CN101692089A

CN101692089A - 一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法

Info

Publication number: CN101692089A
Application number: CN200910177452A
Authority: CN
Inventors: 端青; 赵海; 朱虹; 何君; 檀华; 李岩伟
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2010-04-07

Abstract

本发明公开了一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有牛型结核分枝杆菌抗原，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。本发明的免疫层析试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种牛型结核分枝杆菌抗体的检测试纸及其制备方法，特别是涉及一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，已报道的分枝杆菌有100多种。有关分枝杆菌的分类有很多，国际上通常将分枝杆菌分为典型结核分枝杆菌(tuberculosismycobacterium，TM)，和非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacterium，NTM)。TM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)，该群中DNA相关性约为85％～100％，分类地位相近；NTM指MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其它分枝杆菌。

结核是由MTBC中细菌引起的人畜共患传染病，近年来全球发病率逐年上升，特别是近年来发现由牛结核分枝杆菌引起的人类结核已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明，结核病牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境，因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。

牛结核病抗体检测的方法很多，例如：ELISA和免疫传感器技术等。但在实践中，这些方法的使用暴露出一些共同的劣势，例如：实验必须在专门的实验室中进行；需要电源和特殊的仪器；操作人员必须经过专门培训；实验系统不容易标准化，不容易在基层推广，为使结果可信，需要进行多次预试验和设立多项对照；试验操作步骤繁琐，至少需要2小时以上。

表面脂蛋白83(cell surface lipoprotein MPB83，MPB83)和主要分泌性免疫蛋白70(major secreted immunogenic protein mpb70，MPB70)是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原，并可在其中高水平表达(如MPB70可占牛结核分枝杆菌培养滤液蛋白的10％)，而在人型结核分枝杆菌H37Rv株中仅有少量产生，至今尚未证明MPB83在结核分枝杆菌复合群以外的分枝杆菌中存在。因此，MPB83和MPB70具有显著的种特异性。

MPB70编码基因大小约583bp，蛋白分子量约为22KDa，是感染动物体内T细胞识别的一种血清优势抗原，BCG接种牛的T细胞不识别MPB70。MPB83编码基因大小约603bp，蛋白分子量约为30KDa，是牛分枝杆菌的免疫主导蛋白，也是牛结核菌素的有效成分，能诱导很强的迟发型变态反应，刺激T淋巴细胞增殖和抗体产生。MPB70和MPB83的氨基酸序列具有61％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同的抗原决定簇。但与MPB70不同的是，MPB83是牛分枝杆菌表面相关性脂蛋白，其基因片段中含有一段典型的脂蛋白序列，并且在N端插有5个独特的氨基酸(Behr MR.et al.Mutations inMycobacterium tuberculosis Rv0444c，the gene encoding anti-SigK，explain highlevel expression of MPB70 and MPB83 in Mycobacterium bovis[J].Mol microbial2006，62(5)：1251-1263.)。

6Kda早期分泌性蛋白(6kDa early secretory antigenic target，ESXA)和10Kda培养滤液蛋白(10kDa culture filtrate antigen，ESXB)是近几年研究较多的两种结核分枝杆菌蛋白抗原，是存在于致病性结核分枝杆菌培养滤液中的早期分泌蛋白，均由BCG缺失的基因片段(RD1)所编码(Van pinxteren，Laurens A.H，et al.Diagnosisof Tuberculosis Based on the Two Specifi c Antigens ESAT-6and ESXB[J].Clinicaland diagnostic laboratory immunology，2000，7(2)：155-160)，序列有25％的同源性，诱导强烈的T淋巴细胞增殖活化和细胞因子分泌。

免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较，优势在于：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。

目前，将胶体金免疫层析技术用于体外检测牛结核分枝杆菌在国内尚属空白。美国CHEMBIO DIAGNOSTICS公司应用ESXA、ESXB和MBP83混合抗原研制了一种体外免疫胶体金诊断试剂产品——PrimaTB STAT-PAK，本发明将MPB83、MPB70、ESXA和ESXB配比混合作为检测抗原尚属首次，具有高特异性和高敏感性。

发明内容

本发明目的是提供一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸(ICA试纸)，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有牛型结核分枝杆菌重组MPB70、MPB83、ESXA和ESXB，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。

所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为1-3mg/mL、MPB83的浓度为1-3mg/mL、ESXA和ESXB的浓度为1-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为1∶1-1∶1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为3-5mg/mL。

所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。

检测样品时可将上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的背面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB抗原，将牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB抗原配比混合溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；

