CN102146478B - 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒，其包含SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸和PCR反应试剂。所述PCR试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，54.5℃退火20秒，72℃延伸40秒，24个循环，延伸1分钟。本发明制备的试剂盒使用简单、成本低，只需要普通的PCR仪和凝胶电泳设备，每次检测的消耗也只有基本的PCR反应试剂和引物。可以直接针对单个菌落进行鉴定，不需要提取高纯度的全基因组作为模板，大大缩短了整个鉴定过程的时间，适合广泛的推广。

Description

一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种PCR试剂盒，尤其涉及一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒。

背景技术

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)是一种重要的人畜共患传染病病原体，主要引起宿主类鼻疽病，其临床表现为脑炎、前列腺及肝脾等内脏的全身多种脏器的脓肿，此外它还能引起难治性肺炎、严重菌血症、败血症等严重并发症，死亡率高达90％。该菌感染主要流行于澳大利亚北部、泰国和新加坡等热带地区。就我国而言，广东、广西、海南及附属岛屿是类鼻疽发病的重灾区，该菌感染已经成为严重的公共卫生问题。

类鼻疽为严格的胞内感染菌，其为两端钝圆、两极浓染、无芽孢、有鞭毛和菌毛的革兰氏阴性杆菌。该菌通过气溶胶或者带菌液体的形式通过粘膜粘附和创面直接感染人体后，利用其荚膜、脂多糖、鞭毛、菌毛、分泌系统及其效应蛋白等独力因子，逃逸机制阻止内吞体与溶酶体的融合以及对吞噬体环境的修饰，将巨噬细胞、中性粒细胞甚至非吞噬细胞作为复制、生存的生境和营养来源，破坏宿主的胞浆免疫和适应性免疫，最终引起宿主严重的感染性疾病。

对病原体类鼻疽伯克霍尔德菌快速的诊断是治疗和预防类鼻疽病及并发症的关键。而目前尚无较好的方法用于该菌诊断和鉴别。对类鼻疽伯克霍尔德菌的细菌学鉴定主要依靠传统的细菌培养和生化方法鉴定，按照伯杰氏细菌手册的要求，观察细菌在培养过程中特异的菌落形态、气味、氧化酶实验、动力实验等生化反应特点。该方法的主要缺点是周期长、对鉴定操作人员要求较高、无法普遍推广，此外对类鼻疽伯克霍尔德菌的培养需要在生物三级安全实验室中进行，大大限制该方法在基层医疗单位中开展。已经有学者通过分子生物学的手段对类鼻疽伯克霍尔德菌进行细菌学的鉴定。这些方法主要包括针对16SrRNA、23S rDNA和III型分泌系统的Real-time PCR(Chantratita，N，et al Am J TropMed Hyg，2007；Clarridge，J.E.，et al，Clin Microbiol Rev，2004；Gee，J.E.，et al，JClin Microbiol，2003)。由于这些方法重复性有限、且需要昂贵的定量PCR设备等问题，使其离临床应用还有一定的距离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒，其包含SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸，该核苷酸可作为引物。该试剂盒还包含PCR反应试剂。

所述的PCR试剂盒，其PCR反应试剂包括：0.5mMdNTP，20mM Trish-HCl(pH8.3)，100mM KCl，3mM MgCl2，DNA ExTaq Polymerase(2.5U/ul)。

所述PCR试剂盒的PCR反应的退火温度为50.0℃-57.5℃；退火时间为20-60秒；PCR反应循环数为16-30个。

优选地，所述PCR试剂盒的PCR反应的退火温度为54.5℃；退火时间为20秒；PCR反应循环数为24个。

最佳地，所述PCR试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，54.5℃退火20秒，72℃延伸40秒，24个循环，延伸1分钟。

本发明还涉及SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸在制备用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒中的应用。其中，所述核苷酸用作引物。该引物用于扩增类鼻疽伯克霍尔德菌16S rRNA编码基因的771-1193片段。

