JP2007316078A - 結核菌検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗MPB64蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗MPB64蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、MPT64蛋白またはMPB64蛋白と呈色標識抗MPB64蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
【選択図】図1
Description
このナイアシン産生試験は、結核症疑罹患患者の、たとえば、喀痰、暖めた1重量%滅菌食塩水をエアロゾルとしてネプライザーで深く吸入させて咳とともに喀出される痰、胃洗浄液、糞便および尿などのそれぞれの被検体を培地に培養して増殖せしめた結核菌から沸騰蒸留水で抽出し、抽出液中のナイアシンの存否を知ることによって、被検体中の結核菌の存否を知る方法である。
前者は、たとえば、米国などで行なわれており、被検体の培養期間は短縮されるが、作業時における結核菌感染の危険性が大きく、高度に安全な施設および装置が必要とされる。
本邦では、後者が行なわれており、結核菌感染の危険性は軽減されるが、分析結果が判明するまでに2ヵ月間程度の長期間が必要とされている。
しかして、後者においては、作業時における結核菌感染の危険性は軽減されはするが、依然として、安全性の高い環境で、かつ、安全性の高い装置を使用し、しかも、細心の注意を払われなければならないとされている。
他方、MPB64蛋白は、BCG菌株のウシ型結核菌(ミコバクテリウム ボビス BCG(Mycobacterium bovis BCG)(以下、BCG菌 と記す)によって産生され菌体外に分泌されるミコバクテリアル プロテインである。
エム.ハーボー(M.Harboe)は、このMPB64蛋白をBCG菌から分離、精製して、その性質などについて研究して報告している(Infection and Inmmunity 1986, Vol.52, No.1, 293〜302)。
従って、病原性的には無害なBCG菌を培養し、その培養液からBCGによって産生されたMPB64蛋白を抽出、精製し、該MPB64蛋白を抗原として抗MPB64蛋白抗体を作成し、その抗体を用いた抗原抗体反応(免疫反応)によって被検体中の結核菌を検出することにより、ヒトの結核症を明確、かつ迅速に判別することができる結核症の簡便な診断法を確立することが可能となる。
前二者においては凝集時間が、たとえば、3時間程度と長く、感度が低く、かつ定量性は全くないなどの不都合な問題がある。
後者においては、前二者に比較して試験操作が煩雑で、かつ通常は特殊な機械を使用する関係上、安全キャビネット中での実施が容易ではないなどの欠点がある。
前記第二抗MPB64蛋白抗体は、前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものであることが好ましい。
前記クロマト法テストストリップはケースに収容されていてもよい。
被検体は、常法により、固体培養または液体培養がなされる。
液体培養の場合には、たとえば、被検体液と水酸化ナトリウム水溶液とを混合して、この混合液から菌体を遠心分離によって分離し、分離された菌体を、たとえば、デュボス液体培地(ベクトン・デッキンソン社の商品)で37℃で培養した培養液を試料として検査に供する。
すなわち、ミコバクテリウム ボビスに属するBCG菌東京株のようなMPB64蛋白産生能力を有する菌株を、たとえば、ソートン培地のような液体培地で培養して得られた培養液から、塩析、透析、カラムクロマトグラフィおよび電気泳動などによる蛋白質の同定を逐次経由して精製MPB64蛋白が得られる。
単クローン抗体は、たとえば、ケラーミルシュタインの方法によって得られる。また、多クローン抗体は、好ましくは、ヤギを免疫して得られる。
呈色標識物質には、たとえば、コロイド状金属および着色ラテックスなどがある。
コロイド状金属の代表例として、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。
また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数拾nm乃至数百nm程度から選択することができる。
これらの呈色標識物質は、市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
クロマト法テストストリップとは、ケースの蓋体の試料注入口から、帯状の固相担体テストストリップの一端に検査試料を灌注することによりクロマト展開が開始されて浸潤して該テストストリップの呈色標識抗体含浸部材に到達し、該部材の呈色標識抗MPB64蛋白抗体と免疫反応して呈色結合物が形成され、さらに、該呈色結合物が捕捉部位まで浸潤して捕捉部位の第二抗MPB64蛋白抗体との免疫反応により捕捉されて、捕捉部位が呈色せしめられる方法である。
