Ala Arg Arg Ala Cys Trp Gln Glu Ala Ala Cys Ser Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Leu Phe Ala Pro Gln Ile His Gln Ser Arg Leu Asp Ser
145 150 155 160
Trp Pro Gln His Tyr Pro Trp Ile Lys Glu Glu Gly Tyr Phe Tyr Phe
165 170 175
Arg Ser Arg Leu Ser Gln Ala Asn Arg Asp Val Glu His Gly Leu Ala
180 185 190
Leu Ala Lys Thr Tyr Cys Asp Ser Ala Glu Lys Gln Asn Arg Met Leu
195 200 205
Glu Ile Leu Gln Phe Lys Leu Asp Ile Leu Trp Ser Met Leu Asp Ala
210 215 220
Met Thr Met Ala Tyr Ala Leu Gln Arg Pro Pro Tyr His Thr Val Thr
225 230 235 240
Asp Lys Ala Ala Trp His Thr Thr Arg Leu Val
245 250
<210> 75
<211> 92
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 75
Met Gln Lys Thr Ser Ile Val Ala Phe Arg Arg Gly Tyr Arg Leu Gln
1 5 10 15
Trp Glu Ala Ala Gln Glu Ser His Val Ile Leu Tyr Pro Glu Gly Met
20 25 30
Ala Lys Leu Asn Glu Thr Ala Ala Ala Ile Leu Glu Leu Val Asp Gly
35 40 45
Arg Arg Asp Val Ala Ala Ile Ile Ala Met Leu Asn Glu Arg Phe Pro
50 55 60
Glu Ala Gly Gly Val Asp Asp Asp Val Val Glu Phe Leu Gln Ile Ala
65 70 75 80
Cys Gln Gln Lys Trp Ile Thr Cys Arg Glu Pro Glu
85 90
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<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 76
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1 5 10 15
Glu Leu Thr Tyr Arg Cys Pro Leu Gln Cys Pro Tyr Cys Ser Asn Pro
20 25 30
Leu Asp Phe Ala Arg Gln Glu Lys Glu Leu Thr Thr Glu Gln Trp Ile
35 40 45
Glu Val Phe Arg Gln Ala Arg Ala Met Gly Ser Val Gln Leu Gly Phe
50 55 60
Ser Gly Gly Glu Pro Leu Thr Arg Lys Asp Leu Pro Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Ala Ala Arg Asp Leu Gly Phe Tyr Thr Asn Leu Ile Thr Ser Gly Ile
85 90 95
Gly Leu Thr Glu Ser Lys Leu Asp Ala Phe Ser Glu Ala Gly Leu Asp
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115 120 125
Leu Ala Gly Asn Lys Lys Ala Phe Gln Gln Lys Leu Ala Met Ala Arg
130 135 140
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145 150 155 160
Arg His Asn Ile Asp Gln Leu Asp Lys Ile Ile Glu Leu Cys Ile Glu
165 170 175
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180 185 190
Ala Phe Leu Asn Arg Glu Gly Leu Leu Pro Thr Arg Glu Gln Ile Ala
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Arg Pro Lys Gly Cys Met Gly Gly Trp Gly Ser Ile Phe Leu Ser Val
245 250 255
Thr Pro Glu Gly Thr Ala Leu Pro Cys His Ser Ala Arg Gln Leu Pro
260 265 270
Val Ala Phe Pro Ser Val Leu Glu Gln Ser Leu Glu Ser Ile Trp Tyr
275 280 285
Asp Ser Phe Gly Phe Asn Arg Tyr Arg Gly Tyr Asp Trp Met Pro Glu
290 295 300
Pro Cys Arg Ser Cys Asp Glu Lys Glu Lys Asp Phe Gly Gly Cys Arg
305 310 315 320
Cys Gln Ala Phe Met Leu Thr Gly Ser Ala Asp Asn Ala Asp Pro Val
325 330 335
Cys Ser Lys Ser Pro His His His Lys Ile Leu Glu Ala Arg Arg Glu
340 345 350
Ala Ala Cys Ser Asp Ile Lys Val Ser Gln Leu Gln Phe Arg Asn Arg
355 360 365
Thr Arg Ser Gln Leu Ile Tyr Lys Thr Arg Glu Leu
370 375 380
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<211> 251
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 77
Met Met Ser Ser Glu Lys Thr Asn Asn Ser Arg Arg Asp Phe Leu Val
1 5 10 15
Lys Ser Met Ala Leu Ile Pro Thr Val Val Ile Gly Gly Ala Gly Ala
20 25 30
Gly Ala Ile Gly Val Ala Thr Ser Ala Thr Ala Gln Ala Ala Pro Ala
35 40 45
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Gln Phe Phe Asn Asp Arg Glu Trp Ala Phe Ile Asn Ala Ala Val Ala
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Arg Leu Ile Pro Ala Asp Glu Leu Gly Pro Gly Ala Lys Glu Ala Gly
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Val Pro Glu Phe Ile Asp Arg Gln Leu Asn Thr Pro Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
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115 120 125
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Ile Ala Asp Ala Glu Ala Trp Cys Gln Asp Lys Tyr His Lys Thr Phe
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245 250
<210> 78
<211> 438
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 78
Met Pro Leu Ile Ile Val Ala Ile Gly Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Met Ile Arg Phe Lys Met Asn Gly Phe Ile Ala Leu Val Leu Val Ala
20 25 30
Leu Ala Val Gly Leu Met Gln Gly Met Pro Leu Asp Lys Val Ile Val
35 40 45
Ser Ile Lys Asn Gly Val Gly Gly Thr Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ile
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Ala Ala Ser Ala Arg Ile Pro Leu Leu Tyr Val Gly Val Pro Met Ala
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Ala Ala Leu Ser Val Thr His Gly Phe Leu Pro Pro His Pro Gly Pro
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Thr Ala Ile Ala Thr Ile Phe His Ala Asp Met Gly Lys Thr Leu Leu
165 170 175
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195 200 205
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Ser Val Trp Thr Ser Leu Val Pro Val Ile Leu Met Ala Met Arg Ala
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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340 345 350
