CN101000347B - 检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测土拉热弗朗西斯菌抗原的免疫层析试纸及其制备方法。该免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，所述质控线为抗鼠抗抗体。本发明用于临床标本、污染物和环境中土拉热弗朗西斯菌抗原的检出，也可用于纯培养土拉热弗朗西斯菌的鉴定。

Description

检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测土拉热弗朗西斯菌的试纸及其制备方法，特别涉及一种检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是重要的生物战剂，已被列入国际禁止生物武器公约致病微生物核查清单。2001年6月美国微生物学报刊登了一篇“防生物危害工作组(The Working Group on Civilian Biodefense)”关于土拉热弗朗西斯菌作为生物武器进行恐怖袭击危险性评估报告。这个工作组由来自美国医学科研机构和军队、政府有关部门的25名专家组成，通过检索1966年1月至2000年10月间的相关文献，最后得出结论：土拉热弗朗西斯菌具有被利用进行生物恐怖袭击的潜在危险。该结论依据以下事实：(1)通过简易发酵即可大量得到土拉热弗朗西斯菌。(2)土拉热弗朗西斯菌容易传播，如形成气溶胶通过空气传播，或污染环境通过尘埃和水传播。另外，与鼠疫等烈性致病菌比较，土拉热弗朗西斯菌在环境中具有更强的抵抗力，如在水、土壤、尸体和兽皮中可存活几周，在0℃耐受几个月，在冷冻的兔肉中存活几年。患者及病畜皮肤、腺体溃疡病灶分泌物、血、痰标本，或死亡动物肝、脾标本中，均含有大量土拉热弗朗西斯菌，更容易被恐怖分子利用。(3)人和动物易感，少于10个土拉热弗朗西斯菌即可使人和动物感染。(4)可引起致死性疾病。世界卫生组织最近估计，50千克土拉热弗朗西斯菌气溶胶可使一个五百万居民的城市中25万人感染，其中1.9万人死亡。因此，美国疾病控制中心估算，应对土拉热弗朗西斯菌气溶胶生物恐怖袭击，每10万人需经费54亿美元(ennis DT，Inglesby TV，Henderson DA.Tularemia as a biological weapon：medical and public health management JAMA2001，6；285(21)：2763-73)。“9.11”恐怖事件以后美国将土拉热弗朗西斯菌列入生物恐怖红色警报(最高级)中的病原菌。

土拉热弗朗西斯菌是苛养菌，培养基营养条件要求复杂，分离培养比较困难。而且土拉热弗朗西斯菌生长缓慢，尤其是初次分离培养，需要1-2周时间才能确定结果。因此，研究快速检出土拉热弗朗西斯菌的方法，对于生物战和生物恐怖现场中确定污染源和污染范围，及时诊断土拉热弗朗西斯菌感染，防止环境扩散和患者及时治疗十分重要，也是在突发事件中将生物危害减至最小程度的重要保证。

土拉热弗朗西斯菌快速检测常用的方法为免疫荧光试验、聚合酶链反应(PCR)、光纤生物传感器和免疫胶体金技术。

免疫荧光试验主要用于从人或动物病料涂片中直接检出土拉热弗朗西斯菌。斯堪的那维亚(Scandinavia)地区人通常通过蚊虫叮咬感染土拉热弗朗西斯菌，出现皮肤溃疡和腺体脓肿。1998年西班牙中北部送检25份疑是土拉热弗朗西斯菌病临床标本，其中腺体脓液17份，皮肤溃疡分泌物8份，这25份标本分别接种培养基进行病原分离，其中20份直接涂片后用免疫荧光染色镜检。结果3例(12％)培养出土拉热弗朗西斯菌，7例(35％)免疫荧光检测阳性；另外352例临床体征疑是土拉菌病的病人，用试管凝集试验检测土拉热血清抗体滴度≥1:160的203例(58％)，其中53例呈4倍升高。作者认为免疫荧光检测和血清抗体检测均能很好地应用于土拉热弗朗西斯菌感染的临床诊断(Labayru C，Palop A，Lopez-Urrutia L.Francisella tularensis：update on microbiological diagnosis after anepidemic outbreak Enferm Infecc Microbiol Clin1999，17(9)：458-62)。