クロマト法テストストリップによる本発明の結核菌検出法において、被検体または被検体から得られた検査試料と呈色標識抗MPB64蛋白抗体とを予め混合した混合液をクロマト法テストストリップによりクロマト展開せしめてもよいし、また、クロマト法テストストリップに予め試料添加用部材および呈色標識抗体含浸部材をそれぞれ設け、該試料添加用部材に所定量の被検体または被検体から得られた検査試料を灌注してクロマト展開を行なう上記の方法によってもよい。
本発明の結核菌検出方法において、MPT64蛋白またはMPB64蛋白と呈色標識抗MPB64蛋白抗体との間の免疫反応ならびにこの免疫反応で生成せしめられた呈色結合物と第二抗MPB64蛋白抗体との間の免疫反応はいずれも数分で完結せしめられるので、検査自体は長くても15分程度で終了する。
(1) BCG菌東京株の培養
BCG菌東京株は結核予防会結核研究所から入手し、それを下記の組成を有するソートン培地500ml×20本に接種し、37℃で5週間培養して、培養液10lを得た。
アスパラギン 0.4 %
くえん酸 0.2 %
くえん酸ナトリウム 0.28 %
りん酸カリウム 0.05 %
硫酸マグネシウム 0.05 %
くえん酸第1鉄アンモニウム 0.005%
グリセリン 6 %
(「%」は「重量/容量%」を示す。以下同様)
1)上記(1)で得られた培養液に硫酸アンモニウム(以下、硫安 と記す)を加えて80%飽和溶液として、沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得られたこの蛋白質画分を30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.7)に溶解せしめ、10℃で30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.7)に対して透析して蛋白質約9gを含有する透析液約30mlを得た。
2)この蛋白質約9gを含有する上記の溶液約30mlをDEAE・セファデックスA・50(ファルマシア バイオテク株式会社の商品)カラム(57cm×5.5cm)にチャージして、30mMトリス塩酸溶緩衝液(pH8.7)100mlを用いて上記のカラムを洗浄して溶出液を得た。
次いで、30mMトリス塩酸緩衝液(pH 8.7)および30mMトリス塩酸緩衝・200mM塩化ナトリウム溶液(pH8.7)を用いて塩化ナトリウム濃度0から200mMまでの濃度勾配法によりクロマト展開し、その展開液を20mlずつのフラクションとして採取した。フラクション番号105番から121番までの展開液を集めた。この展開液に硫安を加えて70%飽和溶液として沈殿せしめられた蛋白質画分を遠心分離して得た。この蛋白質画分を30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.7)に溶解せしめて、10℃で30mMトリス塩酸緩衝液(pH 8.7)に対して透析して蛋白質約0.7gを含有する透析液約7mlを得た。
(1) MPB64蛋白投与マウス(BALB/C系)の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(P3U1)との細胞融合
1)上記1.で得られた精製MPB64蛋白を用いて、ケラー−ミルシュタインの方法(G.Kohker and C.Milstein;Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976)にしたがって細胞融合を行ないハイブリドーマを調製した。
さらに、その2週間後に精製MPB64蛋白の生理食塩水溶液(200μg/ml)を上記のマウス腹腔内に投与して最終免疫を行なった。
一方、抗体を産生しているウエル中のハイブリドーマについては、限界希釈法によるクローニング操作を3回繰り返し行なった。
その結果、抗MPB64蛋白抗体を安定に産生するクローン化細胞5株を得た。
1週間前に1匹あたり2,6,10,14−テトラメチルペンタンデカン0.5mlを腹腔内に注射されたBALB/C系マウスの腹腔内に上記のクローン化細胞株のうち抗MPB64蛋白抗体の生産量が特に多いクローン化細胞懸濁液(107個/ml)0.5mlを注射し、その1週間後に抗MPB64蛋白抗体を含む腹水を該マウス1匹あたり5〜10ml得た。
(1) 金ゾルの調製
99mlの超純水を沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸(片山化学工業株式会社の商品)溶液(塩化金酸濃度1%)1mlを加え、さらにその1分後に、くえん酸ナトリウム溶液(くえん酸ナトリウム濃度1%)1.5mlを加えて5分間沸騰させて後に、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液を200mM炭酸カリウム溶液でpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金ゾルを得た。
上記2.で得られた抗MPB64蛋白マウス単クローン抗体の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単にその重量の数値のみを示す )と上記の金ゾル1mlとを混合し、室温で2分間静置して、この抗体のことごとくを金ゾルの分散粒子であるコロイド粒子と結合させた。これに最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン(以下、BSA と記す)水溶液を加えて上記の抗体に結合せしめられた金コロイド粒子の表面をブロックした。この溶液を遠心分離(5,600×G、30分間)して抗MPB64蛋白マウス単クローン抗体を結合したコロイド粒子の表面がBSAでブロックされた金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。