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385 390 395 400
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Leu Leu Gly Met Val Val
435
<210> 79
<211> 796
<212> PRT
<213> 栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)
<400> 79
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35 40 45
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Leu Trp Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Ala Thr Met Ile Trp Gly Val
65 70 75 80
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Leu Ser Val Pro Ser Ala Gly Ala Val Gly Ala Leu Val Val Ala Leu
115 120 125
Leu Ile Ser Gly Gly Met Leu Thr Trp Ala Gly Phe Asn Asp Pro Gln
130 135 140
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165 170 175
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Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Phe Asp Pro Gln Leu Asn Ala
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275 280 285
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Ser Pro Pro Ile Ile Thr Asp Lys Thr Ile Val Ile Ala Gly Ala Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala Lys Leu Asp Leu Val
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515 520 525
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530 535 540
Gly Ala Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Phe Asp Gln Leu Val Cys Arg
545 550 555 560
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595 600 605
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645 650 655
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675 680 685
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Asn Met Ser Asn Gly Glu Lys Leu Trp Glu Ala Arg Leu Pro Ala Gly
740 745 750
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755 760 765
Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp
770 775 780
Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Asp Ala Lys
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<210> 80
<211> 438
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 80
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1 5 10 15
Met Ile Arg Phe Lys Leu Asn Gly Phe Ile Ala Leu Ile Leu Val Ala
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Leu Ala Val Gly Ile Met Gln Gly Met Pro Val Asp Lys Val Ile Thr
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Ala Ala Leu Ser Val Thr His Gly Phe Leu Pro Pro His Pro Gly Pro
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Thr Ala Ile Ala Thr Ile Phe His Ala Asp Met Gly Lys Thr Leu Leu
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Tyr Ala Arg Phe Leu Lys Gly Ile Asp Lys Pro Val Pro Glu Gly Leu
195 200 205
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275 280 285
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Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ala Phe Lys Gln Val Leu Val Asp Ser Gly
305 310 315 320
Ile Glu Lys Tyr Ile Ala Ala Leu Met His Gly Ser Thr Leu Ser Pro
325 330 335
Ile Leu Leu Ala Trp Ser Ile Ala Ala Val Leu Arg Ile Ala Leu Gly
340 345 350
Ser Ala Thr Val Ala Ala Ile Thr Ala Gly Gly Ile Ala Ala Pro Leu
355 360 365
Ile Ala Thr Thr Gly Val Ser Pro Glu Leu Met Val Ile Ala Val Gly
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Ser Gly Ser Val Ile Phe Ser His Val Asn Asp Pro Gly Phe Trp Leu
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Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Ser Ile Val Glu Thr Phe Lys Ser Trp
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Ser Val Leu Glu Thr Ile Ile Ser Leu Cys Gly Leu Ala Gly Cys Leu
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Leu Leu Ser Met Val Val
435
<210> 81
<211> 802
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 81
Met Arg Asn Glu Arg Phe Phe Ser Trp Ser Phe Met Thr Gly Leu Val
1 5 10 15
Thr Ala Val Ile Gly Leu Ala Tyr Leu Val Leu Gly Val Trp Leu Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Val Lys Val Gly Asn Ser Leu Phe Ile Cys Thr Pro His Arg Glu Val
225 230 235 240
Ile Ala Leu Asn Ala Thr Thr Gly Ala Gln Arg Trp Lys Phe Asp Pro
245 250 255
Lys Ser Asp Thr Ser Ala Asn Glu Tyr Leu Ala Cys Arg Gly Val Ala
260 265 270
Tyr Ser Gln Ser Ala Gly Asp Lys Val Cys Pro Glu Lys Ile Ile Ala
275 280 285
Thr Thr Ser Glu Ala Arg Met Val Ala Leu Asn Ala Gln Thr Gly Glu
290 295 300
Pro Cys Ser Ser Phe Gly Gln Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Asp His
305 310 315 320
Met Gly Asp Val Pro Pro Gly Phe His Phe Ile Thr Ser Gln Pro Met
325 330 335
Val Met Asp Gly Arg Ile Val Leu Gly Gly Trp Ile Tyr Asp Asn Gln
340 345 350
Ser Thr Gly Glu Pro Ser Gly Val Val Arg Ala Phe Asp Val Asn Thr
355 360 365
Gly Gln Leu Ala Trp Ala Trp Asp Met Gly Arg Asp Pro Gln Asn Ala
370 375 380
Pro Leu Lys Pro Gly Glu Val Tyr Thr Arg Gly Thr Pro Asn Gly Trp
385 390 395 400
Gly Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Lys Leu Gly Leu Val Tyr Ile Pro Leu