聚合酶链反应(PCR)主要用于环境中土拉热弗朗西斯菌的检测和实验室土拉热弗朗西斯菌的基因分型。如北半球分离到的土拉热弗朗西斯菌对哺乳动物的毒力有明显不同，但无法用普通生物学方法和血清学方法进行分类，通过PCR可将毒力不同的土拉热弗朗西斯菌合成4个亚种(Johansson A，Ibrahim A，Goransson I.Evaluation of PCR-based methods for discrimination of Francisella speciesand subspecies and development of a specific PCR that distinguishes the twomajor subspecies of Francisella tularensis.J Clin Microbiol 2000，38(11)：4180-5)。

PCR也可用于疑似土拉热弗朗西斯菌病的临床标本的直接检测。但要求标本要新鲜，并且在采样过程中于标本中加入核酸酶抑制剂，如硫氰酸胍等，设计引物所用的模板多为16S rRNA和17KDa脂蛋白TUL4基因。1998年瑞典局部爆发流行土拉热弗朗西斯菌病。临床体征疑似40例中，20例(50％)土拉热杆菌培养阳性，29例(73％)血清抗体检测阳性，30例(75％)PCR检测阳性(其中8例培养与血清抗体检测均为阴性，而PCR检测阳性)。作者认为，直接用PCR从伤口标本中检出土拉热弗朗西斯菌比培养法敏感。另外，当病人还没有产生抗体时(土拉热弗朗西斯菌感染不到2周)，用PCR诊断感染是一个及时的方法(Johansson A，Berglund L，Eriksson U.Comparative analysis of PCR versus culture for diagnosis of ulceroglandulartularemia.J Clin Microbiol2000，38(1)：22-6；Sjostedt A，Eriksson U，BerglundL.Detection of Francisella tularensis in ulcers of patients with tularemiaby PCR.J Clin Microbiol1997，35(5)：1045-8)。

光纤生物传感器也被研制用于检测环境中的土拉热弗朗西斯菌污染。其原理是应用核酸检测的特异性和抗原抗体反应。优势在于同时可检测多个不同目标，3-10分钟可初步报告结果，敏感性可达检测土拉热弗朗西斯菌5×10⁵cfu/ml，检测金黄色葡萄球菌肠毒素B50ng/ml(]Anderson GP，King KD，Gaffney KL.Multi-analyteinterrogation using the fiber optic biosensor.Biosens Bioelectron 2000，14(10-11)：771-7)。

近年来免疫胶体金技术在病原体检测方面的应用发展较快，由于该技术的应用，使得病原体的检测就像在家作早孕检测一样简便和快速。免疫胶体金技术的基本原理是用包被在硝酸纤维素(NC)膜上的配对物(抗原或抗体)进行捕捉，然后用特异性标记的免疫胶体金探针进行检测，阳性标本经过2分钟左右的纸层析后，出现肉眼可见的沉淀线。

目前光纤生物传感器离实用还有一段距离。虽然免疫荧光试验和PCR在实验室得到了较好的应用，但这两个试验都需要特殊的仪器和试剂，必须是有经验的技术人员在实验室中操作，并且标本处理需要较长的时间，因此不适于在基层和突发事件现场使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。

本发明所提供的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸，包括依次紧密串联的样品垫、含有土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记胶体金探针的金标垫、硝酸纤维膜(NC膜)和吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，所述质控线为抗鼠抗抗体；

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。

所述样品垫、吸水垫、金标垫均由吸水材料制成，如由玻璃纤维膜、吸水纸、树脂等制成。

所述土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体优选为抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCCNo.1566分泌的单克隆抗体。

所述抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566已于2005年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

所述质控线可为羊抗鼠IgG。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，将土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗鼠IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2-4小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上；

2)制备含有土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5ml所述含有土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记免疫胶体金探针溶液，加入0.5g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端；

3)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。

本发明所提供的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸及其制备方法中，所述土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记胶体金探针可由下述方法制备：

1)将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；

2)用K₂CO₃或HCl调pH值为9.0，按30ug/ml加入土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，搅拌20分钟，配制土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体的免疫胶体金探针溶液50ml，然后加入10％BSA5ml，搅拌20分钟，加1ml10％PEG20000，搅拌20分钟，23,000g离心15分钟，吸出上清，20,000-32,500g离心25-35min，弃上清，收集沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。

所述调节pH值的K₂CO₃的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值HCl的浓度可为0.08-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。

所述土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体由抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCCNo.1566分泌。

