JP4943515B2 - 結核菌群の免疫検出法 - Google Patents
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Description
また、本発明の他の目的は、生体試料中のMPT64抗原を高感度で検出することにより、生体試料を、培養すること無く、または、該試料中の結核菌群菌体が実質的に増殖するに至らない時間だけ培養した後、そのまま免疫測定に供することができるようにし、結核菌群による感染の診断を従来よりも迅速かつ安全に行うことができるようにすることにある。
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではないが、サンドイッチ式免疫測定法、とりわけELISA(Enzyme−linked immunosorbent assay)法、イムノクロマトグラフィー測定法などが好ましい。
本発明において、ポリクローナル抗体は、例えば、配列番号1に記載されるアミノ酸配列をコードするDNA配列のうち、配列番号2乃至4のアミノ酸配列に対応するDNA断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。
一般に、かかるイムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されて構成される。第一の抗体および第二の抗体は、上述のように、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。MPB64は単量体蛋白なので、第一の抗体及び第二の抗体は「ヘテロ」の組み合わせで用いられ、すなわち、抗原上の位置および構造の何れもが異なる各抗原決定基をそれぞれ認識する第一の抗体及び第二の抗体が組み合わせて用いられる。例えば、第一の抗体として配列番号2のアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対するモノクローナル抗体を使用した場合は、第二の抗体として配列番号3又は4のアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対するモノクローナル抗体が使用される。
図示の例では、膜担体3は、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体3には、そのクロマト展開始点側の末端から7.5mmの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位31が形成される。
図示の例では、膜担体3は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位31を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図示の例では、含浸部材2として、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布(濾紙、ニトロセルロース膜等)、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
このうち、捕捉部位31での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。また、高感度化の観点からは、蛍光標識物質を用い、捕捉部位31の観察を蛍光イムノクロマトリーダーを用いて行えるようにすることが好ましい。
さらに、必要に応じて、含浸部材2の上面に試料添加用部材5の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材5の上流側部分を粘着シート1に貼着してもよく、また、膜担体3の下流側部分の上面に吸収用部材4の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材4の下流側部分を粘着シート1に貼着せしめることもできる。
吸収用部材4は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により捕捉部位31が発色するので、直ちに、検体を定性的または定量的に測定することができる。標識物質として蛍光標識物質を使用した場合は、捕捉部位31に集積した蛍光物質の蛍光量を測定機器で読み取り、定量的に測定することができる。
なお、本発明では、第二の抗体又は第二の抗体を含有する前記含浸部材を膜担体上に配置せず、適当な容器に収納しておき、当該容器内で被験試料と第二の抗体を混合して膜担体に注入することにより、膜担体にてクロマト展開可能なように用意しておくこともできる。
液体培養は、例えば、1ml〜10mlの培養容器に液体培地100μl〜5mlを包入し、上記培養期間だけ好気的に振とう培養することで行うことができる。
上記分散処理と上記可溶化処理は、単独で行っても、両者を併用して行ってもよい。
Mycobacterium bovis BCG Tokyo株をミドルブルック7H11液体培地により培養し得られた培養上清よりMPB64を精製した。得られたMPB64を抗原として、当該タンパク質に対するモノクローナル抗体を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従っておこなった。
すなわち、100μgの精製MPB64と等量のAdjuvant Complete Freund (Difco)を混合して、マウス(BALB/c、5週齢、日本SLC)に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞(Shulmanら、1978)を用いた。
配列番号1のMycobacterium tuberculosis H37RV株由来のMPB64のアミノ酸配列より、N末端から12アミノ酸単位にて3アミノ酸のフレームシフトを伴う合計73個のポリペプチドをSPOTペプチド合成方法により作製した。なお、各アミノ酸配列は、SPOTによるペプチド合成方法のため、開始アミノ酸にプロリンが選択されないように選択した。そして、上記73個のポリペプチドをセルロースメンブレンに固相化したSPOTシート(JST、シグマアルドリッチ製)を作製した。SPOTシートを振動台上で2時間、実施例1にて作製したモノクローナル抗体 2μg/mlを含有するブロッキングバッファー(50 mM Tris.HCl、140 mM NaCl、5 mM NaEDTA、0.05% NP40 (Fluka)、0.25%ゼラチン(Sigma)、1% ウシ血清アルブミン (Sigma)、pH 7.4)とともに、1時間インキュベートし反応させた。反応後、振動台上でSPOTシートをPBS (10 mM リン酸緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.5)で3回3分間洗浄した。HRP標識抗マウスイムノグロブリンを1:1000の希釈度で添加し、1時間インキュベートした。これをPBS (10 mM リン酸緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.5)で3回3分間洗浄した。そして、発色基質TMBZを含む溶液に浸漬し発色させた。発色したスポットを目視により確認し、抗体の認識するポリペプチド配列を決定した。なお、上記73個のポリペプチドをN末端側から順次ポリペプチドNo.1〜No.73と呼ぶ。
モノクローナル抗体TB002は、ポリペプチドNo.32から35において発色が確認された。発色したスポットより、配列番号1のアミノ酸配列のN末端から103〜114番目のAIPPRGTQAVVL(配列番号2)を認識することが確認された。
