CN1834651A - 一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测类鼻疽菌抗原的免疫层析试纸及其制备方法。该免疫层析试纸，包括样品垫1、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫2、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)3和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫4；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线5和质控线6，所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，所述质控线为羊抗兔IgG。本发明用于临床标本、污染物和环境中类鼻疽菌抗原的检出，也可用于纯培养类鼻疽菌的鉴定。

Description

一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试纸，特别涉及一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。

背景技术

类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallie)引起的一种致死性和传播性均很强的细菌性疾病。最初由Whitmore分离自缅甸仰光，命名为惠特姆尔杆菌(Bacillus whitmore，1921)，后又多次易名，如类鼻疽恶病杆菌(Malleonydes pseudo mallei，1939)、类鼻疽吕氏杆菌(Loefferella pseudomallei，1951)和类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei，1957)，1993年命名为类鼻疽伯克霍尔德氏菌。

类鼻疽菌是经典的生物战剂，被列入《国际禁止生物武器公约》核查清单。类鼻疽菌容易获得，致病性强，感染后如不及时治疗，可在3～4天内死亡，对外界环境的抵抗力强，在粪便中可存活27天，尿液中存活17天，腐败尸体中存活8天。感染途径可以通过呼吸道、消化道和皮肤粘膜侵入，容易被用来进行生物恐怖袭击。“9.11”以后，美国国家反恐预案将类鼻疽菌列为可能用于生物恐怖袭击的烈性病原微生物。因此，类鼻疽菌的快速检测是反生物恐怖的重要内容(Bossi P，Guihot A，Bricaire F.Emerging or re-emerging infectionsthat can be used for bioterrorism Presse Med.2005 Jan 29；34(2 Pt2)：149-155；Christensen JJ，Andresen K，Kemp M.New diagnost ic methodsfor bacterial infections after the introduction of increased bioterrorismpreparedness 2005，5：167(36)：3416-3417)。

类鼻疽的临床类型有3种：急性暴发型、亚急性型和慢性型，临床表现复杂易变，不易诊断，必须借助实验室的试验结果做判断，包括细菌学检查和血清学试验(White NJ.Melioidosis.Lancet.2003，17：361(9370)：1715-1722)。

临床采集鼻腔分泌物、痰、皮肤溃疡分泌物或脓肿穿刺物，直接涂片镜检，同时接种4％甘油肉汤琼脂，按照分离培养、生化反应、玻片血清凝集和动物感染试验程序检验。

类鼻疽菌为两端钝圆、两极浓染的革兰氏阴性杆菌，散在分布，有鞭毛因而有动力，在组织中可形成所谓的假荚膜。类鼻疽菌为需氧菌，在4％甘油琼脂上生长良好。根据生化反应和动力试验可将类鼻疽菌与鼻疽菌和绿脓假单胞菌区别开，这是类鼻疽菌检测的经典方法。

聚合酶链反应(PCR)扩增鼻技术是类疽菌快速检测方法中最常用的技术，最初根据类鼻疽菌23S rRNA基因设计引物：CVMP231：5′AAA CCG ACA CAG GTG G3′；M232：5′CAC CGA AAC TAG CA 3′，用于类鼻疽菌的鉴定(Adolf Bauernfeind，Carsten Roller Molecular procedure for rapid detection of Burkholderiamallei and Burkholderia pseudomallei.J.Clin.Microbiol，1998，36：2737-2741)；应用类鼻疽菌23S rRNA基因设计引物，也可获得明确的类鼻疽菌鉴定结果(Gee JE，Sacchi CT，Glass MB，De BK.Mse of 16S rRNA genesequencing for rapid identification and differentiation of Burkholderiapseudomallei and B.mallei.J Clin Microbiol.2003，41(10)：4647-4654)。近年来将实时定量PCR(real-time PCR)技术用于临床标本中类鼻疽菌的检测，可检出1～10cfu/ml类鼻疽菌(Novak RT，Glass MB，Gee JE，Gal D，Mayo MJ.Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting the typeIII secretion system of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol.2006，44(1)：85-90)。

免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。

目前尚无见到免疫层析试纸检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌的免疫层析试纸(Immμno-Chromatographic Assay，ICA)。

本发明所提供的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(Nc膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，优选为兔抗体，所述质控线为羊抗兔IgG。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备类鼻疽菌特异性抗体，将类鼻疽菌特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-4.5小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上；

2)制备含有类鼻疽菌特异性抗体标记免疫胶体金探针溶液，取5-6ml，加入0.5-0.6g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端；

3)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测类鼻疽菌的免疫层析试纸。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。

本发明所提供的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸及其制备方法中，所述类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针可由下述方法制备：

