CN105274200A - 一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用，其包括包含SEQ？ID？01所示序列的上游引物、包含SEQ？ID？02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照。本发明的试剂盒中的特异性引物为针对铜绿假单胞菌的O～抗原乙酰化酶基因所设计，可有效区分铜绿假单胞菌和其他常见致病菌(包括19种假单胞属的其他种)，实现铜绿假单胞菌的快速、高可信度检测。

Description

一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，又名绿脓杆菌，为专性需氧、非发酵型革兰氏阴性杆菌。该菌广泛分布于水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等潮湿环境中，是一种重要的机会致病菌，经常引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，甚至引发败血症和菌血症，严重时可导致死亡。
鉴于其对人类健康的严重威胁，国内外对生活饮用水、天然矿泉水、化妆品等产品中均对铜绿假单胞菌进行了严格的“不得检出”限量。2015年5月24日，我国实施了包装饮用水新标准《GB19298～2014》，其中微生物指标中亦将铜绿假单胞菌纳入，限定取样5个且每个样均要求250mL水中不得检出铜绿假单胞菌。自此，饮用水中铜绿假单胞菌的限量不止于天然饮用矿泉水，而是囊括了所有可直接饮用的包装饮用水。
目前，对于铜绿假单胞菌的检测，国内外仍多沿用传统的培养、分离及生化鉴定法，耗时长达3～5d、操作繁琐、准确度低，难以满足快速检测的需求。而以PCR技术为代表的现代分子生物学方法，通过特异引物在热循环仪中对靶标基因片段进行指数倍增、信号放大，已成为致病菌快速检验的理想之选。对于具有重要卫生学及病理学研究意义的铜绿假单胞菌，国内外研究者多年来一直致力于其PCR鉴定的靶基因及引物序列的筛选，常用的序列包括16SrDNA、16S～23SrDNAITS、oprI、oprL、fliC、gyrB、ecfX等，但其可靠度及重复性不理想，不同报道间说法不一，在实际操作中的存在一定的疑虑。因此，亟需设计、筛选靶向于铜绿假单胞菌的高特异性引物及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种铜绿假单胞菌检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的应用方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，包括包含SEQID01所示序列的上游引物、包含SEQID02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照，该试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR反应的扩增温度程序如下：94～95℃预变性5～5.5min；94～95℃变性1～1.5min、60～62℃退火30～35s、72～73℃延伸15～20s，35～38个循环；72～73℃再延伸7～8min。
进一步优选的，所述PCR反应的扩增温度程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火30s、72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸7min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10～12g、氯化钠10～12g、酵母提取物5～7g、十六烷三甲基溴化铵0.2～0.4g和萘啶酮酸0.015～0.025g。
进一步优选的，所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、十六烷三甲基溴化铵0.2g和萘啶酮酸0.015g。
一种应用上述铜绿假单胞菌检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用所述选择性增菌液扩大培养待测样品，然后提取DNA作为待测模板；
(2)将待测模板、阳性对照、阴性对照和空白对照分别进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将待检样品用所述选择性增菌液37℃培养12h，取出1mL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入100μL灭菌生理盐水，沸水浴10min，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为待测模板。
本发明的有益效果是：
1、本发明的试剂盒中的特异性引物为针对铜绿假单胞菌的O～抗原乙酰化酶基因所设计，可有效区分铜绿假单胞菌和其他常见致病菌(包括19种假单胞属的其他种)，实现铜绿假单胞菌的快速、高可信度检测；
2、本发明的试剂盒的检测方法灵敏度高、特异性强、检测时间短的特点，适用于疾控、质监、医院等部门用于饮用水、食品、化妆品及病理样本中铜绿假单胞菌的快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例2中引物特异性验证结果。其中M为100bpMarker,1～6为铜绿假单胞菌标准菌株及经确诊的分离株，7～25为假单胞属的其他菌，26～33为其他致病菌，34为空白对照(双蒸水为模板)具体菌株名称见实施例1；
图2为本发明实施例3中10个瓶/桶装饮用水样PCR扩增结果。其中1～10为10个供试样水，M为100bpMarker,11～13分别为阳性对照、阴性对照和空白对照。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，包括如SEQID01所示序列的上游引物、如SEQID02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照，该试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
上述PCR反应的扩增温度程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火30s、72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸7min。