2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸。

在上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的制备方法中，步骤1)中所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为1-3mg/mL、MPB83的浓度为1-3mg/mL、ESXA和ESXB的浓度为1-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为1∶1-1∶1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为3-5mg/mL。

所述步骤1)中的MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原可按下述方法制备：

1)扩增序列1的基因；

2)将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；

3)筛选阳性克隆；

4)诱导表达得到目的蛋白。

所述步骤1)中的干燥温度可为30-45℃，优选为37℃，干燥时间可为2.5-3.5小时。

步骤2)中牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法可包括以下步骤：

A.将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸(优选为10-12分钟)，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；

B.将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌25-35分钟，加入5mL 10％BSA，搅拌20-30分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌20-30分钟，先在20,000-23,500rpm下离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到嗜金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。

在上述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法中，可用K₂CO₃溶液或HCl溶液调pH值为8.5-9.5，所述调节pH值的K₂CO₃溶液的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值HCl溶液的浓度可为0.08-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。

为使金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向步骤2)中的金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；为使金标垫更易与纤维素膜粘贴，可将金标垫在-20℃至-50℃冷冻10-12小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。

所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。

检测样品时可将上述检测牛型结核分枝杆菌抗原的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测牛型结核分枝杆菌抗原的免疫层析试纸的背面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

在实际应用中，所述纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，宽度控制在2.5-3.0mm为宜；所述吸水垫可为吸水纸，宽度为20-40mm，厚度为0.1-0.2mm；所述金标垫的宽度为5-10mm；所述样品垫为玻璃纤维膜，宽度为20-40mm。

本发明提供了一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸利用了免疫胶体金技术及双抗夹心检测法，用其检测牛型结核分枝杆菌抗体的基本原理是：用牛型结核分枝杆菌抗原包被纤维素膜，用以捕捉标本中的结核分枝杆菌抗体，然后用标记了金黄色葡萄球菌蛋白A的免疫胶体金探针进行检测。本发明的免疫层析试纸具有以下优点：1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试纸可用于检测牛型结核分枝杆菌血清标本，并且不与其它生物发生交叉反应；2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的牛结核分枝杆菌抗体经过约5分钟的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为牛结核病的诊断隔离争取了时间，很适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在牛型结核分枝杆菌抗体的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的正面和纵截面结构示意图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。

材料：

硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸，购自Millipore公司。

塑料背板，购自北京燕华公司。

实施例1、牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB的制备

1、利用PCR方法对MPB70全DNA进行扩增，其引物是：

1：5’-CGCGGATCCATGAAGGTAAAGAACACAATTGC-3’；

2：5’-CCCAAGCTTTTACGGAGGCATTAGCACGCTGT-3’。

利用PCR方法对MPB83全DNA进行扩增，其引物是：

1：5’-CGCGGATCCATGATCAACGTTCAGGCAAACC-3’；

2：5’-CCCAAGCTTTTACAGCACCGTATCGATCATG-3’。

利用PCR方法对ESXA全DNA进行扩增，其引物是：

1：5’-CGCGGATCCATGACCATCAACTATCAATTCGG-3’；

2：5’-CCCAAGCTTTTAGGCCCAGCTGGAGCCGAC-3’。

利用PCR方法对ESXB全DNA进行扩增，其引物是：

1：5’-GGATCCATGGCAGAGATGAAGACCG-3’；

2：5’-AAGCTT TCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3’。

以上引物均引入BamHI和HindIII酶切序列

2、将目的片段从T载体上切下，与经相同酶切的pET32a(+)载体相连，转入表达型菌体BL21(DE3)中。

3、挑取阳性菌落，菌液和培养液的比例为1∶50，同时加入Amp(1∶1000)，37℃、250rpm摇床培养4小时，至菌液OD₆₀₀＝0.7-0.9，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养5小时，离心集菌。

4、用含30％蔗糖，50mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0的溶液重悬，冰浴30min，离心集菌。

5、用超声缓冲液(50mM NaH₂PO₄ pH7.8，300mM NaCl)重悬菌体沉淀至适当浓度，超声破碎60分钟，30秒间歇18秒，超声次数40次，功率35％。

6、10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)，沉淀即为包涵体。

7、生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。

8、生理盐水重悬沉淀8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。

9、生理盐水重悬沉淀，超声破碎60分钟，10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。

10、将沉淀用10％Triton x-100重悬，磁力搅拌器搅拌30min，8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。