所述鼻疽伯克霍尔德菌16S rRNA编码基因的771-1193片段的序列如SEQID NO：3所示。

本发明的优点是：本发明制备的试剂盒使用简单、成本低，只需要普通的PCR仪和凝胶电泳设备，每次检测的消耗也只有基本的PCR反应试剂和引物。可以直接针对单个菌落进行鉴定，不需要提取高纯度的全基因组作为模板，大大缩短了整个鉴定过程的时间，适合广泛的推广。

本发明所述PCR试剂盒完成鉴定时所需时间短，由于试剂盒所包含的引物具有高度的特异性，其不需要提取高纯度的全基因组作为模板，可以直接针对单个菌落进行鉴定。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1A至图1C是PCR检测方法的优化；其中图1A是火温度优化：泳道1-6的退火温度分别为50.0℃、51.5℃、53.0℃ 54.5℃ 56.0℃ 57.5℃；图1B是退火时间优化：泳道1-5的退火时间分别为20s、30s、40s、50s、60s；图1C是循环数优化：泳道1-10的PCR反应循环数分别为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30，其中的M：DNA标准Marker。

图2是PCR检测方法特异性检测；其中M：DNA标准；泳道1-8使用的模板为大肠杆菌、痢疾致贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌。

图3是PCR检测方法用于检测临床分离的类鼻疽假单胞菌；其中M：DNA标准；泳道1-10以提取的全基因组为模板：泳道1为K96243菌株、泳道2-9分别为8株临床分离株、泳道10为阴性对照；泳道11-20以单个菌落为模板：泳道11为K96243菌株、泳道12-19分别为8株临床分离株、泳道20为阴性对照。

具体实施方式

下面提供的实施例用于进一步阐明本发明，而不构成对本发明范围的限制。

实施例1特异PCR检测方法的建立和优化

1.实验方法

设计引物(SEQ ID NO1：5’AGTCCACGCCCTAAACGA 3’；SEQ ID NO2：5’TGTGAAGCCCTACCCATAA 3’)，扩增16S rRNA编码基因(Accession number：AY305764)的771-1193片段(5’AGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGCCCGATGAGAGTTGGGCGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACA3’)。用细菌基因组提取试剂盒(北京天根)提取类鼻疽伯克霍尔德菌国际标准菌株K96243(ATCC 23344)全基因组作为模板，使用本发明所述用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR反应试剂盒(本发明所述用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR反应试剂盒的组成为：引物20pM，0.5mMdNTP，20mMTrish-HCl(pH8.3)，100mM KCl，3mM MgCl2，DNA ExTaq Polymerase，2.5U/ul)，总体系25μl。分别对PCR反应的退火温度、退火时间、循环数进行优化。退火温度梯度为50.0℃、51.5℃、53.0℃、54.5℃、56.0℃、57.5℃；退火时间分别为20s、30s、40s、50s、60s；PCR反应循环数分别为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30个。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后用紫外检测。

2.结果分析

在所设置的6个退火温度50.0℃、51.5℃、53.0℃、54.5℃、56.0℃、57.5℃下，类鼻疽假单胞菌的16S rRNA编码基因的771-1193片段都能特异地被扩增出来(图1A)。选择退火温度为54.5℃，退火时间分别为：20s、30s、40s、50s、60s，片段771-1193都能特异地被扩增出来(图1B)，说明退火温度对所设计的PCR反应无明显影响。

为缩短PCR反应的时间，在选择退火温度54.5℃，退火时间20s条件下，PCR循环数分别为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30个，结果片段771-1193在16个循环后开始出现可见条带(图1C-泳道3)，在24个循环后条带较为明显(图1A-泳道8)。所以得到的最后PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，54.5℃退火20秒，72℃延伸40秒，24个循环，最终延伸1分钟。

实施例2PCR检测方法的特异性分析

1.实验方法

用普通LB培养基培养本室保存的临床常见细菌感染菌株：大肠杆菌K12(ATCC 29055)、痢疾致贺菌(CMCC 51136)、伤寒沙门菌(CVCC 526)、幽门螺旋杆菌(26695)、金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)、甲型链球菌(CMCC 32213)和乙型链球菌(CMCC 32204)。使用细菌基因组提取试剂盒(北京天根)提取上述细菌的全基因组，以此全基因组为模板，PCR反应条件为94℃预变性4min，94℃变性40s，54.5℃退火20s，72℃延伸40s，最终延伸1min。扩增16S rRNA基因771-1193片段，检测此方法的特异性。类鼻疽伯克霍尔德菌株K96243全基因组为阳性对照，PCR产物经1％凝胶电泳检测。