405 410 415
Gly Asn Ala Thr Pro Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Arg Arg Pro Phe Asp
420 425 430
Glu Lys Tyr Ser Ser Ser Leu Val Ala Leu Asp Ile His Thr Gly Glu
435 440 445
Glu Arg Trp His Phe Gln Thr Val His His Asp Val Trp Asp Phe Asp
450 455 460
Leu Pro Ile Gly Pro Thr Leu Val Asp Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ile
465 470 475 480
Thr Val Pro Ala Leu Val Gln Thr Thr Lys Met Gly Gln Leu Phe Leu
485 490 495
Leu Asp Arg Arg Thr Gly Lys Pro Leu Ala Gln Val Asn Glu Lys Pro
500 505 510
Val Asn Thr Ser Pro Ser Leu Pro Gly Glu His Leu Ser Pro Thr Gln
515 520 525
Pro Asp Ser Val Gly Met Pro Ser Leu Ser Pro Pro Asp Leu Lys Glu
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545 550 555 560
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Gly Lys Ser Ile Ala Tyr Pro Ala Phe Asp Gly Val Met Asp Trp Tyr
580 585 590
Gly Ala Ser Val Asp Pro Ile Arg His Val Leu Ile Ala Asn Thr Ser
595 600 605
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610 615 620
Glu Gly Leu Met His Lys Trp Ala Gly Trp Gly Ser Asn Gln Pro Tyr
625 630 635 640
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675 680 685
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690 695 700
Gly Thr His Thr Asn Val Pro Leu Pro Thr Gly Ile Phe Met Met Gly
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Gly Asn Ile Ile Thr Gln Ser Gly Leu Ile Phe Thr Gly Ala Thr Ala
725 730 735
Asp Asn Tyr Phe Arg Ala Phe Asp Glu Thr Thr Gly Asn Glu Leu Trp
740 745 750
Arg Ala Arg Leu Pro Ala Gly Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Thr
755 760 765
Gly Asp Asp Gly Arg Gln Phe Val Val Ile Ala Ala Gly Gly His Gly
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<210> 82
<211> 799
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 82
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1 5 10 15
Leu Phe Ala Ala Leu Ser Gly Ile Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Ile Trp
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Leu Ala Lys Asn Ala Phe Ala Arg Gly Ala Leu Ala Val Ser Leu Leu
115 120 125
Phe Thr Val Ile Val Leu Gly Tyr Ala Ile Phe Asn Asp Pro Gln Val
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Ile Asn Gly Thr Ile Lys Ala Ala Asp Ser Ala Pro Ala Lys Ser Glu
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Ser Gly Ile Pro Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr Gly Arg Thr Gln Gly
165 170 175
Gly Thr Arg Tyr Ser Pro Leu Asn Gln Ile Asn Asp Lys Asn Val Ser
180 185 190
Lys Leu Asp Val Ala Trp Thr Phe Arg Thr Gly Asp Leu Lys Thr Pro
195 200 205
Asn Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asp Glu Val Thr Pro Ile Lys Ile Gly
210 215 220
Asp Met Leu Tyr Leu Cys Thr Pro His Gln Lys Leu Phe Ala Leu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp Lys Phe Asp Pro Glu Leu Lys Pro
245 250 255
Asn Pro Thr Phe Gln His Val Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His Glu
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Ala Glu Gly Asn Ala Thr Asn Gly Ala Ala Pro Ala
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Val Cys Ser Arg Arg Ile Ile Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu Phe
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Ala Leu Asp Ala Glu Thr Gly Ala Arg Cys Pro Ala Phe Gly Asn Asn
305 310 315 320
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Ala Gly Ala Val Thr Asp Asn Tyr Ser Asn Arg Glu Pro Ser Gly Val
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Ile Arg Gly Phe Asp Val Glu Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe Asp
370 375 380
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Thr Pro Asn Ser Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Asp Lys
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485 490 495
Thr Lys Thr Gly Asn Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Asp Gly Lys Leu
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Ile Val Asp Ala Pro Glu Lys Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Lys Gly
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Gly Met Phe Glu Trp Gly Gly Ile Ser Val Asp Thr Asp Arg Gln Val
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610 615 620
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625 630 635 640
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660 665 670
Pro Ala Trp Gly Tyr Ile Ser Gly Val Asp Leu Lys Thr Asn Asp Ile
675 680 685
Val Trp Lys Lys Arg Ile Gly Thr Val Arg Asp Ser Ser Pro Leu Pro
690 695 700
Leu Pro Phe Lys Met Gly Met Pro Met Leu Gly Ala Pro Val Ser Thr
705 710 715 720
Ala Gly Asn Val Phe Phe Ile Ala Ala Thr Ala Asp Asn Tyr Leu Arg
725 730 735
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<210> 83
<211> 245
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 83
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130 135 140
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Ala Lys Gln His Pro