11、用含8M尿素的缓冲液(NaH₂PO₄ 0.1M，Tris-HCl pH8.0，0.01M)溶解沉淀。

12、12000rpm离心15分钟，上清即为含重组蛋白的缓冲液，置含6M尿素的复性液(100mMTris-HCl，2mM EDTA pH8.0，0.2M盐酸精氨酸，0.004M氧化型谷胱甘肽，0.002M还原型谷胱甘肽)中透析4小时以上。

13、转置含4M尿素的复性液中透析4小时以上。

14、转置含2M尿素的复性液中透析4小时以上。

15、转置含1M尿素的复性液中透析4小时以上。

16、转置蒸馏水中中透析4小时以上。

17、获得复性的牛型结核分枝杆菌重组MPB70、MPB83、ESXA和ESXB。

二、制备免疫胶体金探针

1、制备胶体金溶液

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄(购自Sigma公司，1g/瓶包装)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。冷却后用蒸馏水恢复至原体积，制成颗粒直径为25nm的胶体金颗粒。

2、确定胶体金偶联抗体饱和浓度

用0.2M K₂CO₃(或0.1M HCl)调节胶体金溶液pH 8.5-9.5，准备4支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将金黄色葡萄球菌蛋白A(购于Amersham Pharmacia Biotech公司)稀释为1mg/mL，分别向3支试管中加入5μl、10μl、15μl，另一支为对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1mL胶体金所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为10μl，即10μg/mL，选择偶联抗体浓度为12μg/mL。

3、金标垫的制备

按上述方法配制含有浓度为12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌30分钟(25-35分钟均可)，加1mL 10％PEG20000，搅拌25分钟(20-30分钟均可)，20,000～23,500rpm离心25-30分钟，弃上清，将沉淀用四硼酸钠洗涤1次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5mL。取金标探针5mL加入0.5g蔗糖，充分溶解后均匀加在玻璃纤维膜上，-35℃(-20℃～-50℃均可)放置11小时(10-12小时均可)，冻干机抽干，得到金标垫。

三、牛型结核分枝杆菌抗体快速检测试纸的制备

如图1所示，本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。该试纸的制备方法包括以下步骤：

1)NC膜3的包被

用0.01M、pH7.2的PB缓冲液(NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，去离子水1000mL)稀释MPB70、MPB83、ESXA和ESXB抗原，将经稀释的四种抗原溶液混合，至每毫升溶液中MPB70、MPB83、ESXA和ESXB抗原的含量分别为2mg、1mg、3mg、2.5mg，用于包被检测线。用0.01M pH 7.2PBS(NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，NaCl 8.5g，去离子水1000mL)稀释羊抗人IgG(用人的IgG免疫羊获得，具体制备方法见《免疫化学研究进展》，李成文著，中国科学技术出版社，1993年)至浓度为4mg/mL，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥3h(2.5-3.5h均可)。

2)牛型结核分枝杆菌抗体快速检测试纸的制备

将吸水垫4用双面胶粘贴在包被的硝酸纤维膜3的一端；将包被的NC膜3用双面胶粘贴在步骤2中制备的金标垫2的一端；在金标垫2上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫1；再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

四、检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤三制备的牛型结核分枝杆菌抗体快速检测的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有观测窗。

五、牛型结核分枝杆菌快速检测试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物溶液，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗体，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗原所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相羊抗人IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

实施例2、牛型结核分枝杆菌抗体的检测及与其它相关细菌血清样品的交叉试验

一、其它相关细菌血清样品的交叉试验

用购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心的大肠埃希氏菌(保藏号270014)、沙门氏菌(保藏号460046)、痢疾志贺氏菌(保藏号51258)、绿脓假单胞菌(保藏号10101)、鼠疫菌(保藏号410050)、布鲁氏菌(保藏号55227)、金黄色葡萄球菌(保藏号26067)的抗血清样品作为样品检测液备用，以牛型结核分枝杆菌抗血清检测液为对照。

结果报告：以血清效价1∶40以上为阳性诊断标准，仅于质控观测窗口“C”(质控线)处出现1条红色沉淀线(对照)，为与嗜肺军团菌无交叉反应；于检测观测窗口“T”(检测线)和质控观测窗口“C”(质控线)处出现2条红色沉淀线(样品和对照)，为与嗜肺军团菌有交叉反应；如质控观测窗口“C”(质控线)处未出现红色沉淀线，则说明检测试纸失效，此时无论检测观测窗口“T”(检测线)处是否出现沉淀线，检测结果不成立。