この金コロイド標識抗体を、10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン(Triton)−X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH 7.4)に再懸濁して精製金コロイド標識抗体溶液を得た。
上記2.で得られた抗MPB64蛋白マウス単クローン抗体0.25mgと10%青色ラテックス(粒径0.2μm、日本ペイント株式会社の商品)溶液を精製水で希釈して得られた1%青色ラテックス溶液1mlとを混合し、室温で30分間静置して抗MPB64蛋白マウス単クローン抗体を青色ラテックスに結合させた後、遠心分離(5,000×G、30分間)して青色ラテックスに結合せしめられた抗MPB64蛋白マウス単クローン抗体である粗青色ラテックス標識抗体を沈殿せしめて集めた。この粗青色ラテックス標識抗体を1%BSA溶液および0.85%塩化ナトリウム溶液を含有する10mMりん酸塩緩衝液(pH7.4)1mlに再分散し、遠心分離(5,000×G、30分間)するという操作を3回繰り返した。このように処理された青色ラテックス標識抗体を1%BSAおよび0.85%塩化ナトリウム溶液が含有されてなる10mMりん酸塩緩衝液(pH7.4 )20mlに分散せしめて、固形分約0.05%の精製青色ラテックス標識抗体溶液を得た。
(1) 特公平7−13640号公報の記載に準拠してクロマト法テストストリップを作成した。
すなわち、幅5mm,長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜(メンブレンフィルター)をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体とし、このクロマト展開始点とは逆方向末端から7.5mmの位置に、第二抗MPB64蛋白抗体3.0mg/mlが含有されてなる抗体溶液0.5μlをスポット状に塗布して、これを室温で乾燥して補足部位とした。なお、第二抗MPB64蛋白抗体とは免疫反応において、抗原であるMPT64蛋白またはMPB64蛋白に対する結合部位が、上記3.の金コロイド標識抗体または青色ラテックス標識抗体の調製に使用された抗体とは異なる結合特異性を有する抗体をいう。
(3) また、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に上記の青色金ラテックス標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて青色ラテックス標識抗体含浸部材とした。
さらに、ニトロセルロース膜の他方の端には、吸収用部材の一部を重ねて配列せしめてクロマト法ストリップとした。
(1) 判定基準の作成
1)精製MPB64蛋白を生理食塩水で希釈し、MPB64蛋白の濃度がそれぞれ0.25ng/ml,0.5ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml,4.0ng/ml,8.0ng/mlおよび16.0ng/mlからなる溶液とし、これらのMPB64蛋白溶液を標準試料とした。これらの標準試料を用いて、上記のクロマト法テストストリップによる検定およびRPHA法による検定を行ない、得られた両者の結果からMPB64蛋白濃度に対する両者の方法の検出感度について比較した。
すなわち、グルタールアルデヒド固定ヒツジ赤血球の0.5%10mMりん酸塩緩衝懸濁液1容量部と、1mgのタンニン(米国NBC社)を生理食塩水100mlに溶解せしめた溶液1容量部とを混合し、室温で15分間放置した後、タンニン処理赤血球を遠心分離し、タンニン処理赤血球を生理食塩水で3回洗浄した後に、1容量部になるように生理食塩水に懸濁せしめて0.5%タンニン赤血球生理食塩水溶液を得た。
なお、捕捉部位における赤紫色の着色の有無および着色の濃淡は、被検体中の結核菌の有無および結核菌の大凡の菌数を表わしていることはいうまでもない。
表1に示されるように、本発明の結核菌検出法はRPHA法に比して感度が高く、しかも半定量性があることが判る。
1)ヒトの喀痰を結核症被検体(8例)とし、該被検体からの結核菌の検出を検討した。
すなわち、被検体5mlと、5mlの2%水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で30分間静置した後、遠心分離(1,500×G、30分間)して生じた沈渣を回収し、この沈渣と生理食塩水とを混合し、この混合液を遠心分離(1,500×G、30分間)して生じた沈渣を再び回収し、この沈渣と生理食塩水200μlとを混合して、これを検査試料とした。
なお、培養開始7日目の培養液については、RPHA法のみによる結核菌の検出を行なった。
この抽出液から200μlを採取し、これと4容量%アニリン・エタノール溶液100μlおよび10容量%ブロムシアン溶液とを混合した。混合してから5分後に、この混合液に結核菌に由来したナイアシンが存在すれば、混合液は黄色に発色するので、肉眼で判定して黄色に発色すれば、その被検体を陽性(+)とした。