245
<210> 84
<211> 232
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 84
Met Arg Lys Ser Leu Val Ala Leu Leu Leu Phe Thr Leu Gly Ser Thr
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<211> 345
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 85
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Gly Asp Val Ala Gly Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Met Ser Asp Ala
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Gly Tyr Gly Asp Ala Leu Ile Glu Lys Ile Ala Tyr Arg Asn Trp Leu
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<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 86
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195 200 205
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Asp Met Gly His Leu Ala Leu Ala Glu Glu Gln Gly Leu Ile Ala Leu
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<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 87
Met Ser Ile Ser Thr Thr Gln Thr Ser Pro Met Thr Pro Gln Glu Phe
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Ala Cys Ser Ser Leu Thr Glu Leu Phe Ala Pro Gln Ile His Gln Ala
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Arg Leu Asp Thr Trp Pro Gln His Tyr Thr Trp Ile Glu Glu Glu Gly
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<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 88
Met Ile Thr Ile Thr Glu His Tyr Thr Pro Met Phe Arg Arg Gly Tyr
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<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 89
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Glu Leu Thr Tyr Arg Cys Pro Leu Gln Cys Pro Tyr Cys Ser Asn Pro
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Leu Asp Phe Ala Lys Gln Glu Lys Glu Leu Thr Thr Ala Gln Trp Ile
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65 70 75 80
Ala Ala Arg Asp Leu Gly Phe Tyr Thr Asn Leu Ile Thr Ser Gly Ile
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Gly Leu Thr Glu Lys Lys Ile Asp Ala Phe Ala Glu Ala Gly Leu Asp
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His Ile Gln Ile Ser Phe Gln Ala Ser Asp Glu Thr Leu Asn Ala Ala
115 120 125
Leu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Phe Arg Gln Lys Leu Val Met Ala Lys
130 135 140
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Arg His Asn Ile Asp Gln Ile Asp Lys Ile Ile Asp Leu Ser Ile Glu
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Leu Glu Ala Asp Asp Val Glu Leu Ala Thr Cys Gln Phe Tyr Gly Trp
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195 200 205
Arg Ala Glu Gln Val Val His Gln Tyr Arg Glu Lys Met Ala Gly Thr
210 215 220
Gly Asn Leu Ala Asn Leu Leu Phe Val Thr Pro Asp Tyr Tyr Glu Glu
225 230 235 240
Arg Pro Lys Gly Cys Met Gly Gly Trp Gly Ala Ile Phe Leu Ser Val
245 250 255
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Cys Ser Lys Ser Glu His His Gly Lys Ile Leu Ala Ala Arg Glu Gln
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Val Asn Ser Gln Leu Ile Phe Lys Gly
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<211> 587
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 90
Met Ala Lys Lys Leu Pro Lys Thr Asp Val Val Val Ile Gly Leu Gly
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Trp Ala Gly Ser Ile Ile Ala Asn Glu Leu Cys Asp Glu Gly Leu Asn
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Gly Ala Asn Ala Ile Pro Glu Glu Leu Val Leu Gln Asp Trp Gly Thr
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Gly Val Ser Gly Lys Ala Ser Asn Val Lys Gly Glu His His Glu Gly
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Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Met Arg Ser Ile Glu Tyr Pro Thr Arg Pro
180 185 190
Leu Asp Gln Pro Tyr Gly Pro Thr Leu Phe Ala Gln Ala Ala Arg Asn
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Met Gly Tyr Lys Ala Phe Pro Val Pro Ser Ser Leu Ile Ser Glu Pro
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Thr Asn Cys Glu Val Met Gln Val Leu Thr Asp Ser Thr Gly Lys Arg
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Ala Thr Gly Val Val Tyr Ile Asp Ser Ser Gly Asp Glu Trp Glu Gln
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Leu Met Leu Leu Ser Gly Ile Gly Lys Pro Tyr Asp Pro Val Thr Leu
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340 345 350
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<210> 91
<211> 587
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 91
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195 200 205
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225 230 235 240
Phe Cys Thr Asn Phe Gly Cys Ala Asn Tyr Ser Lys Ala Ser Ala Ile
245 250 255
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260 265 270
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ala Val Gly Met Gly Ile Asp Asp Phe Asn Asn Asp Asn Phe Asp His
370 375 380
Ser Gly Leu Gly Phe Phe Gly Gly Gly Ser Ile Arg Val Thr Pro Ile