モノクローナル抗体TB003は、ポリペプチドNo.59から64において発色が確認された。発色したスポットより、配列番号1のアミノ酸配列のN末端から184〜192番目のPVNYQNFAV(配列番号3)を認識することが確認された。
(1)抗MPB64抗体の調製
実施例1で得られたクローンのそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗MPB64抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗MPB64抗体とした。
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%(v/w)塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その1分後に1%(v/w)クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
上記(1)で得られ抗MPB64抗体を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗MPB64抗体の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す)と上記(2)の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」と記す)水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗MPB64抗体(以下、「金コロイド標識抗体」と記す)溶液を調製した。この溶液を遠心分離(5600×G、30分間)して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン(Triton)-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
図1に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
(4−1)抗MPB64抗体と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
抗MPB64抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μLを、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、MPB64タンパク質と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位31とした。抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用いた。
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗体溶液37.5μLを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。金コロイド標識抗体として、モノクローナル抗体TB001およびTB002の金コロイド標識抗体を用いた。
(4−3)イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図1と同様のクロマト法テストストリップを作成した。
実施例3にて作製したイムノクロマト法テストストリップ(捕捉部位に固定する抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用い、金コロイド標識抗体の抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB001を用いた)を用意した。
実施例3にて作製したイムノクロマト法テストストリップ(捕捉部位に固定する抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用い、金コロイド標識抗体の抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB002を用いた)を使用し、結核菌群および各種非結核性抗酸菌に対する反応性試験を実施した。培養された各菌株を検体希釈液にて希釈して調製し、被験試料とした。そして、被験試料100μLを滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後に目視判定を行った。対照として市販のイムノクロマト法テストキット「キャピリアTB(商品名;タウンズ社製)」を用い、同様の試験を実施した。結果を表2に示した。
またイムノクロマト法テストストリップ(捕捉部位に固定する抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用い、金コロイド標識抗体の抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB001を用いた)においても同様の結果を示した。
(1)抗MPB64抗体の調製
実施例1で得られたクローンのそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗MPB64抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗MPB64抗体とした。
上記(1)で得られた抗MPB64抗体を下記の手順でそれぞれ蛍光ラテックス標識した。
抗MPB64抗体の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す)と0.0002%(g/v) 蛍光ラテックス懸濁液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを蛍光ラテックス表面に結合させた後、蛍光ラテックス懸濁液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」と記す)水溶液を加え、この蛍光ラテックス粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、蛍光ラテックス標識抗MPB64抗体(以下、「蛍光ラテックス標識抗体」と記す)溶液を調製した。この溶液を遠心分離(5600×G、30分間)して蛍光ラテックス標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて蛍光ラテックス標識抗体を得た。この蛍光ラテックス標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン(Triton)-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に懸濁して蛍光ラテックス標識抗体溶液を得た。
図1に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
(3−1)抗MPB64抗体と蛍光ラテックス標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
抗MPB64抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μLを、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、MPB64タンパク質と蛍光ラテックス標識抗体との複合体の捕捉部位31とした。抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用いた。
