CN111848821B9 - 一种多表位融合抗原及其应用 - Google Patents

一种多表位融合抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多表位融合抗原，由类鼻疽杆菌Hcp1蛋白的若干优势线性抗原表位序列连接构成。本发明还公开了含有该多表位融合抗原的编码基因，及含有所述编码基因的基因表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，并进一步公开了其在制备诊断或治疗类鼻疽杆菌感染的试剂中的应用。本发明提供的多表位融合抗原在针对类鼻疽感染的诊断中具有较好的敏感性和特异性。

Description

一种多表位融合抗原及其应用
技术领域
本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于类鼻疽杆菌的治疗和诊断的多表位融合抗原及其应用。
背景技术
类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，BP)简称类鼻疽杆菌，属兼性胞内革兰氏阴性杆菌，主要存在于水源和土壤中，可引起一种称为类鼻疽的人兽共患病。类鼻疽病主要分布于东南亚和澳大利亚北部，我国类鼻疽主要分布于海南、广东、台湾、香港等地区。人和动物可通过皮肤擦伤、吸入或摄入等方式感染类鼻疽菌，其临床表现多样，包括无症状感染、亚临床感染、重症败血症等，死亡率达40％左右，且复发率也较高(5％-28％)。因此，迫切需要开发一种有利于类鼻疽病的简便、快速的诊断方法，从而阻止其疾病进一步播散。
目前类鼻疽的辅助诊断方法，主要包括细菌学鉴定、分子生物学方法、组学分析方法以及血清学诊断等相关技术。虽然从临床标本中分离到该菌是其诊断的“金标准”，但是培养周期长，所生长的菌落有强烈的霉臭味，常被误认为污染物、假单胞菌或同属的其他菌种。分子生物学方法主要包括针对16SrRNA、23S rRNA和Ⅲ型分泌系统的RT-PCR分析及TaqMan比对分析和多种特异性引物PCR，但技术要求较高，都还未普遍应用于临床，其诊断的敏感性还有待评估。组学分析方法中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)要求建立检测细菌的质谱图库，但目前由于商业化的质谱图库不全，容易导致鉴定错误，并且费用昂贵，不适用于普通实验室和临床标本的检测。血清学诊断主要包括①基于抗原检测的乳胶凝集试验、免疫荧光检测以及测流免疫层析技术等，由于敏感性不高，也限制了其进一步应用。②基于抗体检测有间接血凝试验、间接免疫银光抗体试验和ELISA检测，但是间接血凝试验特别容易受疫区人群背景干扰，易产生假阳性；间接免疫银光抗体试验需要专门的荧光显微镜和专业人员，限制了在流行地区大规模使用；而ELISA检测对于血清中的IgM或IgG抗体具有较高的敏感性和特异性，通常以全菌、脂多糖、胞外多糖为常用检测抗原，重组蛋白的ELISA临床试验尚未开展。
发明内容
针对现在临床标本中类鼻疽杆菌的分离培养时间周期长且易误诊，分子生物学检测方法技术要求高，组学分析方法价格昂贵，均不能较好的满足临床需求的现状，本发明提供了一种敏感性和特异性较好的针对类鼻疽感染的诊断抗原及其制备方法和用途。
本发明提供的技术方案如下：
一种多表位融合抗原，由类鼻疽杆菌Hcp1蛋白的若干优势线性抗原表位序列连接构成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述优势线性抗原表位序列选自：SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中的两个或多个，任意两个优势线性抗原表位序列之间由柔性肽段连接而成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述柔性肽段的氨基酸序列为GGGG，优选地，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:11。
在根据本发明的一个实施方案中，所述多表位融合抗原的氨基酸序列为SEQID NO:2。
本发明还提供了上述的多表位融合抗原的编码基因，所述多表位融合抗原的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明还进一步提供了一种含有上述多表位融合抗原的编码基因的基因表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
本发明的再一方面还提供了上述的多表面融合抗原或上述的基因表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于诊断或治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的试剂中的应用。
本发明更进一步提供了一种用于诊断类鼻疽伯克霍尔德菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如上所述的多表位融合抗原、同时识别所述多表位融合抗原和类鼻疽伯克霍尔德菌样品的第一抗体，识别第一抗体的第二抗体，以及检测介质载体。
在根据本发明的一个实施方案中，所述多表位融合抗原包被在检测介质载体中，所述第二抗体为酶标抗体。
在根据本发明的一个实施方案中，所述检测介质载体为ELISA板或胶体金检测条。
本发明提供的技术方案具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于诊断类鼻疽杆菌的多表位重组蛋白，具有较高特异性和敏感性；同时，本发明还提供了用于检测类鼻疽杆菌的间接ELISA方法及试剂盒，为类鼻疽病的血清学检测提供重要方法。
附图说明
图1为本发明的一实施例中Hcp1抗原蛋白的优势线性表位序列氨基酸序列示意图；
图2为本发明的一实施例中重组蛋白BP-meAg的SDS-PAGE分析；
图3为本发明的一实施例中重组蛋白BP-meAg的Western blot分析；
图4是本发明的一实施案例中重组蛋白BP-meAg作为抗原包被ELISA板的试剂盒的建立方法的流程图；
图5是本发明的一实施案例中重组蛋白BP-meAg作为抗原，确定最佳抗原包被浓度的结果示意图；
