CN112940964B - 一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用 - Google Patents

一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于土壤修复技术领域，具体公开了一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用。所述微生物菌剂以产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)为主要菌种。产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)在喀斯特石漠化地区具有高丰度，而在自然林中几乎不存在。该菌菌能够溶解无机磷和固定N2，因此提供了可利用的磷和氨，极大得促进了植物在干旱胁迫条件下的生长。将该菌制备为菌剂并广泛用于喀斯特石漠化环境中，可有效改善土壤环境，并加强植物与土壤之间的联系，增强土壤的保水能力，对喀斯特槽谷区的农业、经济和环境具有非常重要的意义。

Description

一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用
技术领域
本发明涉及土壤修复技术领域，特别是涉及一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用。
背景技术
喀斯特地貌约占世界总土地面积的15％，主要由含有大量碳酸盐矿物的碳酸钙岩石组成。岩溶环境中碳酸盐岩的风化会影响土壤、大气和生物的地球化学组成、物质和能量转移。岩石喀斯特地形的石漠化导致土地退化，出现严重的水土流失、基岩的大量暴露以及石漠状景观，这些现象使得植被难以恢复。喀斯特生态系统中出现石漠化的原因在于人为干扰和自然因素，人为干扰是由于人口规模增加和土地过度使用产生的压力造成的，而自然因素诸如降水量集中和植被覆盖率低等。
为了改善土被不连续、土壤瘠薄和保水能力差等土壤环境的现状，目前有人研发了出了土壤改良微生物菌剂，如芽孢杆菌，根据芽孢杆菌研发出的微生物菌剂虽然能对土壤进行生态修复，但是该细菌需要荚膜才能长期存活，并不太适合于喀斯特槽谷区的石漠化土壤。
假单胞菌(Pseudomonas)是自然界普遍存在的细菌，具有多变的代谢能力，能够对多种有机化合物进行代谢，在碳循环中占有重要的生态地位。目前，世界各地对假单胞菌进行了大量的研究报道，涉及领域包括农作物病害生物防治的应用、植物生长调节、杀虫、环境净化和医药研发等，假单胞菌(Pseudomonas)主要包括铜绿假单胞(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)等种类。其中，产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)归属于荧光假单胞菌组(Pseudomonas fluorescens)，具有分泌铁载体(Siderophores)的能力，降解污染土壤中对人类身体健康的有毒物质-砷(Nairet al.2007)；中国专利CN105255794A公开了一种假单胞菌NT-2(保藏编号：CGMCCNo.11585)，其作为酸性土壤改良剂，能够调节土壤pH值，促进土壤团粒结构的形成，改善土壤的物理性状，促进植物的生长；中国专利CN111778183A公开了一种嗜酸产氮假单胞菌CLP-10(保藏编号：CGMCC No.1.17726)，适用于酸性土壤条件下烟草真菌、细菌病害的生物防治，同时促进烟草植株具高效利用氮元素和有益于营养生长，在烟草生长、真菌和细菌根茎病害防治方面具有重要的应用价值。上述三个假单胞菌/产氮假单胞菌在土壤修复方面均具有很大的应用潜力，但发明人发现，产氮假单胞菌尚未有应用于喀斯特槽谷区石漠化土壤生态修复上的报道。因此，为了改善喀斯特槽谷区土被不连续、土壤瘠薄和保水能力差等土壤环境的现状，迫切需要寻找和研制出合适的微生物菌剂来对喀斯特槽谷区石漠化土壤进行生态修复。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用，用于解决喀斯特槽谷区土壤石漠化的问题，改善喀斯特槽谷区土被不连续、土壤瘠薄和保水能力差等土壤情况。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有产氮假单胞菌和/或产氮假单胞菌的代谢物，所述微生物菌剂应用于改良喀斯特槽谷区的石漠化土壤，所述产氮假单胞菌已于1994年4月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其生物保藏编号为CGMCC No.1.1792。
本发明第二方面提供一种如第一方面所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述产氮假单胞菌接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中，培养至对数生长期，震荡培养，获得种子液；
(2)将步骤(1)培养好的种子液接种于Luria-Bertani液体培养基中，进行发酵，发酵结束后，所得培养液即为所述微生物菌剂。
进一步，所述步骤(1)中，培养至对数生长期时，菌量为1.0×108～1.0×109CFU/mL。
进一步，所述步骤(1)中，所述Luria-Bertani(LB)培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
进一步，所述步骤(1)中，培养条件为：温度28-30℃、转速150-200rpm，培养时间24-36h。