1)将HAμCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；

2)用K₂CO₃或HCl调pH值为8.2-9.5，按30μg/ml加入类鼻疽菌特异性抗体，搅拌20-30分钟，配制类鼻疽菌抗体的免疫胶体金探针溶液。然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-3000rpm离心10-15分钟，吸出上清，11000-12000rpm离心25-30分钟，弃上清，收集沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。

所述调节pH值的K₂CO₃的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值HCl的浓度可为0.08-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。

免疫胶体金技术检测类鼻疽菌抗原的基本原理是：用类鼻疽菌特异性抗体包被硝酸纤维素(NC)膜，用以捕捉标本中的类鼻疽菌或类鼻疽菌抗原，然后用标记了特异性抗体的免疫胶体金探针检测。标本中的类鼻疽菌或类鼻疽菌抗原经过5分钟左右的纸层析后，即出现肉眼可见的沉淀线。

我们研制的一种检测类鼻疽菌的免疫层析试纸经实验室考核结果显示，可检测标本中类鼻疽菌106cfu/ml，并且不与相关细菌发生交叉反应。本发明的免疫层析试纸采用双抗体夹心法，将抗类鼻疽菌特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的类鼻疽菌抗原，然后用特异性抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。

本发明的试纸可用于临床标本、污染物和环境中类鼻疽菌的检出，也可用于纯培养类鼻疽菌的鉴定。本发明的优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。

附图说明

图1为类鼻疽菌免疫层析试纸的结构示意图。免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

具体实施方式

主要材料：氯金酸(HAμCl₄)(购自Sigma公司，1g/瓶包装)；硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸(购自Millipore公司)。

类鼻疽菌(保藏号350102)，引自越南中央卫生流行病研究院，由军事医学科学院全军微生物检验研究中心菌种库保藏。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的制备

1、类鼻疽菌特异性抗体的制备

1)类鼻疽菌抗原的制备

类鼻疽菌(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号350102)接种在含4％甘油普通琼脂平板上，37℃孵箱培养，观察平板上菌落形态，挑取典型的单个菌落，转种4％甘油普通琼脂斜面，37℃孵箱中培养24-30小时。将培养24-30小时的斜面用无菌生理盐水洗下菌苔，收集菌液，加分析纯甲醛至0.5％，4℃冰箱过夜，用无菌生理盐水调菌浓度为2×10⁸cfu菌/ml，即为类鼻疽菌菌体抗原，4℃保存备用。

2)类鼻疽菌特异性抗体的制备

选用体重2kg健康雌性大耳白家兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心)，皮下多点注射免疫福氏完全佐剂类鼻疽菌菌体抗原2×10⁸cfu菌/1ml/只，分别于初次免疫后的第20日、第30日、第40日追加免疫水剂1针，追加剂量和途径与初次相同，末次免疫后10天试血，玻片凝集试验检测血清效价达到1∶1280以上采血。

采用常规的饱和硫酸铵盐析法，33％饱和硫酸铵盐析2次，透析脱盐后收集抗体。

2、制备免疫胶体金探针

1)制备胶体金溶液：采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAμCl₄配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。冷却后用蒸馏水恢复至原体积，制成颗粒直径为25nm的胶体金颗粒。

2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度：用0.2M K₂CO₃或0.1M HCl调节胶体金溶液pH9.2，准备5支洁净试管，分别加入1ml胶体金溶液。将经纯化的抗类鼻疽菌特异性抗体稀释为1mg/ml，分别向4支试管中加入10μl、15μl、25μl、35μl，另一支为对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μl，即25μg/ml，选择偶联抗体浓度为30μg/ml。

3)金标垫2的制备：按上述方法配制含有浓度为30μg/mL的抗类鼻疽菌特异性抗体的免疫胶体金探针溶液50ml，搅拌20-30分钟，加10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-3000rpm离心10-15分钟，吸出上清，11000-12000rpm离心25-30分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5ml。取金标探针5ml加入0.5-0.6g蔗糖，充分溶解均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干，得到金标垫2。

3、类鼻疽菌快速检测试纸的制备

如图1所示，检测类鼻疽菌的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

1)NC膜3的包被：

用0.01M pH7.2PB缓冲液(NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，去离子水1000ml)稀释抗类鼻疽菌特异性抗体，浓度为4-4.5mg/ml，用于包被检测线。用0.01M pH 7.2的PBS(NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，NaCl 8.5g，去离子水1000ml)稀释羊抗兔IgG，浓度为4-4.5mg/ml，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥2.5-4.5小时。