上述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、十六烷三甲基溴化铵0.2g和萘啶酮酸0.015g。
应用上述铜绿假单胞菌检测试剂盒进行检测的方法，具体包括如下步骤：
(1)用所述选择性增菌液扩大培养待测样品，然后提取DNA作为待测模板：将待检样品用所述选择性增菌液37℃培养12h，取出1mL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入100μL灭菌生理盐水，沸水浴10min，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为待测模板；
(2)将待测模板、阳性对照、阴性对照和空白对照分别进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：取PCR产物5μL，于1％琼脂糖凝胶中120V电泳15min，而后利用凝胶成像系统观察、拍摄，所获得的特征性片段的大小为268bp。
实施例2：本发明中检测引物的特异性验证。
本实施例分别提取6株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、ATCC15442、ATCC9027、CGMCC1.10274、CGMCC1.10452、XMZJ～1(实验室分离，经VITEK2Compact鉴定确证为铜绿假单胞菌)、19株假单胞属的其他细菌[产氮假单胞菌(P.azotoformans)CGMCC1.1792、霉味假单胞菌(P.mucidolens)CGMCC1.1795、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)CGMCC1.3361、恶臭假单胞菌(P.putida)CGMCC1.3301、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)CGMCC1.2935、施氏假单胞菌(P.stutzeri)CGMCC1.3340、门多萨假单胞菌(P.mendocina)CGMCC1.2965、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)CGMCC1.4995、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)CGMCC1.2887、菊苣假单胞菌(P.cichorii)CGMCC1.4934、变黄假单胞菌(P.flavescens)CGMCC1.6138、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)CGMCC1.6143、杰氏假单胞菌(P.jessenii)CGMCC1.8855、栖麦假单胞菌(P.oryzihabitans)CGMCC1.3158、丁香假单胞菌(P.syringae)CGMCC1.3305、浅绿黄假单胞菌(P.viridiflava)CGMCC1.3180、腐臭假单胞菌(P.CGMCC1.3356)CGMCC1.3356、隆德假单胞菌(P.lundensis)CGMCC1.8731、荧光假单胞菌(P.fluorescens)CGMCC1.6279]、8株其他致病菌[金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26112、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactermuytjensii)ATCC51329、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC17802、单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19115、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaser.ParatyphiA)CMCC50001、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ATCC19258、溶血性链球菌(Streptococcuspyogenes)CMCC32201、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)CMCC44113]的DNA作为模板，同时以双蒸水替代细菌DNA作为空白对照，进行PCR反应，验证本发明实施例1中引物的特异性。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、梯度PCR扩增仪(Veriti，美国ABI公司)、电泳仪(TanonEPS300,上海天能科技有限公司)、凝胶成像仪(Tanon3500,上海天能科技有限公司)等。
检测用主要试剂：
PCR反应试剂(10×PCRbuffer、Mg2+、dNTP和Taq酶)购自TAKARA公司；肉浸液肉汤购自北京陆桥公司。
检测主要步骤：
1)细菌DNA的提取
本实施例供试菌共30株，分别接种至2mL肉浸液肉汤中，于37℃培养24h,取选择性增菌液1mL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入200μL灭菌生理盐水，沸水浴10min，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为PCR反应的模板。
3)PCR扩增
在0.2mLPCR反应管中按如下体系加入各反应试剂：反应体系25μL
按如下程序，于梯度PCR仪上进行扩增：
94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火30S、72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸7min。
4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
取PCR产物5μL，于1％琼脂糖凝胶中120V电泳15min，而后利用凝胶成像系统观察、拍摄，所获得的特征性片段的大小为268bp。
结果如图1所示，仅6株铜绿假单胞菌中扩增出预期大小的目的片段，19株其他假单胞菌和8株其他致病菌均未扩增得任何条带，空白对照中未见任何扩增产物，表明本发明设计的引物对铜绿假单胞杆菌高度特异。
实施例3：瓶装饮用纯净水中铜绿假单胞菌的检测。
本实施例使用本发明实施例1的特异性引物及PCR法对市售瓶、桶装饮用纯净水10份进行检测，同时对比传统检测方法(GB19298～2014)的平行检测结果，验证本发明建立的检测方法的可靠性。