表2にこれらの検査結果を示す。
1) レントゲン診断による結核症疑罹患患者8名のそれぞれの喀痰における結核菌についての検査を行なった。
すなわち、上記の各喀痰と、これと等量の2%水酸化ナトリウム水溶液とを混合し、この混合液を室温で30分間静置し、これを培養試料とした。
なお、比較のために上記の各試料について、培養期間を56日間とした以外は上記と同様に培養して増殖せしめた結核菌に関して上記と同様にしてナイアシン産生試験を行なった。
これらの結果を表3に示す。
すなわち、図1はクロマト法テストストリップを示し、aは平面図、bはaで示されたクロマト法テストストリップの縦断部端面図である。
しかして、図2は図1で示されたクロマト法テストストリップを収納するためのケースを示し、aは平面図、bはaで示されたケースの縦断部端面図である。
なお、図面は原理を示すためのものであり、寸法などは正確には示されていない。
これらの粘着シート 1、呈色標識抗体含浸部材 2、クロマト展開用膜担体 3、吸収用部材 4および試料添加用部材5はいずれも細長い長方形で帯状とされている。クロマト展開用膜担体 3はクロマト展開に際してそれ自体の毛細管作用により、試料添加用部材 5にスポット状にチャージされた被検体およびその他の各種試料をクロマト展開方向である下流側に自動的に移動せしめ得る材質を有するものであればよい。
ケース 6は、容器本体61と蓋体62とからなっている。
蓋体62の上面には上記のクロマト法テストストリップの試料添加用部材 5およびクロマト展開用膜担体 3の捕捉部31のそれぞれに対応する位置に、それぞれ、試料注入口621および判定孔622が穿設されている。
本発明は簡便な方法で、かつ、短時間で、しかも、安全に、高い精度で結核菌の存否を判定することができ、さらに、試料中に存在する結核菌の菌数をも半定量することが可能となる。
2 呈色標識抗体含浸部材
3 クロマト展開用膜担体
31 捕捉部
4 吸収用部材
5 試料添加用部材
6 ケース
61 容器本体
62 蓋体
621 試料注入口
622 判定孔
Claims (9)
- 被検体を液体培養して得られた培養液と、呈色標識抗MPB64蛋白抗体とを混合し、次いで、第二抗MPB64蛋白抗体を含浸させて形成された捕捉部位を備えてなるクロマト展開用膜担体に、この混合液をクロマト展開せしめ、MPT64蛋白またはMPB64蛋白と呈色標識抗MPB64蛋白抗体との結合物の前記捕捉部位での捕捉の呈色の有無により、ヒト型結核菌またはウシ型結核菌の有無を判断することからなり、前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする結核菌検出方法。
- 前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体において、抗MPB64蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項1記載の結核菌検出法。
- 前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体において、抗MPB64蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項1記載の結核菌検出法。
- 前記第二抗MPB64蛋白抗体は前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項1〜3の何れか1項に記載の結核菌検出法。
- 少なくとも、試料添加用部材5、呈色標識抗体含浸部材2、クロマト展開用膜担体3および吸収用部材4を有し、上記部材2および担体3には前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体および第二抗MPB64蛋白抗体がそれぞれ含浸されており、上記部材5は部材2に積層され、上記担体3はその上流側端部が上記部材2に被覆されるとともに該部材2に連接され、上記部材4はその上流側端部が上記担体3に積層されるとともに該担体3と連接してなるクロマト法テストストリップを用い、前記液体培養して得られた培養液を前記試料添加用部材に灌注することによって行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体において、抗MPB64蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質がコロイド状金属である請求項5記載の方法。
- 前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体において、抗MPB64蛋白抗体に結合せしめられる呈色標識物質が着色ラテックスである請求項5記載の方法。
- 前記第二抗MPB64蛋白抗体は前記呈色標識抗MPB64蛋白抗体と異なる部位で抗原抗体反応するものである請求項5〜7の何れか1項に記載の方法。
- 前記クロマト法テストストリップがケースに収容されてなる請求項5〜8の何れか1項に記載の方法。
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