2)类鼻疽菌快速检测试纸的制备

将吸水垫4用双面胶粘贴在包被的硝酸纤维膜3的一端，将包被的NC膜3用双面胶粘贴在步骤2中制备的金标垫2的一端，在金标垫2上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫1，再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

4、检测类鼻疽菌的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤3制备的类鼻疽菌快速检测的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有观测窗。

5、类鼻疽菌快速检测试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相羊抗兔IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

实施例2、类鼻疽菌的检测及与其它相关细菌的交叉试验

1、类鼻疽菌的检测

1)由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心提供类鼻疽菌350102株、类鼻疽菌350112株，浓度均为1×10⁶cfu/ml，菌悬液作为样品检测液备用。

2)经实施例1制备的包被类鼻疽菌特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测均为阳性结果。

2、其他相关细菌的交叉试验

1)由军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心提供，鼻疽菌350018株，绿脓假单胞菌430023株，浓度均为1×10⁸cfu/ml，菌悬液作为样品检测液备用。

2)经实施例1制备的包被类鼻疽菌特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测均为阴性结果。

实施例3、实验室考核

1、检测样品的制备

共使用细菌17株，包括类鼻疽菌10株(越南株、广东株、广西株、海南株)、鼻疽4株、绿脓假单胞菌3株，所有细菌均由军事医学科学院全军微生物检验研究中心菌种库保藏。将上述细菌分别接种各自适宜的培养基，并在不同的条件下培养，长出菌苔后用无菌生理盐水洗下，比浊法配制类鼻疽菌菌悬液1×10⁶cfu/ml、1×10⁷cfu/ml和1×10⁸cfu/ml，其它细菌菌悬液1×10⁸cfu/ml，作为检测液备用。

2、实验方法

取类鼻疽菌抗原快速检测试剂，分别于样品垫上加入上述样品检测液3滴(约150μl)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告：质控线处出现1条沉淀线为阴性，即无类鼻疽菌抗原检出；检测线和质控线处出现2条沉淀线为阳性，即有类鼻疽菌抗原检出。

3、实验结果

类鼻疽菌抗原快速检测试剂实验室考核结果见表1。

       表1  一种检测类鼻疽菌的免疫层析试纸实验室考核

细菌名称	株号	菌量(cfu/ml)
					106	107	108
		类鼻疽菌	350101(越南株)	+				+	+
	350103(海南海口株)				+	+	+
			350111(海南拉达株)	+				+	+
	350115(海南榆林株)				+	+	+
			350126(海南加积株)	+				+	+
	350129(广东潼湖株)				+	+	+
			350144(广东高州株)	+				+	+
	350144(广东湛江株)				+	+	+
			350139(广西南宁株)	+				+	+
	350141(广西崇左株)				+	+	+
		鼻疽菌	350011						-
	350017						-
			350018						-
	350019						-
		绿脓假单胞菌	430022						-
	430023						-
			430024						-

从表1可以看出，类鼻疽菌抗原快速检测试剂(胶体金法)可以检测出1×10⁶cfu/ml类鼻疽菌不同地区分离株，不与1×10⁸cfu/ml鼻疽伯克霍尔德菌和绿脓假单胞菌发生交叉反应。

Claims (7)

1、一种检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，包括样品垫(1)、紧密连接于所述样品垫一端的含有类鼻疽菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫(2)、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(3)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫(4)；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线(5)和质控线(6)，所述检测线为类鼻疽菌特异性抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。

2、根据权利要求1所述的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，其特征在于：类鼻疽菌特异性抗体优选为兔抗体。

3、根据权利要求1所述的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，其中抗兔抗抗体为羊抗兔IgG。

4、根据权利要求1所述的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸，其特征在于：所述样品垫、吸水垫、金标垫均由吸水材料制成；所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。

5、一种制备检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备类鼻疽菌特异性抗体，将类鼻疽菌特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-4.5小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上。

2)制备胶体金标探针，将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下加入1.6ml的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，冷却后用水恢复至原体积，用K₂CO₃调pH值为8.2-9.5，按30μg/ml加入类鼻疽菌特异性抗体，搅拌20-30分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-25分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，2800-3000rpm离心10-15分钟，吸出上清，11000-12000rpm离心25-30分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。

3)制备含有类鼻疽菌特异性抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5-6ml，加入0.5-0.6g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端。

4)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测类鼻疽菌的免疫层析试纸。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述类鼻疽菌特异性抗体的浓度为4-4.5mg/ml；抗兔IgG的浓度为4-4.5mg/ml；所述吸水垫的下面还粘贴有背板；所述调节pH值的K₂CO₃的浓度为0.2M。

7、含有权利要求1-4中任一所述的检测类鼻疽菌的免疫层析试纸的试剂盒。