本发明的免疫层析试纸采用双抗体夹心法，将抗土拉热弗朗西斯菌特异性单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的土拉热弗朗西斯菌抗原，然后用特异性单克隆抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。

抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体在ELISA、免疫荧光和凝集试验中与不同土拉热弗朗西斯菌菌株发生特异性反应，但不与其他相关细菌如布鲁氏菌、鼠疫菌、嗜肺军团菌、霍乱弧菌、以及大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌和绿脓杆菌发生交叉反应。该单克隆抗体与Ft9(端青，赵忠利，田青，等.土拉菌单克隆抗体的制备及其特性的研究[J].中国人兽共患病杂志，2000，16(2)：3-4.)比较验，均有较好的亲和性和特异性，且前者的效价比后者更高，达10⁷以上，其检测土拉菌限可达到10⁴-10⁵cfu/ml。

本发明的试纸可用于临床标本、污染物和环境中土拉热弗朗西斯菌的检出，也可用于纯培养土拉热弗朗西斯菌的鉴定。本发明的优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。

附图说明

图1为土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体与不同土拉热弗朗西斯菌抗原免疫印迹试验结果

图2为土拉热弗朗西斯菌免疫层析试纸的结构示意图

具体实施方式

主要材料：氯金酸(HAuCl₄)(购自成都化学试剂厂，1g/瓶包装)；硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸(购自Millipore公司)。

实施例中所用到的菌种:所有土拉热弗朗西斯菌株、大肠埃希氏菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、布鲁氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、嗜肺军团菌和金黄色葡萄球菌，均购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心菌种库。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸的制备

1、土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体的制备

1)土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体的制备

采用BALB/c小鼠作为免疫动物，颈背部皮下多点注射弗氏完全佐剂土拉热弗朗西斯菌疫苗株(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号410062)免疫原乳化剂，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，用下述土拉热弗朗西斯菌全菌甲醛固定抗原采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。经过多次融合和筛选，获得了多株分泌土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体杂交瘤细胞株。选择其中分泌抗体滴度较高的杂交瘤细胞株继续克隆传代，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到多次克隆传代的稳定分泌单克隆抗体的阳性抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566。

采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.15665×10⁵-10⁶个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到纯化的单克隆抗体，小瓶分装，-20℃保存。

在凝集试验中抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体与土拉热弗朗西斯菌各个菌株可在2分钟内发生特异性凝集，但不与其他相关或常见菌发生凝集；在免疫荧光试验中抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体可与土拉热弗朗西斯菌各个菌株发生反应，但不与其他相关或常见菌发生交叉反应。说明抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体具有较高的特异性。该单克隆抗体与Ft9(端青，赵忠利，田青，等.土拉菌单克隆抗体的制备及其特性的研究[J].中国人兽共患病杂志，2000，16(2)：3-4.)均有较好的亲和性和特异性，且前者的效价比后者更高，达10⁷以上。

2)抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体的抗原识别位点的确定

土拉热弗朗西斯菌(军事医学科学院微生物流行病研究所，保藏号410062)接种于葡萄糖半胱氨酸兔血琼脂斜面，37℃培养48小时。

将上述培养的土拉热弗朗西斯菌用0.5％甲醛生理盐水收集菌液，混匀后用橡皮塞密盖，37℃过夜取出，即为土拉热弗朗西斯菌全菌甲醛固定抗原；

将上述培养的土拉热弗朗西斯菌用无菌生理盐水收集菌液，混匀后100℃水浴加热固定10-15分钟，即为土拉热弗朗西斯菌加热固定全菌抗原；

将上述培养的土拉热弗朗西斯菌用无菌生理盐水收集菌苔制备菌悬液，菌悬液置于68℃水浴平衡至68℃后缓慢加入等体积68℃90％苯酚，搅拌30分钟。4℃水浴冷却10分钟，10,000g离心45分钟，吸出上层水相装入半透膜袋中流水透析24小时，然后与蒸馏水4℃透析48小时。收集袋中液体，13,000g离心20分钟，收集上清即为脂多糖抗原(LPS抗原)。