385 390 395 400
Gly Gly Ala Pro Ile Gly Tyr Arg Pro Val Pro Pro Gly Thr Pro Lys
405 410 415
Trp Gly Ser Glu Trp Lys Lys Ala Thr Val Ala Asn Tyr Leu Ser Ser
420 425 430
Met Ser Ile Gly Cys Glu Ala Ser Ser Tyr Thr Thr Lys Thr Asn Tyr
435 440 445
Leu Ser Leu Asp Pro Asn Tyr Lys Asp Arg Leu Gly Arg Pro Leu Leu
450 455 460
Arg Val Thr Phe Asp Phe Pro Ala Asn Asp Leu Lys Met Ala Ala Tyr
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Cys Thr Gly Lys Val Ala Glu Ile Ala Lys Ala Met Asn Pro Arg Gln
485 490 495
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<210> 92
<211> 589
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 92
Met Ala Lys Val Thr Lys Pro Glu Val Asp Val Val Val Val Gly Leu
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Ala Tyr Pro Lys Pro Ala Asp Glu Tyr Ala Tyr Ala Val Arg Asn Lys
50 55 60
Val Met Ala Thr Pro Ala Glu Ala Ala Val Thr Val Arg Tyr Asn Met
65 70 75 80
Arg Glu Thr Ala Leu Pro Thr Arg Lys Trp Gly Ala Phe Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Gly Val Gly Gly Ser Gly Leu His Trp Thr Ala Val Leu Ile Arg
100 105 110
Pro Thr Pro Thr Asp Leu Lys Leu Lys Thr Tyr Ala Asp Glu Ala Tyr
115 120 125
Lys Pro Gly Ile Leu Gln Glu Asp Met Arg Ile Met Asp Phe Pro Phe
130 135 140
Thr Trp Asp Glu Ile Glu Pro Tyr Tyr Thr Lys Phe Glu His Ile Cys
145 150 155 160
Gly Gln Ser Gly Lys Thr Gly Asn Leu Arg Gly Gln Ile Met Glu Gly
165 170 175
Gly Asp Pro Phe Glu Gly Pro Arg Ser Glu Pro Tyr Pro Leu Pro Ala
180 185 190
Leu Glu Asp Thr Leu Asn Ser Ser Met Phe Ala Glu Val Thr Lys Lys
195 200 205
Met Gly Tyr His Pro Phe Pro Asn Pro Ser Ala Cys Val Ser Arg Ala
210 215 220
Trp Thr Asn Pro Tyr Gly Asn Gln Ile Ala Pro Cys Asn Tyr Cys Gly
225 230 235 240
Tyr Cys Ser Lys Tyr Pro Cys Leu Asn Tyr Ser Lys Ala Ser Pro Gln
245 250 255
Thr Ala Val Met Asp Ala Leu Lys Arg Met Asp Asn Phe Ser Tyr Glu
260 265 270
Val His Ala Asn Val Leu Lys Val Glu Leu His Asp Asp Lys Lys Thr
275 280 285
Ala Lys Gly Val Ile Tyr Met Asp Ala Asp Gly Asn Glu Cys Phe Gln
290 295 300
Pro Ala Lys Ile Val Val Leu Ser Ser Phe Gln Phe Cys Asn Val Arg
305 310 315 320
Leu Met Leu Leu Ser Gly Ile Gly Lys Pro Tyr Asn Pro Ile Thr Glu
325 330 335
Glu Gly Val Ile Gly Arg Asn Tyr Ala Phe Leu Ser Asn Gly Gly Ser
340 345 350
Thr Leu Phe Phe Lys Asp Lys Asn Phe Asn Pro Phe Ala Thr Ala Gly
355 360 365
Ala Thr Gly Gln Met Phe Asn Asp Ile Ser Pro Gly Asn Phe Asp Gly
370 375 380
Pro Ala Leu Gly Phe Ile Gly Gly Ala Lys Ile His Ser Ser Gln Ala
385 390 395 400
Thr Gly Thr Pro Ile Ser Thr Ser Leu Pro Lys Gly Thr Pro Ala Trp
405 410 415
Gly Thr Gly Trp Lys Glu Gly Met Glu Glu Trp Tyr Gly His Ser Met
420 425 430
Lys Ile Ser Ile Thr Thr Thr Cys Gln Ser Tyr Arg Asp Ile Tyr Leu
435 440 445
Asp Leu Asp Pro Asn Tyr Lys Asp Glu Tyr Gly Tyr Pro Leu Leu Arg
450 455 460
Met Thr Phe Asp Trp Lys Gln Asn Glu Leu Lys Leu Gln Gln Tyr Leu
465 470 475 480
Lys Gly Ile Val Gly Asn Ile Thr Lys Glu Leu Asn Pro Asp Ser Tyr
485 490 495
Ser Glu Ser Phe Leu Pro Met Asp Ala His Phe Asp Leu Thr Lys Tyr
500 505 510
Val Ser Thr His Asn Val Gly Gly Ala Val Met Gly Asp Asn Pro Lys
515 520 525
Thr Ser Ala Leu Asn Lys Phe Leu Gln Ser Trp Asp Val His Asn Val
530 535 540
Phe Val Pro Gly Gly Asn Ala Phe Pro Gln Asn Phe Gln Ala Asn Pro
545 550 555 560
Thr Asp Thr Ile Gly Ala Ile Thr Leu Met Ala Ala Gln Ala Ile Lys
565 570 575
Asp Gln Tyr Leu Lys Asn Pro Gly Pro Leu Val Gln Ala
580 585
<210> 93
<211> 438
<212> PRT
<213> 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)
<400> 93
Met Pro Leu Val Ile Val Ala Val Gly Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Met Ile Arg Phe Lys Leu Asn Gly Phe Ile Ala Leu Ile Leu Val Ala
20 25 30
Leu Ala Val Gly Ile Met Gln Gly Met Pro Val Asp Lys Val Ile Thr
35 40 45
Ser Ile Lys Asn Gly Val Gly Gly Thr Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ile
50 55 60
Met Gly Phe Gly Ala Met Leu Gly Lys Met Leu Ala Asp Cys Gly Gly
65 70 75 80
Ala Gln Arg Ile Ala Thr Thr Leu Ile Glu Lys Phe Gly Arg Glu His
85 90 95
Ile Gln Trp Ala Ile Val Leu Thr Gly Phe Ile Val Gly Phe Ala Leu
100 105 110
Phe Tyr Glu Val Gly Phe Val Leu Met Leu Pro Leu Val Phe Thr Val
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Leu Leu Tyr Val Gly Val Pro Met Ala
130 135 140
Ala Ala Leu Ser Val Thr His Gly Phe Leu Pro Pro His Pro Gly Pro
145 150 155 160
Thr Ala Ile Ala Thr Ile Phe His Ala Asp Met Gly Lys Thr Leu Leu
165 170 175
Phe Gly Ser Leu Leu Ala Val Pro Thr Val Ile Leu Ala Gly Pro Val
180 185 190
Tyr Ala Arg Phe Leu Lys Gly Ile Asp Lys Pro Val Pro Glu Gly Leu
195 200 205
Phe Asn Pro Lys Thr Phe Thr Glu Glu Glu Met Pro Gly Phe Gly Val
210 215 220
Ser Val Ala Thr Ser Leu Val Pro Val Ile Leu Met Ala Phe Arg Ala
225 230 235 240
Leu Cys Glu Met Ile Leu Pro Lys Gly His Pro Val Leu Ala Tyr Ala
245 250 255
Glu Phe Phe Gly Asp Pro Val Met Ala Thr Leu Ile Ala Val Leu Ile
260 265 270
Ala Ile Phe Thr Phe Gly Leu Asn Arg Gly Arg Lys Met Glu Asp Val