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、蛍光ラテックス標識抗体溶液37.5μLを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて蛍光ラテックス標識抗体含浸部材2とした。蛍光ラテックス標識抗体としてモノクローナル抗体TB001を用いた。
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図1と同様のクロマト法テストストリップを作成した。
実施例6にて作製した蛍光イムノクロマト法テストストリップ(捕捉部位に固定する抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用い、蛍光ラテックス標識抗体の抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB001を用いた)を用意した。
臨床的に結核であると診断された患者より喀痰を採取し試料とした。採取された喀痰検体は均一化のため、プロテアーゼ処理を行い、N-アセチル-L-システイン・水酸化ナトリウム法(以下、NALC-NaOH法)処理を行った。前処理した検体をスライドグラスに塗布し塗抹標本を作成した。塗末標本をチールネルゼン染色し顕微鏡で観察した。結核菌検査視診2007に基づき判定した。検出菌数は1〜9/100視野を+、≧10/100視野を2+、≧10/1視野を3+とした。塗抹検査により判定された喀痰検体1mLに対し、セミアルカリプロテアーゼ溶液(商品名:スプタザイム、極東製薬社製)を添加し、室温で処理した。遠心操作の後、残渣に対しNALC-NaOH溶液を添加し、ボルテックスミキサーにより数秒間混合し、リン酸緩衝液(pH7.0)を添加し中和した。遠心操作の後、残渣を、0.1% Tween80を含むPBSにて再浮遊し、ガラスビーズを加えて攪拌することにより物理的に処理し、被験試料とした。被験試料100μLを実施例6で得られたテストストリップの試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位31で捕捉されたMPB64タンパク質と蛍光ラテックス標識抗体との複合体の捕捉量を蛍光イムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス製)にて測定した。陰性対照として、結核感染の無い健常者より採取された喀痰を上記と同様に処理したものを用いた。対照のテストストリップとして、市販のイムノクロマト法テストストリップ「キャピリアTB(商品名;タウンズ社製)」を用い、同様の試験を実施した。その結果を表4及び図2に示した。
(1)抗MPB64抗体の調製
実施例1で得られたクローンのそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗MPB64抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、抗MPB64抗体とした。
使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。390mlの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液(水溶液1リットル当たり金として1g 、片山科学工業株式会社製)30mlを加え、その後、1重量% クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、6分45秒後に、塩化白金酸水溶液(水溶液1リットル当たり白金として1g、和光純薬工業株式会社製) 30mlを加えた。塩化白金酸水溶液添加から5分後に1重量% クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、4時間、還流を行い、白金−金コロイド懸濁液を得た。
上記(1)で得られ抗MPB64抗体を下記の手順でそれぞれ白金−金コロイド標識した。
抗MPB64抗体の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す)と上記(2)の白金−金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを白金−金コロイド粒子表面に結合させた後、白金−金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」と記す)水溶液を加え、この白金−金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、白金−金コロイド標識抗MPB64抗体(以下、「白金−金コロイド標識抗体」と記す)溶液を調製した。この溶液を遠心分離(5600×G、30分間)して白金−金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて白金−金コロイド標識抗体を得た。この白金−金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン(Triton)-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に懸濁して白金−金コロイド標識抗体溶液を得た。
図1に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
(4−1)抗MPB64抗体と白金−金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
抗MPB64抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μLを、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、MPB64タンパク質と白金−金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位31とした。抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB003を用いた。
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、白金−金コロイド標識抗体溶液37.5μLを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて白金−金コロイド標識抗体含浸部材2とした。白金−金コロイド標識抗体として、モノクローナル抗体TB001およびTB002の金コロイド標識抗体を用いた。
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図1と同様のクロマト法テストストリップを作成した。
(1)イムノクロマト法テストストリップ
実施例9にて作製した白金-金コロイド標識イムノクロマト法テストストリップ(捕捉部位に固定する抗体としてモノクローナル抗体TB003を用い、白金-金コロイド標識抗体の抗MPB64抗体としてモノクローナル抗体TB001を用いた)を用意した。
ミドルブルック 7H11ブロスBase(Difco社製) 4.7gをTween80 0.5gを含む蒸留水900mlに溶解させた。オートクレーブにて121℃、10分間高圧滅菌した。冷却後、ADC Enrichment(albumin-dextrose-catalase)100mlを無菌的に加え、1.5mLマイクロチューブに対しそれぞれ200μLずつ分注した。対照培養基としてMGIT(日本ベクトン・ディッキンソン製)を用いた。