以上述制备的土拉热弗朗西斯菌甲醛固定全菌抗原、土拉热弗朗西斯菌LPS抗原、分别经高碘酸钠和蛋白酶K处理的土拉热弗朗西斯菌LPS抗原和土拉热弗朗西斯菌加热固定全菌抗原为抗原，SDS-PAGE电泳转移膜后与抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体进行Western-blot。结果如图1所示，表明抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体与土拉热弗朗西斯菌甲醛固定全菌抗原和加热固定全菌抗原出现细菌LPS典型的梯形免疫印迹带，与LPS抗原在43-94KD间出现免疫印迹带。抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体与经蛋白酶K处理的LPS抗原也出现免疫印迹带，但与经高碘酸钠处理的LPS抗原不出现免疫印迹带。结果表明抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCCNo.1566分泌的单克隆抗体的抗原识别位点是土拉热弗朗西斯菌的LPS抗原，为土拉热弗朗西斯菌LPS的耐热成分。图1中a为土拉热弗朗西斯菌甲醛固定全菌抗原，b为加热固定全菌抗原，c为Markers，d为LPS抗原。

2、制备免疫胶体金探针

1)制备胶体金溶液:采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。冷却后用蒸馏水恢复至原体积，制成颗粒直径为25nm的胶体金颗粒。

2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度：用0.2M K₂CO₃或0.1M HCl调节胶体金溶液pH9.0，准备5支洁净试管，分别加入1ml胶体金溶液。将经纯化的抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体稀释为1mg/ml，分别向4支试管中加入10ul、15ul、25ul、35ul，另一支为对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μl，即25μg/ml。选择偶联抗体浓度为30μg/ml。

3)金标垫2的制备：按上述方法配制含有浓度为30μg/mL的抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体的免疫胶体金探针溶液50ml，搅拌20分钟，加10％BSA5ml，搅拌20分钟，加1ml10％PEG20000，搅拌20分钟，23,000g离心15分钟，吸出上清，20,000～32,500g离心25分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5ml。取金标探针5ml加入0.5g蔗糖，充分溶解均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃～-50℃放置10小时，冻干机抽干，得到金标垫2。

3、土拉热弗朗西斯菌快速检测试纸的制备

如图2所示，检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

1)NC膜3的包被：

用0.01M pH7.2PB缓冲液(NaH₂PO₄.2H₂O0.39g，Na₂HPO₄1.07g，去离子水1000ml)稀释抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体，浓度为1mg/ml，用于包被检测线。用0.01M pH7.2的PBS(NaH₂PO₄.2H₂O0.39g，Na₂HPO₄1.07g，NaCl8.5g，去离子水1000ml)稀释羊抗鼠IgG，浓度为3mg/ml，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥2.5h。

2)土拉热弗朗西斯菌快速检测试纸的制备

将吸水垫4用双面胶粘贴在包被的硝酸纤维膜3的一端，将包被的NC膜3用双面胶粘贴在步骤2中制备的金标垫2的一端；在金标垫2上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫1；再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

4、检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤3制备的土拉热弗朗西斯菌快速检测的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有观测窗。

5、土拉热弗朗西斯菌快速检测试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相羊抗鼠IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

实施例2、土拉热弗朗西斯菌的检测及与其它相关细菌的交叉试验

1、土拉热弗朗西斯菌的检测

1)购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心的5株不同来源、浓度为1×10⁵cfu/ml的土拉热弗朗西斯菌株：土拉热弗朗西斯菌410101、土拉热弗朗西斯菌410102、土拉热弗朗西斯菌410103、土拉热弗朗西斯菌410104、土拉热弗朗西斯菌410105，菌悬液作为样品检测液备用。

2)经实施例1制备的包被土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体和羊抗鼠IgG的免疫层析试纸检测均为阳性结果。

2、其他相关细菌的交叉试验

1)购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心、浓度为10⁸cfu/ml的布鲁氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和嗜肺军团菌3种菌，菌悬液作为样品检测液备用。

2)经实施例1制备的包被土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体和羊抗鼠IgG的免疫层析试纸检测均为阴性结果。

实施例3、临床和环境疑似土拉热弗朗西斯菌标本的检测

测定时，分别往实施例1制备的试剂盒的样品孔加入上述样品检测液3滴(150ul)，2分钟后通过检测窗口开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告：质控线处出现1条红沉淀线为阴性，而检测线处无沉淀线，即无土拉热弗朗西斯菌检出；质控线和检测线处各出现1条沉淀线为阳性，即有土拉热弗朗西斯菌检出。质控线和检测线处均无红色沉淀线，说明试纸失效。