图6是本发明的一实施案例中重组蛋白BP-meAg作为抗原，优化血清稀释度的结果示意图；
图7是实施案例中重组蛋白BP-meAg作为抗原，检测建立的间接ELISA法的特异性的结果示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1抗原蛋白优势抗原表位的预测分析
根据GenBank已经报道的类鼻疽杆菌基因组中Hcp1蛋白的序列(Hcp1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，核苷酸序列为SEQ ID NO:13)，利用生物在线软件ABCPred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、IEDB(http://www.iedb.org/)对B细胞表位进行分析；
利用NetMHCⅡpan 3.0serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-3.0/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)、Rankpep(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、NetMHCpan 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)、Epijen(https://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)对T细胞表位进行分析，综合不同的分析方法结果，寻找出存在优势线性抗原表位序列(如表1所示)。
表1 Hcp1蛋白的优势线性表位序列
Figure GDA0002977157160000051
实施例2多表位融合抗原(BP-meAg)基因的构建
通过编码柔性氨基酸(GGGG)的核苷酸序列(SEQ ID NO:11G G T G G CG G T G G C)将编码优势抗原表位的基因片段按照一定的排列组合方式串联在一起，构建出含有多表位融合抗原基因(BP-meAg)(图1)，核苷酸序列为SEQ IDNO:1，由该基因编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
实施例3多表位融合抗原(BP-meAg)基因在大肠杆菌中的表达
通过生工合成多表位融合抗原(BP-meAg)基因，并构建pET-28a-BP-meAg重组表达质粒。将重组表达质粒分别转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，涂布于含有卡那霉素(碧云天生物技术)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落送至华大基因生物公司测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证。将鉴定正确的重组表达质粒分别转化至表达工程菌E.coliBL21中，37℃过夜培养，将筛选出的阳性菌转接到含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG进行诱导，诱导10h后收集菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用小鼠BP阳性血清(用加热灭活的类鼻疽杆菌三次免疫小鼠后获得的血清)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG酶标抗体(北京中杉金桥)为二抗，进行Western blot分析。
SDS-PAGE电泳分析结果表明，在大肠杆菌中目的蛋白均成功(图2)，分子量约为13kD，与预期大小一致。同时Western blot分析结果表明，在相同位置出现特异性条带(图3)。
实施例4表位融合抗原(BP-meAg)的纯化
按照His-Trap(美国GE公司)说明书对表达的重组BP-meAg进行蛋白的纯化。经纯化蛋白浓度测定(碧云天生物技术，BCA试剂盒)，镍柱纯化的重组蛋白BP-meAg浓度为2.3mg/ml。
实施例5基于BP-meAg2抗原蛋白间接ELISA方法建立及条件的优化
间接ELISA方法的流程如图4所示，具体步骤为：
1)包被：用pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液(上海生工)对纯化的蛋白进行稀释，重组蛋白按0.1、1、3、4、6和10ug/mL依次稀释，每孔加入100μL包被96孔ELISA板(美国Costa公司)，4℃过夜，采用PBST(0.05M pH7.4PBS+0.05％吐温-20)洗涤4次；
2)封闭：封闭采用1％的牛血清蛋白BSA(购自赛国生物科技有限公司)(用PBST作为稀释液)，300μL/孔，37℃条件下封闭2h，用PBST洗涤4次；
3)血清稀释度确定：类鼻疽阳性血清、类鼻疽阴性血清分别做1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000共五个稀释度，100μL/孔，封膜，37℃孵育1h，同一样品作3个重复孔，同时作一空白对照孔，洗涤4次；
4)酶标抗体作用条件：酶标抗体兔抗人(博士德生物工程有限公司)进行1:20000稀释，100μL/孔，分别于37℃孵育45min，洗涤4次；
5)底物显色：TMB底物100u1/孔,室温避光显色15min后加2M H2S04 50u1/孔，终止反应；
6)读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据，计算结果。
7)结果判定：当参考阳性血清OD值>0.2，参考阴性血清OD值<0.2,空白孔OD值<0.05，表明试验成立；P/N＝(样品OD值-空白OD值)/(阴性OD值-空白OD值)，且P/N值最大组合所对应的条件作为间接ELISA最佳工作条件；
试验结果表明，在酶标二抗工作浓度为1:20000的条件下：抗原最佳包被浓度为3ug/ml(图5)，待检血清最佳稀释度为1:500(图6)。
间接ELISA法临界值的确定：