进一步，所述步骤(2)中，种子液在Luria-Bertani液体培养基中的接种量为1-5％。
进一步，所述步骤(2)中，发酵条件为：初始pH 7.0，温度28-30℃，转速150-200rpm，发酵24-36h。
本发明第三方面提供根据第一方面所述的微生物菌剂和/或根据第二方面所述的方法制备得到的微生物菌剂在喀斯特槽谷区石漠化土壤改良修复上的应用。
进一步，所述微生物菌剂的应用方法为：
(1)将所述微生物菌剂稀释后，均匀喷施在土壤中，所述土壤为喀斯特槽谷区石漠化土壤；
(2)1-3个月后，再次喷洒稀释后的微生物菌剂。
进一步，所述步骤(1)和(2)中，所述微生物菌剂用水进行稀释，微生物菌剂与水的质量比为1∶200-400，优选为1∶300。
进一步，所述步骤(1)和(2)中，将稀释后的微生物菌剂按60-100ml/亩的用量均匀喷施到土壤中，优选为80ml/亩。
进一步，所述步骤(1)和(2)中微生物菌剂的稀释比例和用量相同。
进一步，所述步骤(1)中，在喷洒微生物菌剂前，先对土壤进行翻整，保持土壤透气性，保持环境温度为20-30℃，并做好遮阳措施。
进一步，所述应用方法还包括步骤(3)：播种或种植植物。将所述微生物菌剂与植物配合使用，利用二者的协同作用可进一步提高土壤修复效果。
可选地，所述步骤(3)中，播种时先将植物种子浸入细菌悬液中，然后播种。
进一步，所述植物为灌草植物和/或草本植物，例如：活血丹(Glechomalongituba)，黑麦草(Lolium perenne L.)等。
进一步，所述喀斯特槽谷区为贵州的喀斯特槽谷区；优选地，所述喀斯特槽谷区为贵州印江流域的喀斯特槽谷区。
本发明第四方面提供根据第一方面所述的产氮假单胞菌和/或所述产氮假单胞菌的代谢物在喀斯特槽谷区石漠化土壤改良上的应用。
如上所述，本发明的喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用，具有以下有益效果：
本发明的微生物菌剂以产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)为主要菌种，产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)在喀斯特石漠化地区具有高丰度，而在自然林中几乎不存在，且该菌能够溶解无机磷和固定N2，因此为植物提供了可利用的磷和氨，极大地促进了植物在干旱胁迫条件下的生长；将该菌制备为菌剂并广泛应用于喀斯特石漠化环境中，可改善土壤环境，并加强植物与土壤之间的联系，增强土壤的保水能力，对喀斯特槽谷区的农业、经济和环境具有非常重要的意义。本发明具有以下优点：
1、本发明所选择的产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)不需要荚膜都能长期存活，是一种天然的土壤细菌，可以很好地抵抗一些不利生长的环境条件，如干旱环境、重金属污染土壤等。
2、本发明适用于喀斯特石漠化地区土壤改良，产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)是相比于非喀斯特地貌，仅存在于喀斯特槽谷区中且大量存在的一种天然土壤细菌。
3、本发明微生物菌剂不仅具有溶解无机磷和固定N2，为植物的生长提供可利用的磷和氨，能够帮助植物在石漠化地区更好地生存。
4、在治理喀斯特槽谷区石漠化环境时，本发明的微生物菌剂可以与某些植物配合使用，利用二者协同作用，进一步提高土壤修复效果。
附图说明
图1显示为喀斯特石漠化地区和非喀斯特地区的土壤细菌组成图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明基于喀斯特槽谷区土被不连续、土壤瘠薄和保水能力差等土壤情况，提供一种高效、安全、能够改善其土壤保水能力差、植被稀少状况的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有产氮假单胞菌和/或产氮假单胞菌的代谢物，所述产氮假单胞菌已于1994年4月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其生物保藏编号为CGMCC No.1.1792。
产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)是发明人在中国普通微生物菌种保藏管理中心中保藏的细菌中筛选出来的，该菌是一种革兰氏阴性细菌，可感染谷物，尤其是大米，同时对水稻真菌病原体富士镰刀菌具有很强的抑制活性，因此它是一种潜在的生物防治剂，可以保护水稻免受巴卡内氏病的侵害。
本发明研究了喀斯特石漠化地区和非喀斯特地区的土壤细菌组成，其结果如图1所示。其中，A，B，C，D表示喀斯特石漠化地区不同植被情况下土壤细菌的相对丰度(A：马尾松林；B：灌丛；C：桃树林；D：裸土)；E表示非喀斯特地区的土壤细菌相对丰度。其中，uncultured acidobacteraceae_bacterium为未培养的酸杆菌科细菌，unculturedproteo_bacterium为未培养的蛋白细菌，uncultured forest_soil_bacterium为未培养的森林土壤细菌，uncultured chloroflexi_bacterium为未培养的绿弯菌，unculturedacidobacteriales_bacterium为未培养的酸性细菌，uncultured action_bacterium为未培养的放线菌，uncultured soil_bacterium为未培养的土壤细菌，unculturedacidobacteria bacterium为未培养的酸性细菌，pseudomonas azotoformans为产氮假单胞菌。