用实施例1制备的包被牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB抗原和羊抗人IgG的免疫层析试纸对上述抗血清样品进行检测，结果对照为阳性，其它检测样品为阴性，证明本发明的免疫层析试纸可用于牛型结核分枝杆菌抗体的快速检测，特异性高。

实施例3、实验室考核

1、样品制备

将购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心的嗜肺军团菌1-10型、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞菌、鼠疫菌、布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌的抗血清样品用生理盐水按1∶40比例稀释后作为样品检测液备用。

2、实验方法

取实施例1制备的装有本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的试剂盒，分别于点样口中加入上述样品检测液3滴(约150ul)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。

结果报告：仅于质控观测窗口“C”(质控线)处出现1条红色沉淀线为阴性，即无牛型结核分枝杆菌抗体检出；于检测观测窗口“T”(检测线)和质控观测窗口“C”(质控线)处出现2条红色沉淀线为阳性，即有牛型结核分枝杆菌抗体检出；如质控观测窗口“C”(质控线)处未出现红色沉淀线，则说明检测试纸失效，此时无论检测观测窗口“T”(检测线)处是否出现沉淀线，检测结果不成立。

3、实验结果

本发明的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的实验室考核结果如表1所示，由表1可以看出，本发明的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸可以检出牛型结核分枝杆菌抗体，且不与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞菌、鼠疫菌、布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌发生交叉反应。上述检测结果证明本发明的免疫层析试纸可用于牛型结核分枝杆菌抗体的快速检测，并具有较高的灵敏度及特异性。

表1本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸(胶体金法)的实验室考核结果

细菌	株号	血清型	样品稀释度1∶40
细菌	株号	血清型	样品稀释度1∶40	牛型结核分枝杆菌	C70-8	+
大肠埃希氏菌	270014		-	牛型结核分枝杆菌	C70-8	+
大肠埃希氏菌	270014		-	沙门氏菌	460046	-
痢疾志贺氏菌	51258		-	沙门氏菌	460046	-
痢疾志贺氏菌	51258		-	绿脓假单胞菌	10101	-
鼠疫菌	410050		-	绿脓假单胞菌	10101	-
鼠疫菌	410050		-	布鲁氏菌	55227	-
金黄色葡萄球菌	26067		-	布鲁氏菌	55227	-