上記と同様の方法にて作製したミドルブルック 7H11液体培地を使用し、Mycobacterium bovis BCG Tokyo株を培養し菌体を得た。本菌体をMcFarland No.1相当(濃度1×108 cfu/ml)に調製し、標準菌液を作製した。健常者より得られた喀痰に本標準菌液を最終濃度104 cfu/mlになるよう添加し、擬似陽性喀痰検体を調製した。本擬似陽性喀痰検体をNALC-NaOH法により処理し、遠心分離によりペレットを得た。本ペレットにTween80を含むリン酸緩衝生理食塩水(以下PBSと称する)を添加し洗浄した。遠心分離により上清を除去し、Tween80を含むPBSに再懸濁し、各培養基にそれぞれ100μLずつ接種した。
数日の培養後、それぞれの培養基より培養上清を採取し被験試料とした。そして、被験試料100μLを上記テストストリップの試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位31で捕捉されたMPB64タンパク質と金属コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量はその量に比例して増減する呈色度合いを肉眼で、−(着色なし)、±(微弱な着色)、+(明確な着色)、++(顕著な着色)の4段階に区分して判定した。その結果を表5に示した。
2 含浸部材
3 膜担体
31 捕捉部位
4 吸収用部材
5 試料添加用部材
Claims (22)
- 結核菌群特異的分泌タンパク質MPB64に対する抗体を用いる免疫測定法からなり、前記抗体が、配列番号2乃至4の何れか1つのアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対する抗体を含有してなる、結核菌群の検出法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の検出法。
- 結核菌群特異的分泌タンパク質MPB64に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなり、前記第一の抗体および前記第二の抗体の少なくとも何れか一方が、配列番号2乃至4の何れか1つのアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対する抗体を含有してなる、結核菌群の検出法。
- 第一の抗体及び第二の抗体の少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体である請求項3に記載の検出法。
- 前記第一の抗体および第二の抗体の何れか一方を担体に固定しておく請求項4に記載の検出法。
- 生体試料を、培養すること無く、または、該試料中の結核菌群菌体が増殖するに至らない時間だけ培養した後、前記免疫測定法に供する、請求項3に記載の検出法。
- 前記生体試料を、結核菌の不活性化処理、又は、分散若しくは可溶化処理による前処理に付した後、前記免疫測定法に供する、請求項6に記載の検出法。
- 前記分散若しくは可溶化処理が、アルカリ性物質、還元性物質、プロテアーゼ及び界面活性剤からなる群より選ばれた少なくとも1つの生体試料への添加、又は、撹拌操作により行われる、請求項7に記載の検出法。
- 前記生体試料が喀痰である、請求項6乃至8の何れか1項に記載の検出法。
- 結核菌群特異的分泌タンパク質MPB64に対する第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、該MPB64に対する第二の抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる抗原と前記第二の抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させるイムノクロマトグラフィー測定法であって、前記第一の抗体および前記第二の抗体の少なくとも何れか一方が、配列番号2乃至4の何れか1つのアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対する抗体を含有してなる、結核菌群検出用のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第一の抗体及び前記第二の抗体の少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体である、請求項10に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記被験試料は、培養されていない生体試料、または、結核菌群菌体が増殖するに至らない時間だけ培養された生体試料を含むものである、請求項10に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記生体試料は、結核菌の不活性化処理、又は、分散若しくは可溶化処理によって前処理されたものである、請求項12に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記生体試料の分散若しくは可溶化処理が、アルカリ性物質、還元性物質、プロテアーゼ及び界面活性剤からなる群より選ばれた少なくとも1つの生体試料への添加、又は、撹拌操作により行われる、請求項13に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記生体試料が喀痰である、請求項12乃至14の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第二の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項10に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項16に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 結核菌群特異的分泌タンパク質MPB64に対する第一の抗体と第二の抗体と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマト法テストストリップであって、前記第一の抗体および前記第二の抗体の少なくとも何れか一方が、配列番号2乃至4の何れか1つのアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープに対する抗体を含有してなる、結核菌群検出用イムノクロマト法テストストリップ。
- 前記第一の抗体及び前記第二の抗体の少なくとも何れか一方がモノクローナル抗体である、請求項18に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記第二の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項18に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項20に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 配列番号2乃至4の何れか1つのアミノ酸配列に位置するMPB64のエピトープを認識するモノクローナル抗体。
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