从图1中发现，喀斯特石漠化地区不同植被情况下的土壤中均含有产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)，而非喀斯特地区的土壤不含有产氮假单胞菌，且产氮假单胞菌(CGMCCNo.1.1792)在马尾松林(生态恢复几十年后形成的次生林)土壤中丰度最高。
本发明发现产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)在喀斯特槽谷区典型土壤类型(马尾松林、灌丛、桃树林、裸土)中广泛分布，且相比于非喀斯特地区(自然林)具有高丰度。其中，马尾松林是喀斯特槽谷区人工林恢复几十年的结果，产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)在马尾松林土壤中丰度最高，因此我们认为该菌具有修复喀斯特槽谷区石漠化环境的潜力。此外，产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)能够溶解无机磷和固定N2，因此可为植物提供可利用的磷和氨，极大地促进植物在干旱胁迫条件下的生长。产氮假单胞菌(CGMCCNo.1.1792)能够减少干旱胁迫对植物的有害影响，增加叶绿素含量和植物叶片的相对含水量，以及增强抗氧化剂酶的积累，同时减少了脯氨酸的积累和植物膜脂的氧化损伤。简而言之，产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)增强了干旱胁迫下的植物性能，并使植物能够获取更多的水和矿物质养分。因此，本发明将该细菌菌株用作在石漠化环境中，以改善土壤环境，并加强植物与土壤之间的联系，增强土壤的保水能力，改善土壤石漠化程度。与土壤改良菌剂中经常使用的芽孢杆菌相比，该细菌不需要荚膜都能长期存活，而是一种天然的土壤细菌，可以很好地抵抗一些不利生长的环境条件。而且，该菌是相比于非喀斯特地貌，仅存在于喀斯特槽谷区中且大量存在的一种天然土壤细菌。
本发明所述的微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期(菌量为1.0×108～1.2×109CFU/mL)，震荡培养，培养条件为：温度28-30℃、转速150-200rpm，培养时间24-36h，获得种子液。
(2)按照接种量为1-5％将步骤(1)培养好的种子液接种于LB液体培养基中，进行发酵，发酵条件为：初始pH 7.0，温度28-30℃，转速150-200rpm，发酵24-36h，发酵结束后，所得培养液即为所述微生物菌剂。具体的，步骤(1)中，Luria-Bertani(LB)培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。本发明的微生物菌剂在喀斯特槽谷区石漠化土壤改良修复上的应用方法为：
(1)对土壤进行翻整，保持土壤透气性，保持环境温度为20-30℃，并做好遮阳措施。
(2)将微生物菌剂用水稀释(稀释比为1∶200-400)后，按60-100ml/亩的用量均匀喷施在土壤中。
(3)1-3个月后，再次喷洒稀释后的微生物菌剂。
具体的，步骤(3)中微生物菌剂的稀释比例和用量与步骤(2)相同。
为了进一步提高土壤修复效果，所述应用方法还包括在喀斯特槽谷区土壤上播种或种植植物，所述植物为灌草植物和/或草本植物，例如：活血丹(Glechoma longituba)，黑麦草(Lolium perenne L.)等。播种时先将植物种子浸入细菌悬液(OD600＝1.5)中，然后播种。
具体的，细菌悬液为产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)和LB培养基中的混合物，或称为细菌菌液，使用时，需要搅拌一下，保证细菌不会聚团沉底。
将所述微生物菌剂与植物配合使用，利用二者的协同作用可进一步提高土壤修复效果。
下面通过具体的实施例来对本发明的内容进行进一步说明。
实施例1
制备微生物菌剂，步骤如下：
(1)将产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期(菌量约1.0×108CFU/mL)，震荡培养，培养条件为温度28-30℃、转速180rpm，500mL三角瓶装液量200mL，培养时间30h。
(2)按照3％接种量将培养好的种子液接种于LB培养基液体培养基中，初始pH7.0，温度28-30℃，转速180rpm，发酵30h。
(3)发酵结束后，所得的培养液即为微生物菌剂。
其中，Luria-Bertani(LB)培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。
实施例2
制备微生物菌剂，步骤如下：
(1)将产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，培养至对数生长期(菌量约1.0×108 CFU/mL)，震荡培养，培养条件为温度28-30℃、转速150rpm，500mL三角瓶装液量150mL，培养时间36h。
(2)按照1％接种量将培养好的种子液接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，初始pH 7.0，温度28-30℃，转速150rpm，发酵36h。
(3)发酵结束后，所得的培养液即为微生物菌剂。
实施例3
制备微生物菌剂，步骤如下：
(1)将产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，培养至对数生长期(菌量约1.0×108 CFU/mL)，震荡培养，培养条件为温度28-30℃、转速200rpm，500mL三角瓶装液量250mL，培养时间24h。