序列表

<160>8

<210>1

<211>582

<212>DNA

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

<400>1

atgaaggtaa agaacacaat tgcggcaacc agtttcgcgg cggccggcct ggcggctctg 60

gcggtggctg tctcaccgcc ggcggccgca ggcgatctgg tgggcccggg ctgcgcggaa 120

tacgcggcag ccaatcccac tgggccggcc tcggtgcagg gaatgtcgca ggacccggtc 180

gcggtggcgg cctcgaacaa tccggagttg acaacgctga cggctgcact gtcgggccag 240

ctcaatccgc aagtaaacct ggtggacacc ctcaacagcg gtcagtacac ggtgttcgca 300

ccgaccaacg cggcatttag caagctgccg gcatccacga tcgacgagct caagaccaat 360

tcgtcactgc tgaccagcat cctgacctac cacgtagtgg ccggccaaac cagcccggcc 420

aacgtcgtcg gcacccgtca gaccctccag ggcgccagcg tgacggtgac cggtcagggt 480

aacagcctca aggtcggtaa cgccgacgtc gtctgtggtg gggtgtctac cgccaacgcg 540

acggtgtaca tgattgacag cgtgctaatg cctccggcgt aa 582

<210>2

<211>603

<212>DNA

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

<400>1

atgatcaacg ttcaggccaa accggccgca gcagcgagcc tcgcagccat cgcgattgcg 60

ttcttagcgg gttgttcgag caccaaaccc gtgtcgcaag acaccagccc gaaaccggcg 120

accagcccgg cggcgcccgt taccacggcg gcaatggctg accccgcagc ggacctgatt 180

ggtcgtgggt gcgcgcaata cgcggcgcaa aatcccaccg gtcccggatc ggtggccgga 240

atggcgcaag acccggtcgc taccgcggct tccaacaacc cgatgctcag taccctgacc 300

tcggctctgt cgggcaagct gaacccggat gtgaatctgg tcgacaccct caacggcggc 360

gagtacaccg ttttcgcccc caccaacgcc gcattcgaca agctgccggc ggccactatc 420

gatcaactca agactgacgc caagctgctc agcagcatcc tgacctacca cgtgatagcc 480

ggccaggcga gtccgagcag gatcgacggc acccatcaga ccctgcaagg tgccgacctg 540

acggtgatag gcgcccgcga cgacctcatg gtcaacaacg ccggtttggt atgtggcgga 600

gttcacaccg ccaacgcgac ggtgtacatg atcgatacgg tgctgatgcc cccggcacag 660

taa 663

<210>3

<211>288

<212>DNA

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

<400>1

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288

<210>4

<211>303

<212>DNA

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

<400>1

atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60

atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120

ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180

gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240

gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300

tga 303

<210>5

<211>193

<212>PRT

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

<400>2

Met Lys Val Lys Asn Thr Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Val Ser Pro Pro Ala Ala Ala

20 25 30

Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn

35 40 45

Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val

50 55 60

Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala

65 70 75

Ala Leu Ser Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr

80 85 90

Leu Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala

95 100 105

Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn

110 115 120

Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Val Ala Gly

125 130 135

Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu Gln

140 145 150

Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val

155 160 165

Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala

170 175 180

Thr Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu Met Pro Pro Ala

185 193

<210>6

<211>220

<212>PRT

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

Met Ile Asn Val Gln Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ile Ala Phe Leu Ala Gly Cys Ser Ser Thr Lys Pro

20 25 30

Val Ser Gln Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ser Pro Ala Ala

35 40 45

Pro Val Thr Thr Ala Ala Met Ala Asp Pro Ala Ala Asp Leu Ile

50 55 60

Gly Arg Gly Cys Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Pro Thr Gly Pro

65 70 75

Gly Ser Val Ala Gly Met Ala Gln Asp Pro Val Ala Thr Ala Ala

80 85 90

Ser Asn Asn Pro Met Leu Ser Thr Leu Thr Ser Ala Leu Ser Gly

95 100 105

Lys Leu Asn Pro Asp Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Gly Gly

110 115 120

Glu Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Asp Lys Leu

125 130 135

Pro Ala Ala Thr Ile Asp Gln Leu Lys Thr Asp Ala Lys Leu Leu

140 145 150

Ser Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Ile A1a Gly Gln Ala Ser Pro

155 160 165

Ser Arg Ile Asp Gly Thr His Gln Thr Leu Gln Gly Ala Asp Leu

170 175 180

Thr Val Ile Gly Ala Arg Asp Asp Leu Met Val Asn Asn Ala Gly

185 190 195

Leu Val Cys Gly Gly Val His Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met

200 205 210

Ile Asp Thr Val Leu Met Pro Pro Ala Gln

215 220

<210>7

<211>95

<212>PRT

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp

20 25 30

Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala

50 55 60

Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr

65 70 75

Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val

80 85 90

Thr Gly Met Phe Ala

95

<210>8

<211>100

<212>PRT

<213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97)

Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala

1 5 10 15

Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp

20 25 30

Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly

35 40 45

Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu

50 55 60

Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn

65 70 75

Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln

80 85 90

Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe

95 100

Claims

1.一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有结核分枝杆菌抗原，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。

2.根据权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于：所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为1-3mg/mL、MPB83的浓度为1-3mg/mL、ESXA和ESXB的浓度为1-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为1∶1-1∶1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为3-5mg/mL。

3.根据权利要求2所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于：所述结核分枝杆菌抗原为MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原

4.根据权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于：所述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的背面紧密连接一背板。

5.一种制备权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

A.制备牛型结核分枝杆菌抗原，将结核分枝杆菌抗原溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；

B.制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

C.将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、MPB83、ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为1-3mg/mL、MPB83的浓度为1-3mg/mL、ESXA和ESXB的浓度为1-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为1∶1-1∶1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为3-5mg/mL。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的干燥温度为30-45℃，干燥时间为2.5-3.5小时；步骤2)中牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法包括以下步骤：

B.将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌25-35分钟，加入5mL 10％BSA，搅拌20-30分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌20-30分钟，先在20,000-23,500rpm下离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：在所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法中，用K₂CO₃溶液或HCl溶液调pH值为8.5-9.5，所述调节pH值的K₂CO₃溶液的浓度为0.15-0.25M；所述调节pH值HCl溶液的浓度为0.08-0.12mol/L。

9.根据权利要求5-8任一项所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：向所述步骤2)中的牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；将金标垫在-20℃至-50℃冷冻10-12小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴；在所述步骤3)获得的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的背面紧密粘贴一背板；所述纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述吸水垫为吸水纸；所述样品垫为玻璃纤维膜。