275 280 285
Met Ala Thr Val Thr Asp Ser Ile Lys Ile Ile Ala Met Met Leu Leu
290 295 300
Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ala Phe Lys Gln Val Leu Val Asp Ser Gly
305 310 315 320
Ile Glu Lys Tyr Ile Ala Ala Leu Met His Gly Ser Asn Leu Ser Pro
325 330 335
Ile Leu Leu Ala Trp Ser Ile Ala Ala Val Leu Arg Ile Ala Leu Gly
340 345 350
Ser Ala Thr Val Ala Ala Ile Thr Ala Gly Gly Ile Ala Ala Pro Leu
355 360 365
Ile Ala Thr Thr Gly Val Ser Pro Glu Leu Met Val Ile Ala Val Gly
370 375 380
Ser Gly Ser Val Ile Phe Ser His Val Asn Asp Pro Gly Phe Trp Leu
385 390 395 400
Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Ser Ile Val Glu Thr Phe Lys Ser Trp
405 410 415
Ser Val Leu Glu Thr Ile Ile Ser Leu Cys Gly Leu Ala Gly Cys Leu
420 425 430
Leu Leu Ser Met Val Val
435

Claims (137)

1.一种工程改造的微生物，其包含与磷酸盐增溶相关的基因的改变，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是所述微生物的原生基因，由此与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
2.一种工程改造的微生物，其包含与磷酸盐增溶相关的基因的改变，其中所述工程改造的微生物是非属间工程改造的微生物，并且其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
3.如权利要求1或权利要求2所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是非特异性酸性磷酸酶基因。
4.如权利要求3所述的工程改造的微生物，其中所述非特异性酸性磷酸酶基因包括phoC、napA、napD、napE、acpA、appA，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
5.如权利要求1或权利要求2所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是植酸酶基因。
6.如权利要求5所述的工程改造的微生物，其中所述植酸酶基因是appA、phy，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
7.如权利要求1或权利要求2所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是葡糖酸生物合成基因。
8.如权利要求7所述的工程改造的微生物，其中所述葡糖酸生物合成基因是pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gcd、gabY，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
9.如权利要求1或权利要求2所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因是葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
10.如权利要求1至9中任一项所述的工程改造的微生物，其中与缺乏所述与磷酸盐增溶相关的基因的所述改变的相同物种的微生物相比，所述工程改造的微生物包含所述与磷酸盐增溶相关的基因的改变表达。
11.如权利要求1至10中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐增溶相关的基因的改变包括调控元件的插入。
12.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是组成型启动子。
13.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是诱导型启动子。
14.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是组织特异性启动子。
15.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物相同物种的微生物。
16.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物相同属的微生物。
17.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物不同物种的微生物。
18.如权利要求11所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物不同属的微生物。
19.如权利要求1至18中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐相关的基因的改变包括密码子优化。
20.如权利要求1至18中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐相关的基因的改变包括密码子随机化。
21.如权利要求1至18中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐相关的基因的改变包括基因功能的降低。
22.如权利要求1至18中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐相关的基因的改变包括功能丧失突变。
23.如权利要求1至18中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述与磷酸盐相关的基因的改变包括基因缺失。
24.如权利要求1至23中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物是工程改造的细菌。
25.如权利要求24所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的细菌选自由以下组成的组：产碱杆菌属某些种、产气气杆菌、无色杆菌属某些种、寡孢马杜拉放线菌、土壤杆菌属某些种、巴西固氮螺菌、芽孢杆菌属某些种、环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜几丁质类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生根瘤菌属某些种、短杆菌属某些种、柠檬酸杆菌属某些种、假单胞菌属某些种、恶臭假单胞菌、条纹假单胞菌、荧光假单胞菌、钙假单胞菌、黄杆菌属某些种、亚硝化单胞菌属某些种、欧文氏菌属某些种、微球菌属某些种、中间型大肠杆菌、阿氏肠杆菌、解磷沙雷氏菌、硝化杆菌属某些种、氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、草木樨根瘤菌和黄单胞菌属某些种。
26.如权利要求1至23中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物是工程改造的真菌。
27.如权利要求26所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的真菌选自由以下组成的组：泡盛曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、臭曲霉、文氏曲霉、尖孢镰刀菌、细链格孢、Achrothcium某些种、比莱青霉、指状青霉、淡紫青霉、巴拉吉青霉、绳状青霉、头孢霉属某些种、枝孢霉属某些种、月状弯孢霉、小克银汉霉属某些种、假丝酵母属某些种、球毛壳菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、长蠕孢属某些种、具纺锤形孢子拟青霉、腐霉属某些种、茎点霉属某些种、棘管轮丝葚霉、露湿漆斑菌、被孢霉属某些种、小单孢菌属某些种、树粉孢属某些种、立枯丝核菌、根霉属某些种、毛霉属某些种、绿色木霉、嗜热色串孢、西方许旺酵母，和齐整小核菌。
28.如权利要求1至23中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物是工程改造的酵母菌。
29.如权利要求1至23中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物是生物控制微生物。
30.如权利要求1至23中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物表达细菌毒素。
31.如权利要求1至30中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物进一步包含与氮的固定或同化相关的基因的改变，并且其中所述工程改造的微生物以比相同物种的非工程改造的微生物更大的容量或速率排泄出固定的氮。
32.如权利要求1至30中任一项所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物固定氮。
33.一种工程改造的微生物，其包含选自由以下组成的组的基因的改变：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、pqq生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，或它们的功能变体，或它们的任何组合，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
34.如权利要求33所述的工程改造的微生物，其中所述改变包括选自由以下组成的组的基因的改变：phoC、napD、napE、acpA、appA、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、gcd，或它们的功能变体，或它们的任何组合。
35.如权利要求34所述的工程改造的微生物，其中所述改变包括所述基因中的一个或多个密码子的密码子优化。
36.如权利要求34所述的工程改造的微生物，其中所述改变包括所述基因中的一个或多个密码子的密码子随机化。