(2)按照1-5％接种量将培养好的种子液接种于LB液体培养基(与实施例1相同)中，初始pH 7.0，温度28-30℃，转速200rpm，发酵24h。
(3)发酵结束后，所得的培养液即为微生物菌剂。
实施例4
选择贵州印江流域的喀斯特槽谷区石漠化土壤，将实施例1-3中的微生物菌剂用于改良该地区土壤，具体使用方法如下：
(1)用旋耕机翻整土地，保持土壤透气性。
(2)选择环境温度在20-30℃，做好遮阳措施，将上述微生物菌剂与水按1∶300的质量比进行稀释，将稀释后的微生物菌剂按80ml/亩的用量均匀喷施到土壤中。
(3)2个月后，将步骤(2)喷施了微生物菌剂的土壤再均匀喷洒一次微生物菌剂，用量和用法与步骤(2)相同。
(4)将黑麦草的植物种子浸入细菌悬液(OD600＝1.5)中，然后播种。
对比例1
在实施例4中的土壤上，选用普通氮肥(尿素，氮含量＞46.4(％)灵寿县光辉矿产品加工有限公司)，由芽孢杆菌制成的微生物菌剂，按照实施例4的方法改良土壤。
表1不同微生物菌剂/肥料的土壤改良情况结果
Figure BDA0002924895430000071
由表1可知，相较于施用普通肥料或由芽孢杆菌制成的微生物菌剂，施用实施例1-3中的微生物菌剂，能使土壤的含水量、相对含水量得到更显著地提升，土壤的含水量最高增加了4.60％，土壤相对含水量最多增加了15％(实施例1)，这表明施用本发明的微生物菌剂能能显著增加土壤的有效水分，有效改善喀斯特土壤干旱的情况，增加植被生存所需的水分。同时，相较于施用普通肥料或由芽孢杆菌制成的微生物菌剂，施用实施例1-3中的微生物菌剂，土壤pH得到了更显著地降低，这表明施用本发明的微生物菌剂能能改变喀斯特土壤碱性的特征，有助增加土壤微生物的多样性，从而促进植被的生存与生长。其中，土壤pH的降低依赖于产氮假单胞菌的解磷、固氮和产氨的过程。
综上所述，本发明将产氮假单胞菌(CGMCC No.1.1792)制成微生物菌剂，利用其解磷、固氮和产氨的特性来促进植物生长，可提高植物的存活，提高土壤中磷和氮的有效利用，改善土壤质量，对喀斯特槽谷区的农业、经济和环境具有非常重要的意义。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种微生物菌剂在喀斯特槽谷区石漠化土壤改良修复上的应用，其特征在于，所述微生物菌剂含有产氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans)），或者，所述微生物菌剂含有产氮假单胞菌和产氮假单胞菌的代谢物，所述微生物菌剂应用于改良喀斯特槽谷区的石漠化土壤，所述产氮假单胞菌已于1994年4月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其生物保藏编号为CGMCC No.1.1792。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述产氮假单胞菌接种于Luria-Bertani液体培养基中，培养至对数生长期，震荡培养，获得种子液；
(2)将步骤(1)培养好的种子液接种于Luria-Bertani液体培养基中，进行发酵，发酵结束后，所得培养液即为所述微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中，培养至对数生长期时，菌量为1.0×108～1.0×109CFU/mL；
和/或，所述步骤(1)中，所述Luria-Bertani液体培养基成分组成及制备方法为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；
和/或，所述步骤(1)中，培养条件为：温度28-30℃、转速150-200rpm，培养时间24-36h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中，种子液在Luria-Bertani液体培养基中的接种量为1-5％；
和/或，所述步骤(2)中，发酵条件为：初始pH 7.0，温度28-30℃，转速150-200rpm，发酵24-36h。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的应用方法为：
(1)将所述微生物菌剂稀释后，均匀喷施在土壤中，所述土壤为喀斯特槽谷区石漠化土壤；
(2)1-3个月后，再次喷洒稀释后的微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中，所述微生物菌剂用水进行稀释，微生物菌剂与水的质量比为1:200-400；
和/或，所述步骤(1)和(2)中，将稀释后的微生物菌剂按60-100ml/亩的用量均匀喷施到土壤中；
和/或，所述步骤(1)和(2)中微生物菌剂的稀释比例和用量相同；
和/或，所述步骤(1)中，在喷洒微生物菌剂前，先对土壤进行翻整，保持土壤透气性，保持环境温度为20-30℃，并做好遮阳措施。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用方法还包括步骤(3)：播种或种植植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤(3)中，播种时先将植物种子浸入细菌悬液中，然后播种；
和/或，所述喀斯特槽谷区为贵州的喀斯特槽谷区。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述植物为灌草植物和/或草本植物。
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