1)纯培养细菌：挑取疑似土拉热菌单个菌落，于小试管中制成0.5ml生理盐水菌悬液作为样品检测液。

临床标本：取疑似土拉热患者或病畜皮肤溃疡病灶分泌物、血、痰标本、或死亡动物肝脾研磨标本，加少量生理盐水充分振荡混均，自然沉降后取上清0.5ml作为样品检测液。

环境中污染物：取疑似土拉热菌污染的土壤、物体表面、动物皮毛的擦拭子，浸于1ml生理盐水中，自然沉降后或挤干擦拭子，取上清0.5ml作为样品检测液，或取疑似污染水0.5ml作为样品检测液。

上述样品用实施例1制备的免疫层析试纸检测，结果如表1所示，与PCR检测方法得到的结果一致。

表1  土拉热弗朗西斯菌免疫层析试纸检测临床和环境疑似标本结果

2)阳性标准品：表2中的19株土拉热弗朗西斯菌不同分离株(军事医学科学院微生物流行病研究所)

阴性标准品：表2中的大肠埃希氏菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、布鲁氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、嗜肺军团菌和金黄色葡萄球菌(军事医学科学院微生物流行病研究所)。

将上述菌种在相应固体培养基上传代，分别用生理盐水洗下菌苔，比浊法配制菌悬液10⁵cfu/ml和10⁸cfu/ml，作为样品检测液备用。结果如表1所示，用实施例1制备的试纸检测不同来源的19株土拉热弗朗西斯菌10⁵cfu/ml和10⁸cfu/ml均为阳性。用试纸检测相关细菌和常见菌10⁵cfu/ml和10⁸cfu/ml均为阴性。

表2  土拉热弗朗西斯菌免疫层析试纸检测标准品

实施例4、检测土拉热弗朗西斯菌抗原的免疫层析试纸的稳定性试验

按照制造检定规程要求，对实施例1制备的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸试剂盒的质量进行稳定性考核，以确定试剂保存条件及有效期。

将实施例1制备的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸试剂盒中的三批(批号：020101、020102、020103)，分别放入37℃和20℃孵箱中。37℃孵箱中的试剂盒，于放置后10天、20天、30天取出检测。20℃孵箱中的试剂盒，于放置后每月检测1次，观察并记录14个月的实验结果。

将土拉热弗朗西斯菌接种葡萄糖半胱氨酸血琼脂，37℃5％CO₂培养48小时。用无菌生理盐水洗下菌苔，调至比浊浓度，沸水10分钟，冷却至室温。用生理盐水调菌液10⁸cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml，即为检测用菌液。

取实施例1制备的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸试剂盒，分别加入经上述稀释的菌液样本3滴(约150ul)，并以生理盐水为阴性对照，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告：于质控线处出现1条红色沉淀线为阴性，即无土拉热弗朗西斯菌检出；于质控线处和检测线处各出现1条红色沉淀线为阳性，即有土拉热弗朗西斯菌检出，质控线和检测线处均无红色沉淀线，说明试纸失效。检测结果如表3～5所示。结果表明，实施例1制备的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸试剂盒20℃放置14个月和37℃放置30天，检测结果无区别，实施例1制备的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸试剂盒4-25℃避光保存，有效期为12个月。

表3.免疫层析试纸试剂盒020101批稳定性试验结果

表4.免疫层析试纸试剂盒020102批稳定性试验结果

表5.免疫层析试纸试剂盒020103批稳定性试验结果

Claims (5)

1.一种检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸，包括依次紧密串联的样品垫、含有土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记胶体金探针的金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，所述质控线为抗鼠抗抗体；所述土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体为抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5 CGMCC No.1566分泌的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸，其特征在于：所述土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体标记胶体金探针由下述方法制备：将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下加入1.6ml的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，冷却后用水恢复至原体积，用K₂CO₃调pH值为8.5-9.5，按30ug/ml加入土拉热弗朗西斯菌单克隆抗体，搅拌20-30分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-30分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20分钟，23,000g离心15分钟，吸出上清，25,000g-35,000g离心25-35分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针；所述百分含量均为质量百分含量。

3.抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5 CGMCC No.1566。

4.权利要求3所述的抗土拉热菌杂交瘤细胞株Ft5 CGMCC No.1566产生的单克隆抗体。

5.含有权利要求1所述的检测土拉热弗朗西斯菌的免疫层析试纸的试剂盒。

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