37.如权利要求34所述的工程改造的微生物，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物包含所述基因的表达的改变。
38.如权利要求34所述的工程改造的微生物，其中所述改变包括调控元件的插入。
39.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是组成型启动子。
40.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是诱导型启动子。
41.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件是组织特异性启动子。
42.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物相同物种的微生物。
43.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物相同属的微生物。
44.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物不同物种的微生物。
45.如权利要求38所述的工程改造的微生物，其中所述调控元件来源于与所述工程改造的微生物不同属的微生物。
46.一种工程改造的微生物，其包含选自由以下组成的组的基因的改变：pqq基因、gabY、gcd，或它们的功能变体，或它们的任何组合，其中所述改变包括密码子改变，并且其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
47.如权利要求46所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物在至少约12mM的可溶性磷酸盐存在下增溶磷酸盐。
48.如权利要求46或权利要求47所述的工程改造的微生物，其中所述工程改造的微生物不含有来源于不同属的生物体的任何DNA元件。
49.一种增溶磷酸盐的方法，所述方法包括使不溶性磷酸盐与权利要求1至48中任一项所述的工程改造的微生物接触。
50.一种增加土壤中可溶性磷酸盐的量的方法，所述方法包括使包含不溶性磷酸盐的土壤与权利要求1至48中任一项所述的工程改造的微生物接触。
51.如权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述不溶性磷酸盐是有机磷酸盐。
52.如权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述不溶性磷酸盐是无机磷酸盐。
53.一种产生具有改善的磷酸盐增溶活性的工程改造的微生物的方法，所述方法包括：
a)改变与磷酸盐增溶相关的原生编码序列的密码子使用以产生密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列；
b)将所述密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列功能性地连接至启动子；以及
c)将所述启动子和所述密码子改变的与磷酸盐增溶相关的编码序列引入到微生物中以产生所述改善的微生物。
54.如权利要求53所述的方法，其中从与所述改善的微生物相同物种的微生物中鉴别出所述原生编码序列。
55.如权利要求53所述的方法，其中改变所述原生编码序列的密码子使用包括密码子随机化。
56.如权利要求53所述的方法，其中改变所述原生编码序列的密码子使用包括密码子优化。
57.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物能够多增溶至少5％的磷酸盐。
58.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物能够多增溶至少10％的磷酸盐。
59.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物能够多增溶至少15％的磷酸盐。
60.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物能够多增溶至少50％的磷酸盐。
61.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物能够多增溶至少90％的磷酸盐。
62.如权利要求57至61中任一项所述的方法，其中通过改良的抗坏血酸方法测量所增溶的磷酸盐的量。
63.一种增加土壤中可溶性磷酸盐的量的方法，所述方法包括使包含不溶性磷酸盐的土壤与工程改造的微生物接触，其中所述工程改造的微生物具有gad基因、gntT基因，或它们的功能变体，或它们的任何组合的功能的降低。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的gad基因、gntT基因，或它们的功能变体，或它们的任何组合的功能的降低是由所述gad基因、所述gntT基因或所述的它们的功能变体或它们的任何组合的缺失引起。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述gad基因是gad1或gad2。
66.一种工程改造的微生物，其包含选自由phoA、phoC和phoD组成的组的密码子改变的碱性磷酸酶基因，其中与相同物种的非工程改造的微生物相比，所述工程改造的微生物以更大的容量或速率增溶磷酸盐。
67.如权利要求66所述的工程改造的微生物，其中所述密码子改变的碱性磷酸酶基因是经密码子随机化的。
68.如权利要求66所述的工程改造的微生物，其中所述密码子改变的碱性磷酸酶基因是经密码子优化的。
69.一种增加植物中磷的量的方法，所述方法包括使所述植物与工程改造的微生物接触，所述工程改造的微生物包含与磷增溶相关的基因的至少一种遗传变异。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述工程改造的微生物是工程改造的非属间微生物。
71.如权利要求70所述的方法，其中使所述植物与工程改造的非属间微生物接触包括将所述工程改造的非属间微生物施加至播种了所述植物的种子的土壤中。
72.如权利要求70或权利要求71所述的方法，其中使所述植物与工程改造的非属间微生物接触包括将所述工程改造的非属间微生物施加至播种了所述植物的种子的犁沟中。
73.如权利要求70所述的方法，其中使所述植物与工程改造的非属间微生物接触包括将所述工程改造的非属间微生物包衣至所述植物的种子上。
74.如权利要求70所述的方法，其中所述植物是选自由以下组成的组的农业作物植物：高粱、坎诺拉油菜、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米和小麦。
75.如权利要求70所述的方法，其中所述工程改造的非属间微生物至少定殖于所述植物的根上，使得所述工程改造的非属间微生物以每克组织鲜重至少105个菌落形成单位的量存在于所述植物中。
76.如权利要求70所述的方法，其中所述工程改造的非属间微生物增溶有机磷。
77.如权利要求70所述的方法，其中所述工程改造的非属间微生物增溶无机磷。
78.如权利要求70所述的方法，其中所述工程改造的非属间微生物排泄出磷酸盐增溶产物。
79.工程改造的非属间微生物，其中植物体中的所述工程改造的非属间微生物增溶植物中至少1％的磷。
80.如权利要求79所述的工程改造的非属间微生物，其中所述工程改造的非属间微生物是细菌。
81.如权利要求79所述的工程改造的非属间微生物，其中所述工程改造的非属间微生物是真菌。
82.一种细菌性磷增溶系统，其包含编码以下的核酸：
至少一个操纵子，其包含由共同地与磷酸盐增溶相关的基因编码的多肽集的多个编码序列，其中所述多个编码序列中的至少一个包含至少一个非原生密码子；
异源启动子区，其指导所述至少一个操纵子的表达；和
异源转录控制子编码序列，其编码指导所述增溶系统的所述至少一个操纵子的表达的蛋白质，其中所述蛋白质直接或间接结合至所述异源启动子区。
83.一种方法，其包括：
a)提供与目的靶植物相关的多个微生物物种；
b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；
c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；
d)在所述候选微生物物种中表征选自由以下组成的组的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；
e)将一种或多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中；
f)确认所述一种或多种靶向遗传变异在靶基因组基因座处的整合；以及
g)重复步骤d)和e)一次或多次，直至所述候选微生物物种已获得改善的增溶磷酸盐的能力。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗变异。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且步骤(f)进一步包括确认转基因序列的不存在。
86.如权利要求83所述的方法，其中步骤b)包括在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因。
87.如权利要求83所述的方法，其中步骤e)包括：
a)用转化质粒转化所述候选微生物物种，所述转化质粒包含：
(i)选择标记，
(ii)反选择标记，
(iii)DNA片段，其包含待在与磷酸盐增溶相关的一个或多个基因组通路或基因集中的靶基因组基因座处引入到所述候选微生物物种中的遗传变异，和位于所述遗传变异侧翼的针对所述靶基因组基因座的同源臂；和
(iv)质粒骨架；
b)基于所述选择标记在所述候选微生物物种的基因组中的存在，选择出已经历初始同源重组从而使得所述遗传变异整合至所述靶基因组基因座中的候选微生物物种；以及
c)基于所述反选择标记的不存在，选择出具有整合至所述靶基因组基因座中的所述遗传变异并且已经历环出所述质粒骨架的额外同源重组的候选微生物物种。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述DNA片段包含非属间遗传变异。
89.如权利要求83所述的方法，其中步骤f)包括对所述候选微生物物种的基因组的一部分进行测序。
90.如权利要求83所述的方法，其中步骤f)包括确认来自转化质粒的转基因序列的不存在。
91.如权利要求83所述的方法，其中步骤b)包括在基于温室或实验室的条件下测定所述多个微生物物种的所述定殖度量。
92.如权利要求83所述的方法，其中步骤b)包括在田间条件下测定所述多个微生物物种的所述定殖度量。
93.如权利要求83所述的方法，其中步骤b)包括在i)基于温室或实验室的条件和ii)田间条件下测定所述多个微生物物种的所述定殖度量。
94.如权利要求83所述的方法，其中步骤b)中测定的所述定殖度量包括空间定殖模式、时间定殖动力学、定殖密度或其组合。
95.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的。
96.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量所述微生物物种的转录组谱。