选择30份阴性血清用来确定间接ELISA方法的临界值。血清结果如表2所示，30份类鼻疽杆菌阴性血清样品OD450平均值为0.161，标准差为0.036，根据公式计算阴阳临界值X+3SD＝0.270。因此待检样品OD450>0.270为阳性，待检样品OD450<0.270时为阴性，待检样品OD450＝0.270为可疑。
表2间接ELISA法临界值的确定
Figure GDA0002977157160000081
实施例6基于BP-meAg2抗原蛋白的间接ELISA方法特异性和敏感性分析
(1)特异性试验：用建立的间接ELISA法对15份类鼻疽杆菌阳性血清(收集自海南省三亚市人民医院)、15份结核分枝杆菌阳性血清(收集自重庆市结核病研究所)、15份铜绿假单胞菌阳性血清(收集自重庆是西南医院)进行检测，结果显示15份类鼻疽杆菌阳性血清检测结果均为阳性，其余血清检测结果均为阴性，表明重组蛋白与其他细菌阳性血清无交叉反应，具有较高的特异性(图7)。
(2)敏感性试验：选择10份类鼻疽杆菌阳性血清，以1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000进行稀释，用建立的间接ELISA法进行检测。当血清稀释度为1:1000时，结果仍为阳性，表明该方法具有良好的敏感性。
(3)重复性试验：随机挑选6个样品血清样本进行重复性检验。将同一批重组蛋白包被在同一酶标板上，在同一酶标板内检测血清6份，每份血清重复3次，进行批内重复性检测；将同一批重组蛋白包被在3块酶标板上，在3块酶标板上分别检测6份血清，进行批间重复性检测。计算每份血清样本的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。变异系数＝(标准差/平均值)x 100％。批内和批间的重复性检验显示，批内变异系数最大值为6％，批间变异系数最大值为7.4％，变异系数小于10％，说明该方法具有良好的可重复性(表3)。
表3重复性检测
Figure GDA0002977157160000091
实施例7间接ELISA方法对临床样品的检测及评估。
采用建立的间接ELISA法对102例临床病人的血清(阳性39例、阴性63例)进行检测，分析ELISA方法的特异性和敏感性(表4)。ELISA法和金标准检测结果见图6。经统计学分析，ELISA方法的敏感性和特异性分别为92.3％和95.2％，与培养法的符合率为94.12％，证实多表位重组蛋白是一种具有较高特异性和敏感性的类鼻疽杆菌诊断抗原分子。
表4间接ELISA法对102份临床样品的检测
Figure GDA0002977157160000092
结论：本发明提供了一种由类鼻疽杆菌Hcp1蛋白的若干优势线性抗原表位序列连接构成的一种多表位融合抗原，可作为检测类鼻疽杆菌间接ELISA法的靶标抗原，具有较好的敏感性和特异性，为类鼻疽病的血清学检测提供重要方法。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Figure GDA0002977157160000111
Figure GDA0002977157160000121
Figure GDA0002977157160000131
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序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种多表位融合抗原及其应用
<141> 2020-07-31
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Met Met Glu Glu Phe Glu Ile Thr Ile His Arg Pro Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Gly Gly Asp Leu Thr Glu Leu Leu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys
100 105 110
Val Leu Ile Thr His Met Asp Gln Tyr Ser Pro Thr Pro His Lys Asp
115 120 125
Asp Ser Asn Gly Ile Lys Glu Gly Leu Leu Gly Tyr Ile Glu Glu Ile
130 135 140
Lys Phe Thr Tyr Ser Gly Tyr Ser Leu Glu His Ala Glu Ser Gly Ile
145 150 155 160
Ala Gly Ala Ala Asn Trp Thr Asn Gly
165
<210> 13
<211> 449
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas psedomallei)
<400> 13
tcgttcagga aggtcatgac gggaaaatcc acatcctcgc cttcaagaac gactacgaca 60
tgcctgccag gctccaggaa ggcctgacgc ccgccgccgc cgctcgcggc acgatcacgt 120
tgacgaagga aatggacaga tcgtcgccgc aattcctgca ggcgctcggc aagcgcgaga 180
tgatggaaga gttcgagatc acgatccacc gtccgaagac ggatacaaca ggtggggacc 240
tgaccgaact cctgttcacg tacaagttcg aaaaagtgct gatcacccac atggaccaat 300
actcgcccac gccgcacaaa gacgatagca acggcatcaa ggaaggcttg ctcggctata 360
tcgaggagat caagttcacg tattcgggat actcgttgga acacgcggaa tcgggcatcg 420
cgggcgccgc aaactggacg aatggctga 449

Claims (9)

1. 一种多表位融合抗原，其特征在于，由类鼻疽杆菌Hcp1蛋白的若干优势线性抗原表位序列连接构成；