所使用的引物及PCR方法同实施例1。
所使用的主要检测仪器：
Milliflex～plus微生物过滤系统(德国Millipore公司)、带0.45μm孔径滤膜的250mL过滤杯、微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、梯度PCR扩增仪(Veriti，美国ABI公司)、电泳仪(TanonEPS300,上海天能科技有限公司)、凝胶成像仪(Tanon3500,上海天能科技有限公司)等。
检测用主要试剂：
PCR反应试剂(10×PCRbuffer、Mg2+、dNTP和Taq酶)购自TAKARA公司；假单胞菌琼脂基础培养基、萘啶酮酸添加液购自北京陆桥公司。
检测主要步骤：
1)水样过滤
取供试10种瓶/桶装水样各250mL,于Milliflex过滤系统上滤过0.45μm滤膜。
本发明PCR法：将滤膜放入50mL选择性增菌液中，于37℃培养12h。
传统方法：将滤杯中的滤膜贴于CN培养基表面培养，37℃培养24～48h。
2)细菌DNA的提取
取增菌培养液1mL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入200μL灭菌生理盐水，沸水浴10min，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为PCR反应的模板。
3)PCR扩增
在0.2mLPCR反应管中按如下体系加入各反应试剂：反应体系25μL
按如下程序，于梯度PCR仪上进行扩增：
94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火30S、72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸7min。
注：每次PCR反应均同时设置阳性对照(铜绿假单胞菌DNA)、阴性对照(荧光假单胞菌DNA)和空白对照(ddH2O)同步进行PCR，以验证结果的可靠性。
4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
取PCR产物5μL，于1％琼脂糖凝胶中120V电泳15min，而后利用凝胶成像系统观察、拍摄，所获得的特征性片段的大小为268bp。
结果如图2所示，所有水样以本发明建立的PCR法均未检出铜绿假单胞菌(阳性对照能扩增得预期大小的目的条带)，同时传统方法亦显示阴性结果，二者结果完全吻合。
本领域技术人员可知，本发明的技术参数在下述范围内变化时，仍能得到与上述实施例相同或相近的技术效果：
一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，包括包含SEQID01所示序列的上游引物、包含SEQID02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照，该试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
所述PCR反应的扩增温度程序如下：94～95℃预变性5～5.5min；94～95℃变性1～1.5min、60～62℃退火30～35s、72～73℃延伸15～20s，35～38个循环；72～73℃再延伸7～8min。
所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10～12g、氯化钠10～12g、酵母提取物5～7g、十六烷三甲基溴化铵0.2～0.4g和萘啶酮酸0.015～0.025g。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：包括包含SEQID01所示序列的上游引物、包含SEQID02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照，该试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
2.如权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
3.如权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应的扩增温度程序如下：94～95℃预变性5～5.5min；94～95℃变性1～1.5min、60～62℃退火30～35s、72～73℃延伸15～20s，35～38个循环；72～73℃再延伸7～8min。
4.如权利要求3所述的一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应的扩增温度程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min、60℃退火30s、72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸7min。
5.如权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10～12g、氯化钠10～12g、酵母提取物5～7g、十六烷三甲基溴化铵0.2～0.4g和萘啶酮酸0.015～0.025g。
6.如权利要求5所述的一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征在于：所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、十六烷三甲基溴化铵0.2g和萘啶酮酸0.015g。
7.一种应用权利要求1至6中任一权利要求所述的铜绿假单胞菌检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)用所述选择性增菌液扩大培养待测样品，然后提取DNA作为待测模板；
(2)将待测模板、阳性对照、阴性对照和空白对照分别进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将待检样品用所述选择性增菌液37℃培养12h，取出1mL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入100μL灭菌生理盐水，沸水浴10min，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为待测模板。
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