97.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量与所述增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。
98.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。
99.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。
100.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括在不溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性。
101.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在基于温室或实验室的条件下进行的，并且包括在不溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述的启动子序列的转录组活性。
102.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的。
103.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量所述微生物物种的转录组谱。
104.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量与增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。
105.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。
106.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。
107.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括在可溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性。
108.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在田间条件下进行的，并且包括在可溶性磷酸盐存在下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述的启动子序列的转录组活性。
109.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的。
110.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量所述微生物物种的转录组谱。
111.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量与所述微生物物种增溶磷酸盐的能力相关的基因的转录组活性。
112.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量调控基因序列的转录组活性。
113.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括测量启动子序列的转录组活性。
114.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括在可溶性磷酸盐耗乏和可溶性磷酸盐充足的条件下测量启动子序列的转录组活性。
115.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因是在体外进行的，并且包括在可溶性磷酸盐耗乏和可溶性磷酸盐充足的条件下测量启动子序列的转录组活性，其中通过对受调控基因的表达进行定量来测量所述的启动子序列的转录组活性。
116.如权利要求86所述的方法，其中测定所述多个微生物物种的定殖度量包括使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
117.如权利要求86所述的方法，其中测定所述多个微生物物种的定殖度量包括在基于温室或实验室的条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
118.如权利要求86所述的方法，其中测定所述多个微生物物种的定殖度量包括在田间条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
119.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
120.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括在基于温室或实验室的条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
121.如权利要求86所述的方法，其中在代谢相关的环境条件下测定所述多个微生物物种的转录活性基因包括在田间条件下使所述多个微生物物种与靶植物紧密缔合地生长。
122.如权利要求86所述的方法，其中步骤b)包括在基于温室或实验室的条件下测定所述多个微生物物种增溶磷酸盐的能力。
123.如权利要求86所述的方法，其中步骤b)包括在磷酸盐增溶测定中测定所述多个微生物物种的磷酸盐增溶活性。
124.如权利要求86所述的方法，其中所述转化质粒是自杀质粒。
125.一种用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的方法，所述方法包括：
a)提供多个微生物物种；
b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；
c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；
d)在选自由以下组成的组的基因中的靶基因组基因座处将一种或多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；
e)确认所述遗传变异在所述靶基因组基因座处的整合；以及
f)重复步骤d)-e)一次或多次，直至所述候选微生物物种已获得改善的增溶磷酸盐的能力。
126.如权利要求125所述的方法，其中步骤b)包括在代谢相关的环境条件下测定转录活性基因。
127.如权利要求125所述的方法，其中在步骤d)中，所述一种或多种靶向遗传变异包括全部基因缺失、部分基因缺失、启动子插入、单个碱基对变化以及它们的组合。
128.根据权利要求125或127所述的方法，其中所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且其中步骤(f)进一步包括确认任一转基因遗传序列的不存在。
129.如权利要求125所述的方法，其中步骤e)包括对所述候选微生物物种的所述基因组的一部分进行测序。
130.一种用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的方法，其包括：
a)提供多个微生物物种；
b)测定所述多个微生物物种的定殖度量和增溶磷酸盐的能力；
c)从所述多个所测定的微生物物种中选择出候选微生物物种；
d)在一种或多种选自由以下组成的组的基因中的两个或更多个靶基因组基因座处将两种或更多种靶向遗传变异引入到所述候选微生物物种中：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；以及
e)确认所述遗传变异在所述靶基因组基因座处的引入。
131.如权利要求130所述的方法，其中步骤b)包括在代谢相关的环境条件下测定转录活性基因。
132.如权利要求130所述的方法，其中在步骤d)中，所述遗传变异选自由以下组成的组：全部基因缺失、部分基因缺失、启动子插入、单个碱基对变化以及它们的组合。
133.根据权利要求130或132所述的方法，其中所述一种或多种靶向遗传变异是非属间遗传变异，并且其中步骤(f)进一步包括确认任一转基因遗传序列的不存在。
134.如权利要求130所述的方法，其中步骤e)包括对所述候选微生物物种的所述基因组进行测序。
135.一种计算方法，其包括：
a)获取多个微生物全基因组序列；
b)鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；
c)鉴别来自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；
d)从所述多个调控基因序列和所述多个与磷酸盐增溶相关的基因中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因，其中步骤a)-d)在计算机中进行；以及
e)在体内制造重塑的微生物细胞，所述重塑的微生物细胞包含所选择的调控基因序列与所选择的与磷酸盐增溶相关的基因的可操作的连接，由此改善所述与磷酸盐增溶相关的基因的表达。
136.一种用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的计算系统，其包括：
a)一个或多个处理器；和
b)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器可操作地耦合至所述一个或多个处理器并且具有存储在其上的指令，所述指令在由所述一个或多个处理器执行时使得所述系统：
i.获取多个微生物全基因组序列；
ii.鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；
iii.鉴别选自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；以及
iv.从所述多个调控基因序列和所述多个与磷酸盐增溶相关的基因中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因。
137.一种用于合理改善植物相关微生物以增溶磷酸盐的计算方法，所述方法包括：
a.激活计算机系统，所述计算机系统包括一个或多个处理器和一个或多个存储器，所述一个或多个存储器可操作地耦合至所述一个或多个处理器并且包括存储在其上的指令，由此使得所述一个或多个处理器执行所述指令，并且使得所述系统：
i.获取多个微生物全基因组序列；
ii.鉴别在代谢相关的环境条件下主动调控基因转录的多个调控基因序列；
iii.鉴别来自由以下组成的组的多个与磷酸盐增溶相关的基因：非特异性酸性磷酸酶、植酸酶、葡糖酸生物合成基因、葡糖酸转运蛋白、葡糖酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，以及它们的任何组合；
iv.从所述多个中选择出调控基因序列和与磷酸盐增溶相关的基因；以及
b.在体内制造重塑的微生物细胞，所述重塑的微生物细胞包含所选择的调控基因序列与所选择的与磷酸盐增溶相关的基因的可操作的连接，由此改善所述与磷酸盐增溶相关的基因的表达。
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