2.结果分析

结果如图2所示：只有类鼻疽假单胞菌模板中扩增出了特异的771-1193基因片段，虽然在3号、5号泳道出现了微弱的特异性条带，但这不会影响阳性结果的判断。这说明此PCR检测方法特异性良好。

实施例3PCR检测方法用于临床分离株的鉴定

1.实验方法

1)临床菌株的分离和鉴定

采8名类鼻疽患者(来自海南医学院附属医院和海南省三亚市人民医院)静脉血20ml，使用美国BD公司的标准需氧培养瓶进行血培养，然后用5％羊血平板分离单个细菌。细菌的鉴定按照伯杰氏细菌鉴定手册进行(第八版)。

2)用普通LB培养基培养临床分离得到的类鼻疽伯克霍尔德菌株菌株，使用细菌基因组提取试剂盒(北京天根)提取上述细菌的全基因组，分别以此全基因组和单个菌落为模板，利用实施例1优化好的PCR反应条件，扩增771-1193片段，以此检测临床分离菌株。类鼻疽伯克霍尔德菌株K96243的全基因组为阳性对照，PCR产物经1％凝胶电泳检测。

2.实验结果

按照伯杰氏细菌手册，对从8名类鼻疽病人血液中培养出的细菌进行了鉴定。这8株细菌革兰染色为阴性，略呈卵圆形杆菌，两端浓染菌体中间着色较淡，无芽胞、无荚膜、有鞭毛。细菌在羊血平板35℃培养24h后形成细小、光滑、湿润、透明的小菌落，48h后菌落逐渐增大，形成不透明灰银色菌落，同时有狭窄的β溶血环，72h后菌落边缘逐渐出现不规则的皱褶，呈蜂窝状或同心圆状，典型的银灰色光泽的菌落，闻及强烈土霉气味。生化特征：氧化酶阳性，不发酵葡萄糖、氧化分解葡萄糖、麦芽糖、木糖、乳糖；还原硝酸盐、分解七叶苷、液化明胶、精氨酸脱氢酶阳性、枸橼酸盐阳性。按照这些结果，结合临床病人资料，按照伯杰氏细菌手册鉴定原则判定此8株细菌为类鼻疽伯克霍德菌。

PCR方法用于临床分离类鼻疽伯克霍德菌的检测的结果如图3所示，所检测的8株类鼻疽伯克霍德菌临床分离株都能扩增出771-1193基因片段，说PCR检测方法的有效性，同时结果发现直接以平板生长的单个菌落为模板时也能有效地扩增目的片段。

本发明以类鼻疽伯克霍尔德菌全基因组为模板，优化特异引物PCR的反应条件(94℃预变性4min，94℃变性40s，54.5℃退火20s，72℃延伸40s，24个循环，最终延伸1min)。得到最优PCR反应条件后，使用常见细菌感染病原体和临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株评价了该方法的特异性和有效性，结果发现该方法能有效鉴别类鼻疽伯克霍尔德菌(参见实施例3)和其它常见细菌感染病原体(参见实施例2)，同时该方法确实有效，能从单个菌落或基因组标本中鉴定临床菌株。

此外，本发明提供的试剂盒的反应时间仅为40分钟，加上凝胶电泳的时间，整个鉴定过程需要不到1个小时的时间。大大缩短了整个鉴定过程的时间，适合广泛的推广。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (3)

1.一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒的引物为SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸，所述PCR试剂盒的PCR反应条件为：94 ℃预变性4分钟，94 ℃变性40 秒，54.5℃退火20 秒，72℃延伸40 秒，24个循环，延伸1 分钟。

2.SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸在制备用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒中的引物的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物用于扩增类鼻疽伯克霍尔德菌16S rRNA编码基因的771-1193片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

 

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