所述优势线性抗原表位序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中的两个或多个，任意两个优势线性抗原表位序列之间由柔性肽段连接而成；
所述多表位融合抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2. 如权利要求1所述的多表位融合抗原，其特征在于，所述柔性肽段的氨基酸序列为GGGG。
3.如权利要求2所述的多表位融合抗原，其特征在于，所述柔性肽段编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:11。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的多表位融合抗原的编码基因，其特征在于，所述多表位融合抗原的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
5. 一种含有如权利要求4所述的编码基因的基因表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
6. 如权利要求1-3中任一项所述的多表面融合抗原或如权利要求5的所述的基因表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于诊断或治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的试剂中的应用。
7. 一种用于诊断类鼻疽伯克霍尔德菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一项所述的多表位融合抗原、同时识别所述多表位融合抗原和类鼻疽伯克霍尔德菌样品的第一抗体，识别第一抗体的第二抗体，以及检测介质载体。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述多表位融合抗原包被在检测介质载体中，所述第二抗体为酶标抗体。
9. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测介质载体为ELISA板或胶体金检测条。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046452B (zh) * 2021-03-23 2022-02-25 中国人民解放军陆军军医大学 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用
CN116655802B (zh) * 2023-05-25 2023-12-12 中国人民解放军陆军军医大学 类鼻疽菌Hcp1蛋白的融合蛋白、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1632584A (zh) * 2004-04-02 2005-06-29 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法
CN1834651A (zh) * 2006-04-18 2006-09-20 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法
CN102146478A (zh) * 2011-04-15 2011-08-10 中国人民解放军第三军医大学 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒
WO2019090138A2 (en) * 2017-11-04 2019-05-09 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Immunogenic conjugates and methods of use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1632584A (zh) * 2004-04-02 2005-06-29 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法
CN1834651A (zh) * 2006-04-18 2006-09-20 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法
CN102146478A (zh) * 2011-04-15 2011-08-10 中国人民解放军第三军医大学 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒
WO2019090138A2 (en) * 2017-11-04 2019-05-09 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Immunogenic conjugates and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Rapid Immunochromatography Test Based on Hcp1 Is a Potential Point-of-Care Test for Serological Diagnosis of Melioidosis;Phornpun Phokrai，等;《Journal of Clinical Microbiololy》;20180831;第56卷(第8期);全文 *
Transcriptome analysis of Burkholderia pseudomallei T6SS identifies Hcp1 as a potential serodiagnostic marker;Sylvia Chieng，等;《Microbial Pathogenesis》;20150228;第79卷;全文 *
快速检测土壤中类鼻疽伯霍尔德杆菌的双抗体夹心ELISA法的建立;马广强，等;《国际检验医学杂志》;20130515;第34卷(第9期);全文 *

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